PROCEDIMENTO OPERACIONAL PADRÃO

INSTRUÇÃO DE TRABALHO/ I.T.L

Revisão: 1 Data: 15/03/2022

I.T.L – LISTERIA MONOCYTOGENES

1 – PRINCÍPIO

Este método tem como objetivo descrever os procedimentos para o ensaio “Determinação de
Coliformes Totais”.

2 – CAMPO DE APLICAÇÃO

Este método aplica-se a análise de água e de todos os alimentos

3 – MATERIAL REQUERIDO PARA ANÁLISE

Preparação da amostra e diluições seriadas:

Diluente: Água peptonada 0,1% (H2Op) ou tampão fosfato pH 7,2 (PB)

Tubos de diluição com 9 ml de água peptonada 0,1% (H2Op) ou tampão fosfato pH 7,2 (PB)

Pipetas de 1 ou 2 mL

Tubos com Caldo Lauril Sulfato Triptose (LST) com tubos de Durham.

Tubos com Caldo Verde Brilhante Bile 2% (VB) com tubos de Durham.

4 – PROCEDIMENTO DE ANÁLISE

Preparação das amostras e diluição seriada:

Diluição Seriadas: a diluição inicial recomendada para maioria das amostras é de 1:10 (10 -1),
adicionando-se m gramas ou mililitros da amostra para 9 x m mililitros do diluente. A ISO 6887-1
(1999) recomenda que, para evitar injurias aos microrganismos por choque térmico, a temperatura
do diluente seja a mesma do ambiente, há situações que o diluente e a diluição inicial são diferentes.
Inoculação: Selecione três diluições adequadas de amostra e inocular uma série de 3 tubos de
Clado Lauril Sulfato Triptose (LST) por diluição, adicionando 1 mL da diluição por tubo com 10
mL de LST.
Observação: na análise de água para consumo humano normalmente é feito o teste de diluição
única: Inocular dez alíquotas de 10 mL da amostra em 10 tubos com 10 mL de LST em
concentração dupla ou 5 alíquotas de 20 mL em 5 tubos com 10 mL LST em concentração tripla.

Incubação: Incubar os tubos de LST a 35±0,5 °C/24±2 h e observar se há crescimento com

produção de gás. Em caso positivo (crescimento e produção de gás), passar aos itens subsequentes.
Em caso negativo (sem crescimento ou sem produção de gás), reincubar até completar 48±2 h e
repeti a leitura, passando para os itens subsequentes em caso de crescimento com produção de gás.

Contagem de coliformes totais: A partir dos tubos de LST com crescimento e produção de gás,
transferir uma alçada bem carregada de cada cultura para tubos de Caldo Verde Brilhante Bile 2%
(VB). Se for observada a presença de película na superfície dos tubos positivos de LST, evitar que
esta película seja transferida para os tubos de VB (os coliformes não formam película).
Incubar os tubos de VB a 35±0,5 °C/24±2 h e observar se há crescimento com produção de gás. Em
caso negativo (sem crescimento ou crescimento sem produção de gás), reincubar até completar
48±2 h e repetir a leitura.
Anotar o número de tubos de VB com crescimento e produção de gás, confirmativos da presença de
coliformes totais. Determinar o Número Mais Provável (NMP)/g ou ml.
 Água (100 mL)

10 ml 10 ml 10 ml 10 ml 10 ml 10 ml 10 ml 10 ml 10 ml 10 ml

35±0,5° C/24 – 48±2 h

Tubos com LST Crescimento e Produção de Gás

Caldo Verde Brilhante Bile 2% (VB)

1 Alçada 35±0,5° C/24 – 48±2 h

Tubos com crescimento e com produção

de gás Confirmados

CONTAGEM DE COLIFORMES TOTAIS

( NMP/ml)
 5 – REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

KORNACKI, J.L. et al. Enterobacteriaceae, coliforms, and Escherichia coli as quality and safety
indicators. In: SALFIINGER, Y. & TORTORELLO, M.L. (eds.). Compendium of Methods for
the Microbiological Examination of Foods, 5th ed. American Public Health Association,
Washington, D.C., 2015.

6. APROVAÇÃO

Elaboração

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Aprovação

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