PROCEDIMENTO OPERACIONAL PADRÃO

INSTRUÇÃO DE TRABALHO/ I.T.L

Revisão: 1 Data: 15/03/2022

I.T.L – ESCHERICHIA COLI

1 – PRINCÍPIO

Este método tem como objetivo descrever os procedimentos para o ensaio “Determinação de
Escherichia coli”.

2 – CAMPO DE APLICAÇÃO

Este método aplica-se a análise de água e de todos os alimentos

3 – MATERIAL REQUERIDO PARA ANÁLISE

Preparação da amostra e diluições seriadas:

Diluente: Água peptonada 0,1% (H2Op) ou tampão fosfato pH 7,2 (PB)

Tubos de diluição com 9 ml de água peptonada 0,1% (H2Op) ou tampão fosfato pH 7,2 (PB)

Pipetas de 1 ou 2 mL

Tubos com Caldo Lauril Sulfato Triptose (LST) com tubos de Durham.

4 – PROCEDIMENTO DE ANÁLISE

Preparação das amostras e diluição seriada:

Diluição Seriadas: a diluição inicial recomendada para maioria das amostras é de 1:10 (10 -1),
adicionando-se m gramas ou mililitros da amostra para 9 x m mililitros do diluente. A ISO 6887-1
(1999) recomenda que, para evitar injurias aos microrganismos por choque térmico, a temperatura
do diluente seja a mesma do ambiente, há situações que o diluente e a diluição inicial são diferentes.
Inoculação: Selecione três diluições adequadas de amostra e inocular uma série de 3 tubos de
Clado Lauril Sulfato Triptose (LST) por diluição, adicionando 1 mL da diluição por tubo com 10
mL de LST.
Observação: na análise de água para consumo humano normalmente é feito o teste de diluição
única: Inocular dez alíquotas de 10 mL da amostra em 10 tubos com 10 mL de LST em
concentração dupla ou 5 alíquotas de 20 mL em 5 tubos com 10 mL LST em concentração tripla.

Incubação: Incubar os tubos de LST a 35±0,5 °C/24±2 h e observar se há crescimento com

produção de gás. Em caso positivo (crescimento e produção de gás), passar aos itens subsequentes.
Em caso negativo (sem crescimento ou sem produção de gás), reincubar até completar 48±2 h e
repeti a leitura, passando para os itens subsequentes em caso de crescimento com produção de gás.

Contagem de E. coli em água:

Método do EC-MUG. De cada tubo de LST com crescimento e produção de gás, inocular uma
alçada em tubos de EC-MUG (caldo E. coli suplementado com0,05 g/l de 4 – metilumbeliferil- β-D-
glicouronídeo). Incubar os tubos a 44,5±0,2 °C/24±2 h e observar os tubos com crescimento sob
lâmpada de luz ultravioleta (6 w), ondas longas (365 a 366 nm). O desenvolvimento de
fluorescência azul indica a presença de E. coli.

Método do Indol. De cada tubo LST com crescimento e produção de gás, inocular uma alçada em
tubos de caldo triptona 1% para teste indol. Incubar os tubos a 44,5±0,2°C/24±2 h e adicionar a
cada tubo (com 3 – 5 ml de cultura) 0,2 a 0,3 ml de reagente de Koavcs par teste de indol. O
desenvolvimento de um anel vermelho violeta na superfície do meio de cultua indica a presença de
E. coli.
Anotar em quantos tubos de caldo LST foi confirmada a presença de E.coli e determinar o Número
Mais Provável (NMP)/g ou ml.
 Água (100 mL)

10 ml 10 ml 10 ml 10 ml 10 ml 10 ml 10 ml 10 ml 10 ml 10 ml

35±0,5° C/24 – 48±2 h

Tubos com LST Crescimento e Produção de Gás

1 alçada

E.coli E.aerogenes

Banho maria

Caldo EC -MUG
Caldo Ec Caldo triptona 1%
Crescimento e gás Teste de indol +

Contagem coliformes Contagem de E.coli

Termotolerantes (NMP/ml
(NMP/ml

Crescimento com gás Fluorescência sob luz UV

Contagem coliformes
Contagem de E.coli (NMP/ml)
Termotolerantes (NMP/ml)
 5 – REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

KORNACKI, J.L. et al. Enterobacteriaceae, coliforms, and Escherichia coli as quality and safety
indicators. In: SALFIINGER, Y. & TORTORELLO, M.L. (eds.). Compendium of Methods for
the Microbiological Examination of Foods, 5th ed. American Public Health Association,
Washington, D.C., 2015.

6. APROVAÇÃO

Elaboração

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Aprovação

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