Contagem de coliformes totais e

coliformes termotolerantes em alimentos

Profa Leila Larisa Medeiros Marques
Definio
COLIFORMES TOTAIS: grupo de bactrias constitudo por
bacilos gram-negativos, aerbios ou anaerbios facultativos, no
formadores de esporos, oxidase-negativos, capazes de crescer na
presena de sais biliares e que fermentam a lactose com produo
de aldedo, cido e gs a 35C em 24-48 horas. O grupo inclui os
seguintes gneros: Escherichia, Citrobacter, Enterobacter e Klebsiella.

COLIFORMES FECAIS OU COLIFORMES

TERMOTOLERANTES: so coliformes capazes de se
desenvolver e fermentar a lactose com produo de cido e gs
temperatura de 44,5 0,2C em 24 horas. O principal
componente deste grupo Escherichia coli, sendo que alguns
coliformes do gnero Klebsiella e Citrobacter tambm apresentam
essa capacidade.
Definio
Coliformes- significado em alimentos
Totais: Utilizado para avaliar as condies higinicas,
sendo que altas contagens significam contaminao ps-
processamento, limpezas e sanificaes deficientes,
tratamento trmicos ineficientes ou multiplicao durante o
processamento ou estocagem.
Termotolerantes: empregado como indicador de
contaminao fecal, ou seja, de condies higinico-
sanitrias, visto presumir-se que a populao deste grupo
constituda de uma alta proporo de E. coli, que tem seu
habitat no trato intestinal do homem e de outro animais.
Alm de indicar possibilidade de presena de outros
patgenos entricos.
 Tcnicas

Plaqueamento (slido): aplica-se a amostras de matrias-

primas, alimentos e raes, devendo ser utilizada quando o limite
mximo tolerado 100 UFC/g ou mL.

NMP (lquido) em alimentos: aplica-se a amostras de matrias-

primas e alimentos, devendo ser utilizada quando o limite
mximo tolerado for inferior a 100 UFC/g ou mL.

NMP (lquido) em gua e gelo: Aplica-se a amostras de gua e

de gelo usados em estabelecimentos produtores de alimentos. O
valor obtido em NMP/100mL.
 Pesquisa de coliformes: mtodo em placas.
Amostra: acar cristal, morango, coxinha, hambrguer ,
bolacha recheada e amendoim cru

Tcnica: Contagem em placas, Plaqueamento

em profundidade, plaqueamento sobrecamada
ou pour plate
 gar cristal violeta (VRBA)
sais biliares e cristal violeta que inibem Gram+;
Vermelho neutro (indicador)- revela a fermentao da lactose.

Caldo verde brilhante bile 2% lactose

Bile bovina e corante verde brilhante que inibem Gram+.

Caldo EC
Sais biliares inibem Gram+;
Mistura de fosfatos impedem a acidificao do meio.

gar eosina azul de metileno (EMB)

Eosina e azul de metileno so corantes inibidores de Gram +. Com a
fermentao da lactose e produo de cido, ocorre precipitao desses corantes
que fornecem o brilho verde metlico caracterstico da E. coli.
IN 62, 2003

Ler captulo VI
 Plaqueamento sobrecamada

15 mL

Em posio invertida

Prova presuntiva
Selecionar 3 colnias tpicas e
para coliformes totais 3 atpicas para investigar

Prova confirmativa Cada colnia para um caldo verde brilhante

para coliformes totais

Prova confirmativa Para cada tubo positivo no caldo

verde brilhante passar para um
para coliformes
45C/24 a 48h
tubo de caldo EC
termotolerantes
Colnias em VRBA e Caldo EC
Colnias tpicas e atpicas
Caracterizao da E. coli
De cada tubo EC positivo
 Expresso dos resultados
R =(C x c x d)/r
R = Resultado
C = nmero de colnias contadas Ateno!!!
c = nmero de colnias confirmadas Ser um clculo para coliformes
totais, outro para coliformes
r = nmero de colnias repicadas termotolerantes e outro para E. coli!!!!
d = diluio utilizada

Resultado final= Rt (colnias tpicas) + Ra (colnias atpicas)

 Exemplo de resultado parcial
Diluio 10-2 = 30 colnias contadas, das quais 20 eram tpicas e 10 atpicas.

Para confirmao de coliformes a 35C, foram repicadas 5 colnias de cada tipo.

Quatro colnias tpicas e duas atpicas apresentaram resultado positivo nos testes confirmativos.
Aplicando-se a frmula, teremos para colnias tpicas:
RT = ?

Aplicando-se a frmula, teremos para colnias atpicas:

RA = ?

O resultado final ser igual soma das colnias tpicas e atpicas confirmadas:

Resultado final = RT + RA = ????????????? UFC/g ou mL de coliformes a 35C..

 Exemplo de resultado parcial
Diluio 10-2 = 30 colnias contadas, das quais 20 eram tpicas e 10 atpicas.

Para confirmao de coliformes a 35C, foram repicadas 5 colnias de cada tipo.

Quatro colnias tpicas e duas atpicas apresentaram resultado positivo nos testes confirmativos.
Aplicando-se a frmula, teremos para colnias tpicas:
RT = 20 x 4 x 100/5 = 1.600

Aplicando-se a frmula, teremos para colnias atpicas:

RA = 10 x 2 x 100/5 = 400

O resultado final ser igual soma das colnias tpicas e atpicas confirmadas:

Resultado final = RT + RA = 1600 + 400 = 2000 = 2,0 x 103 UFC/g ou mL de coliformes a

35C.
 Exerccio
1. Na placa de VRBA e diluio 10-2 = 20 colnias contadas, das quais 15 eram tpicas e
5 atpicas; Para confirmao, foram repicadas 3 colnias de cada tipo para tubos
verde brilhante e depois para tubos EC;
2. Todos os tubos de caldo verde brilhante repicados deram positivos para a
confirmao de coliformes totais;
3. Para confirmao de coliformes termotolerantes, obtiveram-se dos 3 tubos
repicados de colnias tpicas, 2 positivos; e das 3 atpicas repicadas, 1 positiva.
4. Na pesquisa de E. coli, dos 3 tubos EC repicados (tanto de tpicas quanto atpicas), 1
placa EMB tpico deu positivo e 1 atpico positivo para E. coli.

Diante destes resultados, pergunta-se:

1. Qual o valor para coliformes a 35C?
2. Qual o valor para coliformes a 45C?
3. Qual o valor de E. coli/mL?
 Pesquisa de coliformes:
Nmero mais provvel (NMP)
Amostra: leite em p, leite pasteurizado, gua, acar refinado,
leite fermentado, conserva de vegetais
NMP
Tcnica do nmero mais provvel ou tcnica dos tubos mltiplos-
estimativa da quantidade de MO presentes na amostra;
Pelo nmero de tubos positivos em cada uma das diluies
empregada determina-se o Nmero Mais Provvel por grama de
produto, tendo como base a tabela estatstica de Hoskins para trs,
cinco ou dez tubos;
Por esta tcnica pode-se obter informaes sobre a populao
presuntiva de coliformes (teste presuntivo), sobre a
populao real de coliformes (teste confirmativo) e sobre
a populao de coliformes de origem fecal (coliformes
termotolerantes)
NMP
a) Teste presuntivo para coliformes totais visa detectar a
presena de microrganismos fermentadores de lactose. Meio
utilizado: caldo lauril sulfato triptose. Princpio: turvamento
e produo de gs, evidenciado pelo tubo de Durham.
b) Teste confirmativo para coliformes totais-meio caldo
verde brilhante lactose Bile 2%. Princpio: turvamento e produo
de gs por bactrias gram negativas, caractersticas do grupo
coliforme.
c)Teste confirmativo para coliformes termotolerantes-
utilizao do meio de cultura seletivo Caldo EC e incubao em
44-45C. Princpio: turvamento e produo de gs, evidenciado
pelo tubo de Durham.
c) Teste completo para pesquisa de E. coli - provas
bioqumicas.
Poder tamponante

Inibem
Gram+

Inibe
Gram+
Inibe Gram+
IN 62, 2003

Ler captulo X e
grupo da gua
captulo IX
 10-1 10-1

222 10-2

00222
10 mL 1 mL 1 mL

1 srie em [ ] dupla do meio

NMP
srie 3 tubos De cada tubo positivo:
(alimentos
slidos)

Para cada EC+, um EMB

2 colnias caract. de cada

EMB em tubo de AN
 100
10-1 10-2

NMP
De cada tubo positivo:
srie 3
tubos
(produtos
lquidos)
Para cada EC+, um EMB

2 colnias caract. de cada

EMB em tubo de AN
De cada tubo AN
Exemplo
Tubos positivos
10-1
3

10-2
3

1
10-3
Tcnica de
esgotamento
por estrias
Tcnica de esgotamento por estrias
Em todos os tubos e placas
de TODAS as etapas,
identificar o nmero da
equipe, o nome da amostra e
o mais importante a
DILUIO que est ou a
DILUIO precedente !!!!!
Combinao tubos positivos 3:3:1 = 460 UFC/g ou mL, com
95% probabilidade de estar entre 90 e 2000 UFC/g ou mL
 A tabela a ser consultada dever ser a que oferece resultados de NMP
para inculos de 0,1, 0,01 e 0,001 g ou mL.

OBS: Para obter o NMP/g ou mL, para sries de 3 tubos, com inculos de 1,0, 0,1 e 0,01
g ou mL, e respectivos intervalos de confiana 95%, dividir por 10 os valores da Tabela
1 correspondente ao arranjo de tubos positivos obtido na anlise.
 NMP- gua e gelo

Quando o limite de aceitao for <2,0/100mL, usar srie de

5 tubos.

Quando o limite de aceitao for <1,0/100mL, usar srie de

10 tubos.
De cada tubo positivo:
De cada tubo positivo:
 Padres microbilgicos
Produto Tolerncia Tolerncia para Legislao Tcnica a ser
para amostra amostra indicativa utilizada
indicativa Coliformes
Coliformes Termotolerantes ou
Totais ou a a 45C
35C

gua para Ausncia em Ausncia em 100mL Portaria 518, NMP srie de 10

consumo humano 100mL 2004 tubos

Leite 4NMP/mL 2NMP/mL IN 62, 2011 NMP srie de 3

pasteurizado tubos- amostra pura

Leite em p - 10NMP/g RDC 12, 2001 NMP srie 3 tubos-

amostra diluda
(10mL na primeira
diluio)
Acar cristal - 102UFC/g RDC 12, 2001 Plaqueamento
Fonte: MADIGAN; MARTINKO; PARKER, 2004
 Orientaes: Prova prtica de bolores e leveduras
1. Imprimir roteiro de prova;
2. Estudar o roteiro, dvidas tirar no horrio de PA ou em sala, se der tempo;
3. Cuidar com tcnica e diluio.
4. Trazer os materiais abaixo para prova:

Equipe 1 Equipe 2 Equipe 3 Equipe 4 Equipe 5 Equipe 6

Alimentos para
imunosuprimidos,
Gelia de
Doce em Doce de excludos os que
fruta no Papinha Queijo
AMOSTRAS calda no abbora a sero consumidos
com. de fruta ralado
com. estril granel aps adio de
estril
lquido, com
emprego de calor
RDC 12, RDC 12,
RDC 12, RDC 12, Port. RDC 12, 2001
Legislao 2001 2001
2001 2001 357/97

Padro ? ?
? ? ? ?
microbiolgico
Testes bioqumicos para coliformes-
identificao da E. coli
1. Prova do Indol;
2. Vermelho de metila-VM;
3. Voges-Proskauer-VP;
4. Citrato.
Escherichia coli
um indicador de contaminao fecal.

A presena de nmero considervel indica:

- Processamento trmico inadequado;
- Recontaminao aps processamento;
- Proliferao microbiana no alimentos que ir permitir a
possvel multiplicao de MO patognicos.
 1. Prova do Indol
Triptofano triptofanase Indol + cido pirvico + amnia
desaminao

+ p-dimetilaminobenzaldedo +HCl + lcool (reativo de Kovacs)

Composto quinoidal (vermelho)

CH2 do anel pirrlico da molcula do indol + o aldedo

em meio cido= quinona
 2. Vermelho de metila-VM

cido lctico
cido actico
Glicose fermentao cido frmico
cido mista cido succnico
cido etlico
INDICADOR:
Vermelho de metila escala de 4,4 a 6,0.
pH 4,4 cor vermelha - prova positiva
pH 6,0 cor amarela (acetona) - prova negativa
 3. Voges-Proskauer-VP
Glicose
Fermentao
butilenoglicol
2 c. pirvico
Agente
descarboxilao oxidante

Acetilmetilcarbinol + -naftol +KOH 40% Diacetila

(acetona)
Catalisador

Diacetila + ncleo guanidina do -naftol condensao Composto

Vermelho

OBS .: cor cobre resultado negativo

 4. Citrato Indicador de pH: azul de bromotimol
pH 8,4=colorao azul-da-prssia
pH 6,9= colorao verde
pH 6,0= colorao amarela
ciclo de Krebs ;

Citrato citratase
ciclo da fermentao do citrato

Citrato piruvato + CO2

CO2 + sdio carbonato de sdio

Amnia como
pH
alto
fonte de N
Resultado das provas bioqumicas da E. coli

Resultado das
provas
bioqumicas
demais
bactrias