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INSTITUTO FEDERAL DE EDUCAÇÃO E TECNOLOGIA DO RIO DE JANEIRO

CAMPUS NILÓPOLIS
MICROBIOLOGIA

Provas Bioquímica
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Alunos: Marcelly Santos, Maria Clara Santiago, Juliana Quaresma e Guilhermina

Fernandes.

Rio de Janeiro 12/01/2023

Introdução

Os testes bioquímicos consistem em sucessivos testes em diferentes meios de cultura

que identificam a ação metabólica do microrganismo através da alteração de aspectos
visuais e químicos do meio de cultura. Utiliza-se meios de cultura seletivos ou
enriquecidos e reagentes específicos para detectar- se esses metabólitos. As provas
geralmente avaliam a utilização de fontes de carbono, nitrogênio, a motilidade bacteriana
e detectam a produção de enzimas específicas. A junção dos resultados proveniente dos
diversos testes bioquímicos possibilitará ao analista a identificação ou pelo menos
alternativas para aquele microrganismo.

O meio SIM identificam a presença de bactérias flageladas, sendo utilizados para verificar
a motilidade de diversas bactérias. Nesse experimento, utiliza-se um tubo com meio sólido
que permite o crescimento bacteriano por todo o tubo, o que fará com que o tubo fique
turvo. O porém está na área de crescimento, ela vai depender da capacidade que a
bactéria tem de se mover. No caso de uma bactéria móvel, o crescimento se dará por todo
o tubo, já as bactérias imóveis crescerão somente na linha na qual foram inoculadas. E
sendo uma bactéria móvel ( meio de cultura amplamente turvo) podemos concluir que a
bactéria possui flagelos, sendo essa uma importante informação na sua identificação.

Outra forma de identificação é o teste realizado com vermelho de metila, esse teste visa
avaliar se as bactérias produzem ácidos a partir da fermentação da glicose pela via ácida
mista. Ao colocar o vermelho de metila em contato com a colônia, deve-se observar a
coloração do meio. Caso a bactéria faça fermentação de glicose o pH do meio começará
a diminuição em razão da produção de ácido derivada da fermentação, sendo assim,
quando o pH estiver <4.4 o meio ficará avermelhado, sendo um indicativo da presença de
bacilos gram negativos entéricos como a E. Coli e a Yersinia. Caso não ocorra a
fermentação da glicose o pH do meio tende a ficar básico ( coloração amarela), indicando
ação de bacilos gram negativos não entéricos, enterobacter ou klebisiella.

O teste de Voges Proskauer permite avaliar a fermentação da glicose produzindo

acetoína, butileno glicol e outras pequenas quantidades de ácidos. Para realizar o
experimento, adiciona-se uma quantidade de potassa ( KOH), e na presença de oxigênio
atmosférico, a acetoína é oxidada a diacetil. A adição do reagente alfa- naftol irá interagir
com o diacetil e resultará na produção de um anel vermelho tijolo após um período de
10-15 minutos. O teste positivo indica a possível presença de bactérias do tipo
Staphylococcus, Enterobacter, Listeria Monocytogenes etc.

A partir de um meio enriquecido com o triptofano, realiza-se o teste de indol. O indol é

produzido a partir do triptofano, se a bactéria produzir a enzima triptofanase o triptofano
será quebrado em indol. A reação do indol com o reativo de Covax resultará em um anel
rosa, conferindo mais uma informação para o diagnóstico.

A capacidade do microrganismo de reduzir nitratos também pode ser ferramenta de

diferenciação. A redução do nitrato em nitrito realizada pela bactéria a aponta como uma
possível enterobacteria, a redução do nitrato em gás em pseudomonas e a não redução
em acinetobacter. Se o meio ficar vermelho após a adição dos reagentes Gliss A e Gliss
B, é um indicativo da redução do nitrato a nitrito, e a posterior reação desse nitrito com o
substrato adicionado é o que dará origem a coloração avermelhada. Caso não ocorra a
mudança de coloração no meio, o resultado não pode ser interpretado como negativo, já
que o nitrato pode ter sido reduzido a gás nitrogênio. A adição de zinco ao tubo em que
não ocorreu a mudança na coloração fará com que ocorra a quebra do nitrato em nitrito,
se a mudança coloração ocorrer nesta etapa significa que ainda havia nitrito no meio,
portanto, o microrganismo não realizou a redução e o resultado do teste realmente é
negativo. Se após a adição do zinco o meio permanecer com a coloração inicial significa
que o nitrito já foi consumido ( redução a gás nitrogênio), apontando um resultado positivo
para a habilidade do microrganismo em reduzir o nitrito.

Imagem 1 - Capacidade do microorganismo de redução do nitrato em nitrito.

Imagem 2- Capacidade do microorganismo em redução do nitrato em nitrito e nitrito a gás

nitrogênio ( após a adição de zinco ).

Os carboidratos podem ser fermentados e originar diferentes produtos finais em razão do

microrganismo envolvido. Em meio líquido, é possível detectar a geração de gases por
meio de bolhas no chamado tubo de Durham ( tubo pequeno colocado invertido dentro do
tubo de ensaio). Caso ocorra a liberação de gás, o tubo ficará com uma bolha de gás no
seu interior. Já em meio sólido percebe-se a liberação de gases através do deslocamento
do meio de cultura. Além de detectar a geração de gases, é possível avaliar a geração de
ácidos orgânicos através da mudança de cor do indicador. Esse teste serve para
diferenciar bacilos gram negativos com base na fermentação de carboidratos, produção
de sulfato de hidrogênio e gás. O meio que geralmente é utilizado para realizar esse teste
é o TSI, composto de ferro e três açúcares: glicose 0,1%, sacarose 1% e lactose 1%,
sendo a sacarose o açúcar mais fácil de ser digerido, os outros dois açúcares geralmente
são mais complexos e vão requerer uma enzima para quebrá-los em açúcares mais
simples. o indicador vermelho fenol apresenta coloração amarelada em meio básico e
avermelhada em meio ácidos. A viragem do indicador somente na base do tubo indicará
que a bactéria consumiu somente a glicose, e o ápice irá apresentar coloração arroxeada
em razão do consumo de aminoácidos no meio de cultura( pH alcalino). Já a viragem do
indicador em todo o tubo indicará então que a bactéria fermentou, pelo menos, dois
açúcares disponíveis.

Os testes realizados com aminoácidos também são de suma importância no diagnóstico

bioquímico. Mesmo com aminoácidos disponíveis, a bactéria prefere quebrar
(inicialmente) os açúcares, acidificando os meio e conferindo a esse meio inicialmente
roxo uma coloração amarelada. Caso essa bactéria também utilize o aminoácido o meio
alcaliniza novamente e volta para a coloração roxa inicial.

O teste bioquímico com utilização de citrato no meio visa saber se determinada bactéria
utiliza o carbono presente no meio como única fonte de energia. Caso isso ocorra, o meio
passará de verde para azul intenso.

A utilização do meio enriquecido com ureia vai proporcionar ao analista a informação

sobre a presença da enzima urease na bactéria em estudo. Se a bactéria contar com a
enzima urease, o meio irá de laranja/ amarelo para rosa.

Materiais e métodos

Materiais :

1. Tubos de ensaio ( 18)

2. Alça de inoculação (1)
3. Agulha (1)
4. Bico de bunsen (1)

Reagentes:

1. Vermelho de metila
2. Alfa-naftol
3. Reativo covax
4. KOH
5.

Métodos :

Realizou-se a inoculação do microrganismo desconhecido nos diferentes meios de cultura

 líquidos e sólidos.

A técnica de inoculação nos meios sólidos foi realizada em manobra asséptica com o
auxílio de uma agulha.

Meios contendo sólidos:

TSI: técnica de inoculação com picada e estiramento e incubação de 24 horas a 36 graus.

Citrato: técnica de inoculação com estriamento e e incubação de 24 horas a 36 graus.

MIO: técnica de inoculação com picada até ⅔ do meio de cultura e incubação de 24

horas a 36 graus.

OF sem óleo é OF com óleo: técnica de inoculação com picada e incubação de 24 horas
a 36 graus. apost

Em todos os meios líquidos a seguir foi utilizado a técnica de inoculação com a alça de
inoculação.

Tubos contendo líquidos:

Glicose, Lactose, Sacarose, Maltose, Frutose, Manitol, Glicina, Lisina, Arginina, Ureia

VM-Após incubação de 24 horas a 36 graus, adicionou-se 1mL de vermelho de metila e foi

analisado visualmente.

VP-Após incubação de 24 horas a 36 graus, adicionou-se 06mL de alfa naftol e 0,2mL de

KOH e foi analisado visualmente.

e Nitrato, SIM- Após incubação de 24 horas a 36 graus, adicionou-se 3 gotas do reagente

Kovacs e foi analisado visualmente.