AULA: MÉTODOS ANÁLISES MICROBIOLÓGICAS DE ALIMENTOS – Parte 2

Contagem de Coliformes Totais, Termotolerantes e E. coli

Coliformes Totais
O grupo coliformes compreende todas as bactérias anaeróbias facultativas, G(-), não formadoras de esporos,
com capacidade para fermentar a lactose com produção de gás a 32-35°C durante 48hs.
Sub grupo da família Enterobacteriacea
Pertencem a esse grupo: +20 espécies (Escherichia, Citrobacter, Enterobacter e Klebisiela).
Números elevados de coliformes indicam falhas pós-processamento, limpeza e sanitização deficientes e
tratamento térmico ineficiente ou multiplicação no procesamento/armazenamento.

Coliformes Termotolerantes ou C45

Capacidade para fermentar a lactose com produção de gás a 44,5-45,5°C durante 24hs.
Finalidade: Primeiramente, coliformes de origem gastrointestinal. Porém, atualmente sabe-se que alguns
gêneros (Enterobacter, Klebisiela, p.ex) são de origem não-fecal ➔ Presença em alimentos é menos
representativa como indicação de contaminação fecal do que a enumeração de E. coli, porém, muito mais
significativa do que a presença de CT, dada a incidência de E. coli dentro desse grupo.

Técnica do Número Mais Provável (NMP) Técnica de Contagem de Colônias

ISO 4831:2012 IN 30/2018 Brasil (2018)
Aplicável quando o número procurado estiver na Aplicável a amostras de matérias-primas,
faixa de 1 a 100 NMP/g ou mL. alimentos e rações, devendo ser utilizada quando
produtos destinados ao consumo humano e para a o limite máximo tolerado for ≥ 100 UFC/g ou mL.
alimentação de animais e amostras ambientais na
área de produção de alimentos e manipulação de
alimentos.

Técnica NMP
Método estatístico para obter um resultado quantitativo, tomando-se concentrações diferentes da amostra
e verificando-se o resultado positivo e negativo para cada diluição;
Estimativa da concentração celular, densidade celular;
Combinação de resultados = tabela estatística;
Mais indicado para baixa carga microbiana (<100 UFC/g), mas não somente;
Leitura: turbidez + formação de gás.

Teste Presuntivo: visa detectar a presença de m.o. fermentadores da lactose, especialmente do grupo
coliformes. Células estressadas por tratamentos térmicos, congelamento ou outro motivo podem ser
recuperadas nessa fase.
Princípio: Lauril Sulfato Triptose (LST) ➔ meio rico em nutrientes, facilitando o rápido crescimento dos
m.o. e inibe consideravelmente crescimento da flora acompanhante. Fonte de carbono = lactose, a qual é
fermentada com produção de ácido e gás.

Teste Confirmativo:
Coliformes Totais:
Princípio: Caldo Verde Brilhante Lactose Bile (2%) contém 2 inibidores (Bile e Verde Brilhante) do
crescimento da flora acompanhante (bactérias G+) e lactose como único substrato.
Produção de gás nos tubos à 35ºC/24-48 hs ➔ crescimento de G(-) fermentadoras da lactose.
Coliformes Termotolerantes ou C45:
Princípio: Caldo EC e incubação de 44,5±1ºC/24 hs. Produção de gás no interior dos tubos.
Para expressar o resultado:

Exemplo:
Para Determinação de E. coli = continuação a partir dos tubos positivos na determinação de Coliformes
Termotolerantes.

Crescimento típico de E. coli em Ágar EMB = colônias nucleadas com centro preto e brilho verde
metálico.
Contagem de Coliformes
Indicado para populações (>100 UFC/g);
Ágar vermelho violeta bile lactose (Ágar VRB) (Presuntivo) sais biliares e cristal violeta inibem G+; o
vermelho neutro é um indicador de pH: coram as colônias fermentadoras de vermelho.
Sobrecamada;
Precisa de confirmação (colônias típicas e atípicas):

Típicas: colônias vermelhas-violeta com halo de

precipitação;
Atípicas: colônias vermelhas-violeta sem halo de
precipitação;
Colônias negativas: pálidas, com ou sem halo
esverdeado – não testar;
15 – 150 colônias.

Necessita confirmação:
Coliformes Totais: Caldo VB
Coliformes Termotolerantes: Caldo EC

Expressão dos resultados:

Exemplo: Se na diluição 10-1
35 colônias típicas: 3 colônias testadas, 2 confirmadas=23,33
22 colônias atípicas: 3 testadas, 1 confirmada=7,33
31x10 = 3,1x102 UFC/g
 Família Enterobacteriacea

Bactérias G(-), móveis ou imóveis, anaeróbias facultativas, oxidase negativas, produzem ácido na
fermentação da glicose, maioria produzem gases a partir da glicose.
Por que analisar??
• Associados a falhas de higiene durante o processamento de alimentos;
• Podem ser patogênicos;
• Alguns gêneros pertencem a família podem ser mais resistentes que os Coliformes, ex. Salmonella
spp.

Método:
ISO 21528-2

Ágar vermelho violeta bile glicose (VRBG), cuja

composição evidencia a habilidade dos m.o.
fermentarem a glicose com produção de ácido,
reação indicada por uma viragem do indicador a
vermelho e a precipitação de sais biliares ao redor
das colônias.

Necessita de sobrecamada

Confirmação: teste da oxidade e coloração de

Gram Colônias típicas: vermelhas, com halo de deposição