Microbiologia

Mtodo do Nmero Mais Provvel

Introduo O mtodo do NMP permite calcular o nmero de um microorganismo especfico numa amostra de gua, utilizando tabelas de probabilidade. Diluies decimais da amostra so inoculadas em sries de tubos contendo meio lquido selectivo. Os tubos so positivos quando tm crescimento e/ou produo de gs de fermentao. A densidade bacteriana determinada pela combinao de resultados positivos e negativos numa tabela designada por tabela do NMP. Este mtodo constitudo por trs testes: - Teste Presuntivo - Teste Confirmativo - Teste Completo. O Teste Presuntivo fornece uma estimativa preliminar da densidade do grupo bacteriano baseada no enriquecimento em meio minimamente restritivo. Os resultados deste teste no podem ser usados sem confirmao posterior. O Teste Confirmativo a segunda fase do NMP. Os tubos considerados positivos no teste anterior so inoculados em tubos de meio mais selectivo e inibidor. As reaces positivas so lidas e a densidade calculada com a ajuda da tabela NMP. O Teste Completo a terceira etapa. utilizada apenas na determinao do nmero de coliformes totais. Os tubos positivos do teste anterior so submetidos a testes adicionais para isolamento e identificao dos microorganismos. Devido morosidade deste teste, ele no normalmente utilizado.

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Definio dos grupos indicadores de contaminao Coliformes - Este grupo tambm designado por coliformes totais inclui todas as bactrias Gram negativas, aerbias facultativas, capazes de fermentar lactose, com produo de gs, em 24-48 h a 35 C. A definio inclui os gneros: Escherichia, Citrobacter, Enterobacter e Klebsiella. Coliformes fecais - So parte do grupo dos coliformes totais e incluem bactrias Gram negativas, facultivas e que podem fermentar lactose em 24 h a 44,5 C, com produo de gs. Este grupo constitudo quase exclusivamente pela espcie Escherichia coli, espcie indicativa de poluio fecal e portanto da possvel presena de espcies entricas patognicas. "Streptococus" fecais - Este grupo inclui os estreptococos que indicam a qualidade sanitria da gua e incluem as seguintes espcies: S. faecalis, S. faecium, S. bovis, S. equinus e S. avium. Material Amostra de gua Tubos de LTB (Lauril Triptose Broth) (2X) com tubos invertidos Tubos de LTB (1X) com tubos invertidos Tubos de AD (Azida Dextrose) (2X) com tubos invertidos Tubos de AD (1X) com tubos invertidos Tubos de BGLB (Brilliant Green Lactose Bile Broth) com tubos invertidos Tubos de EC (Escherichia coli) com tubos invertidos Caixas de BEA (Biles Esculina Agar) Anas de inoculao Incubadora a 37C Banho a 44,5C

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Culturas de controlo Tubos de diluio com tampo Mtodo Teste Presuntivo - Para este teste, organizar 5 sries de 5 tubos de meio de cultura selectivo (LTB e AD). A primeira srie deve ser de meio concentrado 2X. - Agitar a amostra vigorosamente. - Fazer diluies decimais seriadas da amostra: retirar 1ml de amostra e colocar em 9ml de tampo; agitar; retirar 1ml da diluio anterior e colocar em 9ml de tampo agitar. Repetir at atingir a diluio desejada que neste caso de 10-3. - Inocular cada srie de 5 tubos com diluies decimais decrescentes, da amostra: inocular na 1 srie 10ml de amostra; inocular na 2 srie 1ml de amostra; inocular na 3 srie 0.1ml de amostra; inocular na 4 srie 0.01ml de amostra; inocular na 5 srie 0.001ml de amostra; - Incubar os tubos 24 horas a 37C. - Ler os resultados. So positivos os tubos de LTB que contiverem gs. So positivos os tubos de AD que tiverem crescimento. Os tubos positivos devem ser imediatamente confirmados no Teste Confirmativo. Os tubos negativos so reincubados mais 24 horas. - Ler os resultados aps o 2 perodo de incubao. Se houver novos tubos positivos eles so tambm confirmados no Teste Confirmativo.

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Teste Confirmativo Confirmao de coliformes totais -Inocular cada tubo positivo de LTB em meio de BGLB. -Incubar os tubos de BGLB a 37C por um perodo de 24horas. -Ler os resultados. So positivos os tubos que contiverem gs. Os tubos negativos aps este primeiro perodo de incubao so reincubados mais 24 horas. -Tomar nota do total de tubos positivos aps os dois perodos de incubao. Confirmao de coliformes fecais - Inocular cada um dos tubos positivos de LTB em meio de EC. - Incubar os tubos de EC 24 horas a 44.5C. - Ler os resultados. So positivos os tubos que contiverem gs. - Tomar nota do total de tubos positivos. Confirmao de Streptococcus fecais -Inocular caixas de Petri com meio de BEA a partir de cada um dos tubos positivos. -Incubar 24 horas a 37C. -Ler os resultados. So positivos sempre que houver produo de pigmento negro. Reincubar as caixas negativas por mais 24horas. -No final dos dois perodos de incubao, tomar nota do total de caixas positivas.

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Clculo do valor do NMP -O clculo da densidade de bactrias do grupo testado baseado no nmero de tubos positivos de cada diluio, no Teste Confirmativo ( ou Completo). O resultado dado com limite de 95% de confidncia. -So necessrias 3 diluies para formular o cdigo que permite a leitura na tabela do NMP. -O nmero de cdigo tem 3 dgitos, sendo cada um, o nmero total de tubos positivos em cada diluio e por ordem decrescente de volume de inculo. -Quando as sries de diluies decimais so diferentes de 10, 1 e 0.1ml de amostra (diluies para as quais a tabela est elaborada), o valor do NMP calculado pela frmula: NMP= NMP da tabela X __________10_______ maior quantidade testada -Se foram testados mais de trs volumes de amostra, determinam-se as trs diluies mais significativas de acordo com as regras do NPM.