Imunologia

Oral ⏐ISCSEM

Realização de um ensaio ELISA para detecção de anticorpos

específicos do agente patogénico

Base do ELISA

Anticorpo Secundário acoplado a uma enzima

(Anti-IgG)

Anticorpo primário presente ou não na nossa

amostra que será específico para o antigénio

Antigénio específico contra o qual queremos

detectar
os anticorpo

Material por grupo:

§ Pipetas descartáveis (imagem indica as medições correspondentes a
cada traço)

§ 2 linhas de placa de Elisa (grupos de 4: 2estudantes para cada linha;

grupos de 3: 1 linha)

§ Micropipetas P100 e pontas amarelas

§ Gobelet com tampão de lavagem – retirar cerca de 30ml de tampão de

lavagem (do frasco) para o gobelet de cada grupo

§ Papel

§ Marcador

Reagentes por grupo:

§ Tubos amarelos: Amostras desconhecidas de soro (para testar a

presença de anticorpo)

cada grupo de 4 - retira 4 tubos,

 Imunologia Oral ⏐ISCSEM

cada grupo de 3 - retira 2 tubos

§ Tubo roxo: controlo positivo (soro de um paciente HIV negativo

adicionado de Anticorpos contra HIV) – um tubo de controlo
positivo/grupo

§ Tubo azul: controlo negativo ( Soro de um paciente HIV negativo) - um

tubo de controlo negativo/grupo

§ Tubo verde: antigénio (proteínas HIV) – um tubo / grupo

§ Tubo laranja: Anticorpo secundário (Anticorpo anti-imunoglobulina

humana, conjugado com HRP) - um tubo / grupo

§ Tubo castanho: Substrato TMB - um tubo / grupo

Procedimento:
1. Na figura que se segue encontra-se o esquema da linha de placa de
Elisa (cada grupo de 4 terá direito a 2 linhas, cada grupo de 3 fica com
apenas 1) – marcar os respectivos poços para durante o procedimento
não trocarem de direção, podem usar as vossas iniciais para marcar
as vossas amostras.
Nota: FN e AF são iniciais dos nomes (por exemplo dos alunos).

2. Tranferir 50µl do antigénio purificado (tubo verde) para todos os

poços, usando a p100. Incubar 5 minutos no mínimo (deixar repousar
em cima da bancada para que o antigénio se ligue à superfície sólida).

3. Lavagem: Retirar o antigénio em excesso dos poços:

a. Virar os poços para baixo ensopado

contra papel de modo a
ensopar o excesso de
antigénio, e bater algumas
vezes contra o papel para
remover bem todo o excesso;

b. Deitar fora o papel

 Imunologia Oral ⏐ISCSEM

c. Encher as pipetas de plástico fornecidas com tampão de lavagem e

distribuir pelos poços (cerca de 200µl), sem deixar que estes
transbordem (para evitar contaminações entre poços). Guardar a pipeta
para as restantes lavagens.

d. Deitar fora o tampão de lavagem da mesma forma contra o papel,

bater contra o papel com força para remover todo o excesso. (nos
procedimentos normais as lavagens chegam a ser feitas 3 a 5 vezes

entre cada passo).

e. Verificar que os poços estão bem secos

4. Transferir 50µl do controlo positivo (+), controlo negativo (-) e amostras de

acordo com o esquema

a. Use uma ponta nova para os 3 primeiros poços – controlo + (tubo

roxo)
b. Com uma ponta nova distribua nos poços 4,5,6 o controlo – (tubo
azul)
c. Distribuir as amostras de cada estudante nos respectivos poços (uma
ponta diferente para cada amostra) – (tubos amarelos)
Incubar 5 minutos no mínimo para dar tempo aos anticorpos da amostra (se
existirem) para se ligarem aos antigénios.

5. Lavagem: proceder como em 3 (para remover o anticorpo que não se ligou

– em excesso ou inespecíficos).

6. Usar uma nova ponta para distribuir o 50µl anticorpo secundário com
enzima (tubo laranja) por todos os poços. Incubar 5 minutos para que o
anticorpo secundário se ligue ao anticorpo da amostra.

7. Lavar todos os poços como anteriormente (para remover o anticorpo

secundário em excesso). Repita o processo de lavagem 2 vezes.

8. Utilizar uma nova ponta para distribuir 50µl de solução de substrato TMB
 Imunologia Oral ⏐ISCSEM

(tubo castanho) por cada poço.

Esperar 5 minutos. Verificar se os poços que se esperavam que fossem

positivos, estão azuis?

9. Registar os resultados

10.Vamos até ao leitor de placas conhecer o aparelho que nos permite ler a
densidade ótica dos ELISAS.