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PROVAS BIOQUMICAS

Prova da Catalase
A catalase degrada H2O2 com formao de O2 e H2O. Assim, a produo de catalase e a
sua actividade pode ser detectada colocando uma gota de gua oxigenada, com uma pipeta de
vidro estril, numa lmina e transferindo o inculo da bactria com ansa.

Catalase positiva: formao de bolhas

Catalase negativa: no h formao de


bolhas

Ateno: A prova da catalase no deve ser feita em meio de gelose de sangue, pois pode dar
um falso positivo, uma vez que os eritrcitos possuem esta enzima.

Prova da Oxidase
Nas bactrias aerbias obrigatrias, o aceitador final de electres o oxignio. A
citocromo c oxidase cataliza uma das reaces da cadeia respiratria. Assim, o citocromo c
(reduzido) reage com o O 2 e por aco da citocromo c oxidase origina citocromo c (oxidado) e
H2O.
Retirar com a ansa um inculo de cultura, coloc-lo directamente no
papel impregnado com o reagente oxidase e observar durante 1 minuto se
h oxidao do reagente oxidase (cor prpura).

Oxidase positiva: prpura (aerbias obrigatrias)


Oxidase negativa: incolor

Prova da Coagulase
As coagulases so enzimas que coagulam o plasma do sangue por um mecanismo
semelhante ao da coagulao normal. A formao de um cogulo de fibrina protege a bactria da
fagocitose. A coagulase um bom indicador da patogenicidade da bactria.
Num tubo de ensaio colocar 100L de plasma de coelho e 100L de uma suspenso da
bactria em meio lquido nutritivo ou suspender uma colnia da bactria a estudar. Incubar 1 a 4
horas a 37C.

Coagulase positiva: formao de cogulo


Coagulase negativa: sem formao de cogulo

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Ateno: No devemos usar citrato como anti-coagulante, podemos obter um falso positivo pois
existem bactrias que utilizam citrato.

Prova ONPG
Alguns microrganismos podem utilizar a lactose como nica fonte de carbono. Esta prova
demonstra a presena ou a ausncia da enzima b-galactosidase atravs da utilizao de um
composto orgnico o ONPG. A lactose na presena de ONPG degrada pela b-galactosidase em
o-nitrofenol (amarelo) e galactose.
Em 1 ml de gua estril suspender a bactria em estudo. Colocar o disco de ONPG.
Incubar 4 h a 37C

ONPG positiva: amarelo, presena de -galactosidase, mas


ausncia de permease

ONPG negativa: incolor, ausncia de -galactosidase

Prova da Hemlise
As hemolisinas so enzimas que lisam os eritrcitos. Inoculao por isolamento em meio
de gelose de sangue, que possui eritrcitos intactos.

-hemlise (hemlise total) halo transparente em redor das colnias


-hemlise (hemlise parcial) halo esverdeado em redor das colnias
-hemlise (sem hemlise) sem halo em redor das colnias

-hemlise -hemlise -hemlise

Prova do citrato
O meio de citratos/Simmons contm como nica fonte de carbono o citrato de sdio, NH 4+
como fonte de azoto e como indicador de pH, o azul de bromotimol. A prova do citrato pe em
evidncia a presena da citrase. Inocular o meio por estria superfcie. Incubar 24 a 48 horas
a 37C. Quando a bactria oxida o citrato, remove-o do meio e liberta cido pirvico e CO2.
Este combina-se com o sdio (do citrato de sdio) e com a gua, originando o carbonato de
sdio (Na2CO3) que um produto alcalino.

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Citrato positiva: azul, pH do meio sobe (alcalino)
Citrato negativa: verde, sem crescimento bacteriano

Ateno: Pode acontecer que aparea uma cor verde j a mudar para
azul, ento, consideramos que h crescimento bacteriano, sendo a bactria
citrato positiva.

gua de peptona

A gua de peptona um meio lquido rico em triptofano. A triptofanase a enzima que


degrada o triptofano em indol, cido pirvico e amnia, como produtos metablicos. A
bactria usa o cido pirvico e amonaco para satisfazer as suas necessidades nutricionais. O
indol no utilizado e acumula-se no meio. A presena de indol detectada com adio de
reagente de Erlich (aldedo), havendo formao de um anel vermelho.

Inocular o meio por suspenso da bactria com ansa. Incubar 24 horas a


37C. Aps a incubao adicionar 5 gotas de reagente de Erlich (lcool amlico +
cido clordrico + p-dimetil-aminobenzoaldedo).

Triptofanase positiva: anel vermelho, presena de triptofanase

Triptofanase negativa: ausncia de cor, ausncia de triptofanase

Prova de SIM
O meio de SIM (SH2, Indol, Molibity) um meio semi-slido que nos d 3 leituras
diferentes: produo de H2S, produo de indol e mobilidade.

Inocular o meio por picada central. Incubar 24 a 48 horas a 37C.

1. Produo de H2S
O meio de SIM contm sulfato de ferro amoniacal que um indicador interno do
sulfureto de hidrognio. O H2S reage com o sulfato de ferro amoniacal, produzindo um
precipitado de sulfureto de ferro que muda a cor do meio para preto.

Presena de H2S: meio fica com cor preta

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Ausncia de H2S: meio no muda de cor

2. Produo de Indol
Tal como na gua de peptona, adicionamos o reagente de Erlich e verificamos a presena
de triptofanase com formao de indol, cido pirvico e amnia, se houver formao de um anel
vermelho.

Indol positiva: anel vermelho, presena de triptofanase

Indol negativa: ausncia de cor, ausncia de triptofanase

3. Mobilidade da bactria
A bactria mvel quando o crescimento no est restrito linha da picada, isto , o meio
encontra-se turvo. Se a bactria for imvel s h crescimento ao longo da picada central.

Mvel: crescimento para alm da linha de inoculao


Imvel: crescimento apenas na linha de inoculao

Ateno: Se o precipitado negro do indicador de H2S impedir a


visualizao da mobilidade, temos que fazer a gota pendente.

Prova da Ureia

Algumas bactrias possuem urease, enzima capaz de degradar a ureia em amnia e


dixido de carbono. A prova da ureia pe em evidncia a presena desta enzima.
A urease detectada pelo crescimento da bactria num meio contendo ureia e vermelho
de fenol como indicador de pH. Quando a ureia hidrolisada, o amonaco acumula-se no meio e
torna-o alcalino.

Inocular o meio por estria superfcie. Incubar 24 horas a 37C.

Urease positivo rosa choque, h decomposio de ureia


e aumento de pH

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Urease negativo amarelo, no h decomposio de ureia nem alterao do pH

Prova da LDC e ODC

As descarboxilases so enzimas bacterianas que removem o grupo carboxilo dos


aminocidos. Este processo um passo no metabolismo anaerbio dos aminocidos. Embora
existam vrias descarboxilases, apenas duas so habitualmente usadas na identificao
bacteriana: lisina descarboxilase (LDC), ornitina descarboxilase (ODC).

A descarboxilao da lisina e da ornitina pode ser detectada num meio de cultura que
contenha o aminocido que desejamos estudar (L-lisina ou L-ornitina), glucose e um indicador de
pH, o prpura de bromocresol. A descarboxilao da lisina origina a cadaverina e a
descarboxilao da ornitina d origem putrescina.

Estes meios so lquidos, cuja cor inicial prpura. Inocular o meio por suspenso,
adicionar parafina lquida (criar um meio anaerbio) e incubar 24 a 48h a 37C.

LDC/ODC positiva prpura, apesar de ocorrer fermentao de glucose com formao de


produtos cidos que levariam a uma cor amarela, a presena da enzima descarboxilase,
leva a um aumento do pH pois h formao de aminas que neutralizam o meio e ainda
ficam em excesso.

LDC/ODC negativa amarelo, o pH diminui por formao


de compostos cidos resultantes da fermentao da glucose
pelas bactrias. No h descarboxilase, portanto, no pode
ocorrer descarboxilao e no h re-alcalinizao do meio.

Prova da Fenilalanina Desaminase (APP)

Algumas bactrias entricas produzem uma enzima, fenilalanina desaminase, capaz de


transformar a fenilalanina em cido fenilpirvico e amnia.

Inocular por estria em rampa. Incubar 18 a 24 horas a 37C. Adicionar 4 a 5 gotas de


reagente de APP (cloreto frrico). Aguardar 5 minutos.

Fenilalanina desaminase positiva: verde

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Fenilalanina desaminase negativa: ausncia de cor verde

Prova da reduo de Nitratos

Algumas bactrias aerbias e anaerbias facultativas podem em condies de anaerobiose


realizar respirao anaerbia, tendo como aceitador final de electres o anio nitrato. O anio
nitrato reduzido a produtos como: azoto molecular, nitritos e amnia.

Neste processo, o nitrato reduzido a nitrito e algumas destas bactrias possuem as


enzimas que continuam a reduo do nitrito a io amnio ou at azoto molecular.
Para determinar se houve reduo de nitratos a nitritos, adicionamos um pouco de zinco
em p (agente redutor), se houver nitrato no meio, o zinco vai reduzi-lo a nitrito.

O meio de nitratos um meio lquido em tubo (amarelo claro). Inocular o meio por
suspenso, incubar durante 12 a 24h a 37C. Adicionar 5 gotas de reagente A (cido
sulfanlico) 5 gotas de reagente B (-naftilamina + CH3COOH).

Nitrato redutase positiva: vermelho, nitrato redutase reduz nitratos a nitritos

Nitrato redutase negativa: incolor

zinco

Nitrato redutase positiva: incolor, h reduo de nitratos at


azoto molecular (gs)

Nitrato redutase negativa: vermelho, nitratos so reduzidos a nitritos por aco do zinco
e no por aco da nitrato redutase

Prova da Dnase
Algumas bactrias possuem uma enzima a Dnase que degrada o DNA das clulas
hospedeiras. A presena desta enzima est relacionada com a patogenicidade da bactria e a sua
pesquisa importante na identificao das bactrias pertencentes ao gnero Staphylococcus.

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Para detectar a produo de Dnase, utilizamos agar com DNA dissolvido. Semeamos o
meio com um risco central e deixamos incubar a 37C durante 24h. Adicionar algumas gotas de
HCl 1 N.

Dnase positiva: com halo transparente, o DNA degradado pois no


ocorre precipitao com HCl

Dnase negativa: sem halo transparente, o DNA intacto precipita


com HCl, o meio fica todo opaco

Meio de OF
Permite saber se a glucose utilizada pela via fermentativa ou pela via oxidativa. Este meio
tem um baixo teor de peptona e o meio mais rico em acar para que a viragem cida se torne
evidente.

Este meio semi-slido e por isso, no momento de emprego regenerado num banho
fervente durante 10 minutos, para criar um meio anaerbio. Depois deixa-se arrefecer e inocular
por picada central com fio.

Neste teste usamos 2 tubos, o que foi descrito at


agora igual para os dois, mas depois de cultivados, um
deixado fechado apenas com a rolha de algodo e no
outro coloca-se parafina estril para manter o ambiente
anaerbio. O indicador de pH o azul de bromotimol e
inicialmente, o meio verde (meio neutro).

Tubos verdes: a bactria no capaz de utilizar glucose.

Tubos amarelos: a bactria utiliza a via fermentativa com produo de cidos


(anaerbia facultativa).

Tubo verde e tubo amarelo: no tubo amarelo sem parafina, a bactria utiliza oxignio
na degradao da glicose; no tubo verde com parafina (cria um meio de anaerobiose), a
bactria na ausncia de oxignio no capaz de utilizar glucose (aerbia restrita).

Caldos Glucosado e Lactosado


Meios lquidos em tubo, semeados por suspenso com ansa. O tubo
possui ainda um pequeno tubo tubo de Durhan. Inicialmente o meio

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vermelho, devido ao indicador de pH, vermelho de fenol. Estes meios so diferenciais e
permitem saber se a bactria fermentadora de hidratos de carbono:
Resultado positivo: amarelo (fermentao com produo de cidos) ou amarelo com
libertao gases (fermentao de hidratos de carbono com formao de bolha de gs no
tubo de Durhan)

Resultado negativo: vermelho/alaranjado, no ocorre fermentao de hidratos de


carbono. Aqui, no pode haver libertao de bolhas gasosas no tubo de Durhan, apenas
poder existir se no tivermos expulso a bolha de gs antes da inoculao.

Ateno: uma bactria fermentadora de lactose, tambm fermentadora de glucose. Ou seja,


quando fermenta o caldo lactosado, fermenta obrigatoriamente o caldo glucosado.

Meio de Kliger
O meio de Kliger um meio slido de cor vermelha, em rampa. Permite saber se a
bactria faz a fermentao da glucose, lactose ou das duas, e ainda, se h produo de H 2S. Este
meio semeado de 2 formas diferentes, por picada central com ansa e por estria superfcie
em rampa.
O meio de Kliger diferencial e utilizado quando j temos bactrias isoladas, permitindo
conhecer vrias caractersticas da bactria:

1. Produo de H2S
Muitas protenas so ricas em aminocidos que contm enxofre, como a cistena.
Quando estas protenas so hidrolisadas por certas bactrias, os aminocidos so libertados e
usados como nutrientes e ocorre libertao de H2S.

Produo de H2S: cor preta, levantar ou rachar

Sem produo de H2S: sem cor preta

Ateno: Pode acontecer que o tubo seja preto devido formao de H 2S, mas tenha a rampa
vermelha. Podemos concluir que no fermenta a lactose, mas no sabemos se fermenta a
glucose.

2. Fermentao da glucose e lactose


O meio de Kliger constitudo por 2 acares em quantidades muito diferentes: 10g/L de
lactose e 1g/L de glucose. Se a bactria s for capaz de fermentar a glucose, o meio funciona
como se s contivesse 1g/L de acar.
A lactose um dissacardeo composto por uma molcula de glucose ligada a uma molcula
de galactose por uma ligao (1-4). Portanto, quando uma bactria

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fermentadora de lactose tambm fermentadora de glucose, no entanto, o inverso j no se
verifica. O indicador utilizado o vermelho de fenol:

Fundo amarelo e rampa amarela: glucose + e lactose +


Fundo vermelho e rampa vermelha: glucose e lactose -
Fundo amarelo e rampa vermelha: glucose + e lactose

Meio MR-VP
O meio de MR-VP um meio lquido em tubo, que semeado por suspenso da cultura no
meio. Depois de incubar, este meio dividido em 2 tubos onde se realizam, separadamente o
teste de MR (methyl red) para pesquisar se ocorre fermentao com produo de cidos fortes e
o teste de VP (Voges Prostrauer) para pesquisar se ocorre fermentao com produo de cidos
fracos e se h formao de acetona. Quando dividimos o meio em 2 tubos devemos acender o
bico de Bunsen.

muito raro os 2 testes darem positivos, isto porque se a bactria fermentadora por uma
via no fermenta pela outra, portanto se um der positivo, o outro d negativo e vice-versa.

Teste MR adio de 5 gotas de vermelho de metilo:

MR positivo: vermelho, fermentao com produo de cidos


MR negativo: amarelo, fermentao com produo de produtos
neutros

Teste VP adio de 6 gotas de -naftol e 2 gotas de KOH, esperar 20 minutos:

VP positivo vermelho, com acetona

VP negativo amarelo, sem acetona