BASTONETES GRAM NEGATIVOS

FERMENTADORES DA GLICOSE

ORDEM ENTEROBACTERALE
FAMILIAS
ENTEROBACTERIACEAE
GÊNEROS: Escherichia, Citrobacter, Enterobacter, Klebsiella,
Shigella e Salmonella
YERSINIACEAE
GÊNEROS: Yersinia, Serratia
HAFNIACEAE
GÊNEROS: Hafnia , Edwardsiella
MORGANELLACEAE
GÊNEROS: Morganella, Proteus, Providencia
ERWINIACEAE
GÊNEROS: Erwinia , Pantoea
MEIOS DE CULTURAS PARA IDENTIFICAÇÃO BACTERIANA
 IDENTIFICAÇÃO BACTERIANA
1- MEIOS DE CULTURA RICOS (Não Seletivos): meios
sólidos ou líquidos, permitem o crescimento de vários
tipos de bactérias, presentes em material clínico
biológico.
EX: Caldo BHI (Brain Heart Infusion), THB (Toddy Hewitt
Broth)
Agar Sangue (5% de hemácias de Carneiro),
Agar Chocolate
Agar BHI, Agar CLED, e outros.
2- MEIOS DE CULTURA PARA O ENRIQUECIMENTO
BACTERIANO:
Caldo Selenito
Caldo GN
Caldo Tetrationato
 3- MEIOS DE CULTURAS SELETIVOS/DIFERENCIADORES
PARA O ISOLAMENTO DE BASTONETES GRAM NEGATIVOS

Meios de Cultura Seletivos e Diferenciadores:

- Fracamente seletivos
- Moderadamente seletivos
- Altamente seletivos

AGAR MACCONKEY
AGAR EMB (Eosina Azul de Metileno)
AGAR SS (Agar Salmonella Shigella)
AGAR ENTÉRICO HECTOEN
AGAR XLD (Xilose Lisina Desoxicolato)
Agar MacConkey
Ágar MacConkey
Ágar MacConkey
Ágar EMB Levine
Ágar EMB Levine
Agar Salmonella-Shigella (SS)
 TESTES PARA IDENTIFICAÇÃO DE BASTONETES GRAM NEGATIVOS

Teste da Oxidação / Fermentação da Glicose (O/F Glicose)

(Meio de Hugh-Leifson)
Finalidade: Utilizado para a diferenciação dos bastonetes gram negativos quanto à
capacidade do microrganismo em utilizar os carboidratos (principalmente a glicose)
pela via oxidativa ou pela via fermentativa.
Princípio do teste: A metabolização da glicose pela via fermentativa resulta na
produção de ácidos mistos, relativamente fortes, resultando em pH final 3,0-4,0 que
podem ser detectados por provas de fermentação convencionais.
A metabolização da glicose pela via oxidativa resulta na produção de ácidos fracos
(pH final 6,0-6,8) e para detectá-los é necessário o uso de um meio adequado e
indicador de pH bastante sensível.
Meio OF de Hugh e Leifson:
-possui concentração de peptona reduzida (0,2%) para evitar formação de
substâncias de natureza alcalina (resultante das proteínas) e que pode mascarar a
pequena acidez formada pela via oxidativa;
-concentração de carboidrato aumentada (1,0%), para manter a acidez da oxidação;
-contém 0,3% de ágar (é um meio semi-sólido) para facilitar a difusão de pequena
acidez gerada pela via oxidativa;
-meio tamponado (fosfato dipotássico) para não deixar o pH alterar por fatores que
não seja por oxidação e/ou fermentação da glicose;
-indicador sensível (azul de bromotimol) que detecta a pequena acidez gerada pela
oxidação.
 Teste da Oxidação / Fermentação da Glicose (O/F Glicose)
Execução do Teste: (São necessários o uso de 2 tubos com o meio OF Hugh Leifson)
-Inocular o microrganismo em estudo nos dois tubos, utilizando uma agulha de platina.
-Em um dos tubos, colocar óleo mineral estéril (o suficiente para obter uma camada de
cerca de 1centímetro de altura)
Obs: no tubo que contém o óleo mineral (chamado tubo fechado) vamos ver a
fermentação da glicose. No tubo sem a camada de óleo mineral (chamado tubo
aberto) vamos ver a oxidação da glicose.
-Incubar ambos os tubos em estufa a 35°C por 24-48 horas.
Leitura:
A produção de ácido no meio é detectada pela viragem da cor do meio de VERDE
para AMARELO
Obs: Indicador Azul de Bromotimol em pH neutro tem a cor Verde. Em pH Ácido tem a
cor Amarela. E em pH alcalino tem a cor Azul.

Meio aberto (sem óleo) Meio Fechado (com óleo) Interpretação

Ácido (amarelo) Inalterado (Verde) Metabolismo oxidativo

Ácido (Amarelo)
Inalterado (Verde)
( Ex. P. aeruginosa )
Ácido (Amarelo) Metabolismo fermentativo
(Ex. E.coli)
Inalterado (Verde) Não degrada a glicose
-Assacarolítico-
(Ex. Moraxella)
Teste O/F Glicose
Teste O/F Glicose
Teste O/F Glicose
 TESTES PARA IDENTIFICAÇÃO DE BASTONETES GRAM NEGATIVOS

Teste da Citocromo oxidase (Citocromoxidase)

Princípio: Os citocromos são hemoproteínas que contém ferro e atuam como último
elemento de ligação na cadeia respiratória aeróbia, transferindo elétrons
(hidrogênio) ao oxigênio, com formação de água. O sistema citocromo é
encontrado em microrganismos aeróbio, ou microaerófilos e anaeróbios
facultativos. Os microrganismos anaeróbios obrigatórios carecem da enzima.
O teste de citocromoxidase utiliza o corante N-N-tetrametil-p-fenilediamina que
substitui o oxigênio como aceptor artificial de elétrons. No estado reduzido, o
corante é incolor. Em presença da enzima citocromoxidase e de oxigênio
atmosférico, o corante N-N-tetrametil-p-fenilediamina é oxidado e forma o produto
azul de indofenol (de cor azul escura).
Finalidade: diferenciar os bastonetes gram negativos da Ordem Enterobacterales
(todas citocromoxidase negativa) de outras bactérias, como espécies de
Aeromonas, Pseudomonas, Neisseria, Campylobacter e Pasteurella (todas
citocromoxidade positiva).
O teste pode ser feito por um dos dois métodos:
1- Técnica direta em placa: adicionar 2 a 3 gotas do reagente diretamente sobre as
colônias crescidas em ágar
Execução do Teste: O teste pode ser feito por uma das duas técnicas:
1- Técnica direta em placa: adicionar 2 a 3 gotas do reagente diretamente sobre as
colônias crescidas em ágar
2-Técnica indireta, em papel de filtro: com o auxílio de um estilete de madeira ou
plástico, esfregar fragmento da colônia em uma tira de papel de filtro. Logo após,
adicionar 1 a 2 gotas do reagente sobre esse esfregaço.
Leitura e Interpretação: (Para a técnica direta ou indireta) : O desenvolvimento de cor
azul escura, cerca de 10 segundos na colônia ou sítio do esfregaço da colônia, indica
teste de citocromoxidase positiva. Se não houver o desenvolvimento de cor azul
escura cerca de 10 segundos após a adição do reagente, indica teste negativo.
 TESTES PARA IDENTIFICAÇÃO DE BASTONETES GRAM NEGATIVOS

Teste da Redução de Nitrato a Nitrito

Princípio: Produção da enzima nitrato redutase, que reduz o nitrato a nitrito.

Finalidade : Utilizada para a identificação bacteriana. Todos os bastonetes gram

negativos da Ordem Enterobacterales ( exceto certos biotipos de Pantoea
agglomerans e algumas espécies de Serratia e Yersínia) reduzem o NO3 a NO2.
Utilizada também para a identificação de Neisseria e Moraxella.
Para este teste utilizamos o cultivo da bactéria no Ágar Nitrato. A presença do nitrito é
revelada pela adição do Reagente de Nessler: mistura de partes iguais do
reagente A (sol. α naftilamina) e reagente B (ácido sulfanílico), levando à formação
de um composto diazônico de cor vermelha na presença de nitrito.

Execução do Teste: Inocular a bactéria no Ágar Nitrato. Incubar a 35°C por 24-48
horas. Após a incubação, adicionar algumas gotas do Reagente de Nessler sobre
o crescimento bacteriano.

Leitura:
1-O desenvolvimento imediato de cor vermelha, indica presença de nitrito, e teste
positivo para a redução de nitrato.
 TESTE DA REDUÇÂO DE NITRATO

2- O não aparecimento de cor vermelha, após a adição do reagente de Nessler:

A) pode indicar um teste negativo (não redução do NO3 a NO2)

B) pode indicar a desnitrificação : redução de NO3 →NO2→N2 .

Neste caso, como o reagente de Nessler só detecta nitritos , vamos verificar a

presença de nitrato no meio de cultura, adicionando fragmentos de pó de zinco na
cultura. O zinco reduz nitrato a nitrito imediatamente:

-Se após a adição do zinco não ocorrer produção de cor vermelha, indica
ausência de nitrato no meio de cultura, e portanto, indica teste positivo
para a redução do nitrato pela bactéria;

-Se após a adição do zinco ocorrer a produção de cor vermelha, indica

presença de nitrato no meio de cultura o qual foi reduzido a nitrito pela
adição do zinco. Neste caso indica teste negativo para redução do nitrato
pela bactéria.
Teste Redução do Nitrato
 TESTES PARA IDENTIFICAÇÃO DE BASTONETES GRAM NEGATIVOS

-Teste da Fermentação da Glicose/Lactose/ Sacarose

- Produção de gás
-Teste Produção de H2S (sulfeto de Hidrogênio)

MEIO TSI – Triplo Sugar Iron (Tem Glicose, Lactose e Sacarose)

MEIO KIA – Kligger Iron Agar (Tem Glicose e Lactose)

Extrato de carne - 3g Cloreto férrico - 0,5g

Extrato de levedura - 3g Ágar - 12g
Peptona - 15g Vermelho de fenol - 0,024g
Proteose peptona - 5g Água destilada - 1L
Lactose - 10g pH final 7,2
Glicose -1g
Sulfato Ferroso - 0,2g
Cloreto de sódio - 5g
Tiossulfato de Sódio - 0,3g
 TESTES PARA IDENTIFICAÇÃO DE BASTONETES GRAM NEGATIVOS
-Teste da Fermentação da Glicose/Lactose/ Sacarose
- Produção de gás
-Teste Produção de H2S (sulfeto de Hidrogênio)
Ágar TSI
Ágar KIA
Ágar TSI
Ágar TSI
TESTES PARA IDENTIFICAÇÃO DE BASTONETES GRAM NEGATIVOS

TESTE DO INDOL
(Caldo Triptofano)
Teste do indol
5- MEIOS DE CULTURA /TESTES PARA IDENTIFICAÇÃO DE BASTONETES
GRAM NEGATIVOS
TESTE DE VM (Vermelho de Metila)
TESTE DO VP (Voges Proskauer)
(Caldo Clark Lubs)
Teste Vermelho de Metila (VM) / Voges Proskauer (VP)
Teste Vermelho de Metila (VM) / Voges Proskauer (VP)
5- MEIOS DE CULTURA /TESTES DIFERENCIAIS PARA IDENTIFICAÇÃO DE
BASTONETES GRAM NEGATIVOS
TESTE DE ASSIMILAÇÃO DO CITRATO
(Meio Agar Citrato de Simmons)
Assimilação do Citrato
Assimilação do Citrato
IMVC
IMVC
5- MEIOS DE CULTURA /TESTES DIFERENCIAIS PARA IDENTIFICAÇÃO DE
BASTONETES GRAM NEGATIVOS
TESTE DA ATIVIDADE UREASE
(Agar Uréia de Christensen)
Urease
5- MEIOS DE CULTURA /TESTES DIFERENCIAIS PARA IDENTIFICAÇÃO DE
BASTONETES GRAM NEGATIVOS
TESTE DA DESAMINAÇÃO DA FENIL FENIL ALANINA
(Agar Fenil Alanina)
Fenil Alanina
Desaminase
Fenil Alanina
Desaminase

Urease
5- MEIOS DE CULTURA /TESTES DIFERENCIAIS PARA IDENTIFICAÇÃO DE
BASTONETES GRAM NEGATIVOS
TESTE DE DESCARBOXILAÇÃO DA LISINA – ORNITINA - ARGININA
(Caldo Descarboxilase de Moeller)
Descarboxilases