IDENTIFICAÇÃO DE

B A S T O N E T E S G R A M - N E G AT I VO S
F E R M E N TA D O R E S

D R A . D A Y A N N E A R A Ú J O D E M E L O

M É D I C A V E T E R I N Á R I A - U F R R J

D R A . E M C I Ê N C I A S V E T E R I N Á R I A S - U F R R J

P Ó S - D O U T O R A D O E M C I Ê N C I A T E C N O L O G I A E I N O V A Ç Ã O E M A G R O P E C U Á R I A - U F R R J
FA M Í L I A E N T E RO B AC T E R I AC E A E

O R D E M E N T E RO BAC T E R A L E S
ORDEM ENTEROBACTERALES

(Adelou et al., 2016).

 Ordem Enterobacterales
• Composição: > 60 gêneros / 250 espécies (Adelou et al., 2016).
Distribuição Mundial

Habitat: plantas, solo, água, intestino de homem e animais.

O R D E M E N T E RO BAC T E R A L E S
• Bastonetes Gram-negativos;
• Anaeróbios facultativos (Catalase positivos);
• Fermentam açúcar com produção de ácido a partir da glicose;
• Oxidase negativos;
• Reduzem nitrato a nitrito;
• Podem ser móveis (flagelos peritríquios);
• Importante patógeno humano e animal – gastrenterite leve a severa e infecção do trato
urinário, pneumonias, meningites, septicemia etc.
 TIPOS DE AMOSTRAS

Amostras: fezes, urina, secreção otológica, leite, alimentos, sangue etc.

6
 ISOLAMENTO
Isolamento em meio enriquecido e não seletivo (ASC) e em meios seletivos AEMB, AMC, ASS.

ASC 5%
AEMB

AMC ASS

7
 I D E N T I F I C A Ç Ã O P R E S U N T I VA
• Isolamento primário – Ágar Sangue 5%.
• Coloração de Gram.
• Prova do KOH 3%.
• Isolamento em meios seletivos.
• Leitura da Placa*
 Isolamento Primário
• Ágar sangue de carneiro 5%: grandes, cinzas, secas ou mucóides, opacas, hemolíticas ou não.

❑ Salmonella

❑ Escherichia coli ❑ Klebsiella pneumoniae

❑ Proteus
9
 I D E N T I F I C A Ç Ã O P R E S U N T I VA

• Coloração de Gram

10
 I D E N T I F I C A Ç Ã O P R E S U N T I VA

• Hidróxido de potássio 3% (KOH 3%) – dissolve a parede celular de

bactérias Gram negativas. O DNA é liberado, produzindo uma
viscosidade na presença do KOH (prova positiva).

11
 I D E N T I F I C A Ç Ã O P R E S U N T I VA

 Prova da Catalase

Resultado: Catalase
positivo

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 Meios Seletivos
Ágar Mac Conkey (MC)

Cristal violeta, sais biliares, lactose, peptona de carne, peptona de caseína, peptona de gelatina,
vermelho neutro, NaCl e ágar.

Seletivo: Cristal Violeta e sais biliares – inibem Gram +.

Diferencial: Fermentação da Lactose.

➢ Indicador de pH: VERMELHO NEUTRO.

A B
Lactose + : meio róseo, ácido.

Lactose - : meio amarelo/incolor, alcalino.

13
❑Fermentadores intensos: colônias vermelhas com halo de bílis precipitada. Exs.: Escherichia,
Enterobacter e Klebsiella.
❑Fermentadores lentos ou fracos: incolores (24h), rosa claro (24-48h). Exs.: Citrobacter e
Serratia.
❑Não fermentadores: incolores ou transparentes. Exs.: Salmonella, Shigella e Proteus.

❑ Salmonella
❑ E. coli

❑ Citrobacter spp.

14
 Meios Seletivos - ÁGAR EOSINA-
AZUL DE METILENO (EMB)
Eosina, azul de metileno, fosfato dipotássico, lactose, sacarose, peptona de
gelatina e ágar.

Seletivo: Eosina e azul de metileno – inibem Gram + Gram -exigentes.

Diferencial: Fermentação da Lac/Sac.

Indicador de pH: Eosina e azul de metileno.

15
 ISOLAMENTO EM ÁGAR EOSINA-AZUL
DE METILENO (EMB)
CARACTERÍSTICAS DE CRESCIMENTO

❑Fermentadores intensos: negra esverdeada com brilho metálico. Ex.:

Escherichia coli.
❑Fermentadores fracos: colônias púrpuras. Exs.: Klebsiella, Enterobacter e
Serratia.
❑Não fermentadores: incolores ou transparentes. Exs.: Salmonella, Shigella.

16
 CONSIDERANDO A ANÁLISE
P R E S U N T I VA Q UA I S D E N T R E O S
C R I T É R I O S A P R E S E N TA D O S S E R I A M
M A I S I M P O RTA N T E S P E N S A N D O N A
IDENTIFICAÇÃO DE BASTONETES
G R A M - N E G AT I VO S F E R M E N TA D O R E S ?
 P RO VA S B I O Q U Í M I C A S

Fermentação da lactose/sacarose;
➢TSI Produção de H2S;
Produção de gás.

Indol;
➢IMViC Vermelho de Metila;
Voges Proskauer;
Citrato.
 Ágar TSI
Composição: Peptonas, extrato de carne, extrato de levedura, Glicose (0,1%),
Lactose (1,0%), Sacarose (1,0%), vermelho de fenol, tiossulfato de sódio, citrato
de ferro, NaCl e ágar.

Semear o mcg em profundidade e na superfície do meio e incubar a (37ºC / 24 h).

• Detecção de: fermentação de açúcares, produção de gás e H2S.

19
Ágar TSI
 Reações no TSI
Produção de Gás e de H2S

• Liberação de sulfeto a partir do Tiossulfato

de sódio (fonte de enxofre) e união com íon H.
• Detecção de H2S por ferro = precipitado negro.

21
 Reações no TSI
DIAGNÓSTICO
LEITURA INTERPRETAÇÃO
PRESUNTIVO
Reação ácida (amarelo)
Fermentação da glicose
e gás na profundidade. Escherichia, Klebsiella
Fermentação da lactose
Reação ácida na Enterobacter
e/ou sacarose, inclusive
superfície, ausência de Providencia, Serratia
com produção de gás
H2S
Reação ácida e gás na
Fermentação da glicose Salmonella
profundidade. Superfície
sem ataque à lactose Edwardsiella
alcalina (vermelha).
e/ou sacarose Citrobacter, Proteus
Presença de H2S
Reação ácida sem gás Glicose fermentada Shigella, Salmonella
na profundidade, apenas formando ácido, Proteus
superfície alcalina, nenhuma ação sobre a Providencia, Serratia
ausência de H2S lactose e sacarose Yersinia
Meio inteiramente ácido Fermentação da glicose
com gás. Presença de com gás, fermentação Citrobacter, Proteus
H2S da glicose e/ou sacarose
Fermentação da glicose
Meio inteiramente ácido,
apenas com formação Escherichia coli,
sem gás. Ausência de
de ácido; fermentação Serratia
H2S
da lactose e/ou sacarose
22
 M O T I L I DA D E , I N D O L E H 2S
ANÁLISE ADICIONAL
(MEIO DE SIM)

• Meio de SIM: peptona de caseína, peptona de carne, citrato férrico

amoniacal, tiossulfato de sódio, ágar (0,3%).

✓ Procedimento: inocula-se em linha reta 2/3 do meio semi-sólido.

• Leitura:
➢Motilidade (+) - mcgs migram da linha de inoculação, difundindo-se
por todo o meio, causando a turvação do meio.
➢Motilidade (-) - mcgs crescem apenas ao longo da linha de
inoculação.

23
 M O T I L I DA D E , I N D O L E H 2S ( M E I O D E S I M )

• Indol: A partir da peptona de caseína é formado o Aa triptofano.

Triptofano → Indol + Ác. pirúvico + NH3 + Reativo de Kovacs → Anel Vermelho

• Reativo de Kovacs: adicionar 0,3 mL do reativo na superfície do meio.

• Leitura

➢ Indol (+) – anel vermelho.

➢ Indol (-) – anel amarelo.

24
 M O T I L I DA D E , I N D O L E H 2S
ANÁLISE ADICIONAL
(MEIO DE SIM)
• H2S: Escurecimento do meio.

• Liberação de sulfeto a partir do Tiossulfato

de sódio (fonte de enxofre) e união com íon H.
• Detecção de H2S por ferro = precipitado negro.

25
 C I T R AT O D E S I M M O N S
Composição: sulfato de magnésio, fosfato de amônio dihidrogenado,
fosfato dipotássico, citrato de sódio, NaCl, azul de bromotimol, ágar.

Objetivo: determinar a capacidade do mcg utilizar o citrato de sódio

como única fonte de C para o seu crescimento.

Semear o mcg somente na superfície do meio e incubar a (37ºC / 24 h).

A utilização do citrato revela-se pelo aparecimento de cor azul na

superfície do meio.

26
VERMELHO DE METILA(VM)

• Caldo MR-VP- Detecção de ácidos Mistos

Adicionar Vermelho de Metila
 VOGES PROSKAUER (VP)
• Caldo MR-VP- Via do Butilenoglicol
Adicionar Alfa-Naftol e KOH 40%.

via glicolítica via butilenoglicol

glicose ácido pirúvico acetoína + 2 CO2

O2 + KOH
acetoína diacetila

catalizador

complexo
diacetila + alfa-naftol + arginina produto rosa a vermelho
 Col.
ENTEROBACTÉRIAS Indol VM VP Citrato H2S Motilidade Lactose Swarming Mucóide Pig. Vermelho Urease Lisina Descarboxilase
Citrobacter diversus + + - + - + [(+)] - - - (+) -
Edwardsiella tarda + + - - + + - - - - - +
Enterobacter aerogenes - - + + - + + - + - - +
Enterobacter cloacae - - + + - + + - - - [(+)] -
Escherichia coli + + - - - (+) + - (-) - - (+)
Klebsiella pneumoniae - (-) + + - - + - + - + +
Morganella morganii + + - - - + - - - - + -
Proteus mirabilis - + (-) [(+)] + + - + - - + -
Proteus vulgaris + + - (-) + + - + - - + -
Salmonella enterica subsp. arizonae - + - + + + - - - - - +
Salmonella enterica subsp. enterica - + - + + + [(+)] - - - - +
Serratia marcescens - (-) + + - + - - - + (-) +
Serratia rubidea - (-) + + - (+) + - - + - [(+)]
Shigella spp. V + - - - - - - - - - -
Yersinia enterocolitica [(+)] + - - - - - - - - (+) -
Yersinia pestis - (+) - - - - - - - - - -
Yersinia pseudotuberculosis - + - - - - - - - - + -