Escola Superior de Enfermagem de Coimbra

CURSO DE LICENCIATURA EM ENFERMAGEM

1ºAno - 2022/2023

Aulas Teórico-Práticas
de
Microbiologia Clínica

Cumprir regras de higiene e de segurança e de

proteção pessoal.

Executar diferentes técnicas de Microbiologia.

Helena Albano
Susana Alarico
 Microbiologia Clínica

REGRAS BÁSICAS NUM LABORATÓRIO DE MICROBIOLOGIA

Erros humanos e más técnicas podem comprometer as melhores salvaguardas de

proteção de pessoas em laboratórios e ambientes hospitalares. Assim, pessoas
conscientes da importância da segurança e bem informadas sobre a forma de
reconhecer e controlar os eventuais perigos nestes espaços, são “peças”
fundamentais para prevenir infeções, incidentes e acidentes!

Uma boa prática num laboratório consiste nas seguintes regras, procedimentos e
comportamentos:

- Nunca pousar as pastas e peças de vestuário sobre as mesas de trabalho;

- Não levar à boca os dedos, lápis, esferográficas ou quaisquer outros utensílios de

trabalho;

- Respeitar a integridade e a limpeza do material em uso, particularmente os

microscópios;

- Avisar imediatamente o Responsável no caso de derrame acidental de reagentes

ou culturas microbianas, para que sejam tomadas as necessárias
providências;

- Proceder imediatamente ao tratamento adequado, no caso de ferimentos ou

picadas acidentais;

- Arrumar o material no fim de cada trabalho;

- Lavar as mãos no fim de cada trabalho prático e antes de sair da aula.

comportamento cumprimento
responsável das medidas de uso correto do
prevenção equipamento de
conhecimento proteção
dos riscos

Diminuição dos riscos

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 Microbiologia Clínica

Aula Teórico-Prática 1

A - Manuseamento do Microscópio Óptico

1 - Retirar a cobertura de segurança e proteção do microscópio;

2 - Verificar a posição do diafragma e da platina (corrigi-las se necessário) e colocar a

objectiva de menor ampliação no trajeto da luz;

3 - Com a platina na posição inferior colocar a preparação;

4 - Ligar a lâmpada do microscópio;

5 - Adaptar a distância entre as oculares ao observador;

6 - Movimentar a platina com o parafuso macrométrico; observar nas oculares até verificar a
focagem da imagem;

7 - Apenas com o olho direito aberto proceder à focagem da imagem com o parafuso
micrométrico;

8 - Apenas com o olho esquerdo aberto ajustar a imagem a nível da respectiva ocular;

9 - Observando de lado, mudar para um objectiva de maior ampliação;

10 - Com o parafuso micrométrico ajustar a focagem;

Objectiva de imersão Ocular

Revolver
I - Colocar em posição a objectiva de
imersão (100x) e verificar que esta Braço
não toca na preparação;
Objetivas
II - Retirando a objectiva do trajeto da
luz, colocar uma gota de óleo de Platina
imersão na preparação. Voltar a P. macrométrico
Condensador
colocar a objectiva de imersão; P. micrométrico
Parafusos de ajuste de focalização
III - Colocar o diafragma na sua
Fonte luminosa
posição máxima. Ajustar a
intensidade da luz com o botão
regulador. Diminuir a posição do
diafragma de modo a obter maior contraste;

IV - Se for necessário ajustar a focagem, usar com muita precaução o parafuso micrométrico.
Nunca utilizar o parafuso e simultaneamente observar na ocular!

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 Microbiologia Clínica

B- Coloração de Gram (Coloração Diferencial)

A coloração de Gram, desenvolvida em 1884 pelo médico dinamarquês Christian Gram, é o

método de coloração mais aplicado em Bacteriologia. Trata-se de um método de coloração
diferencial, dado que permite subdividir as bactérias em dois grandes grupos:
- Gram+ (Gram positivo), que têm a capacidade de reter o primeiro corante usado (cristal
violeta),
- Gram- (Gram negativo) que não conseguindo reter o primeiro corante, adquirem a cor do
segundo, após a lavagem com o solvente orgânico (álcool).
Este facto deve-se à diferença na espessura da camada de peptidoglicano existente na
parede bacteriana. Assim, a camada espessa das bactérias Gram+, depois de colapsar sob o
efeito desidratante do álcool, não permite a saída do corante, um complexo formado pelo
cristal violeta e pelo iodo; contrariamente a camada fina de peptidoglicano das bactérias
Gram- mesmo colapsada não evita a saída do corante ficando a célula incolor. Por outro
lado o álcool tem um efeito tipo detergente destruíndo a membrana externa das bactérias
Gram-, o que contribui também para a célula perder facilmente o primeiro corante. Assim
usa-se um segundo corante contrastante, fucsina diluída ou safranina para evidenciar estas
células.

Procedimento Experimental:

Objectivo:
Identificação da constituição da Parede Celular de diferentes bactérias através da
coloração de Gram

Procedimento:

1. Identificar a lâmina;
2. Colocar uma gota de água no centro da lâmina;
3. Com uma ansa retirar um pouco de uma cultura pura (grandes quantidades têm efeitos
negativos na visualização) e colocar na gota de água;
4. Com ansa, estender a gota de suspensão sobre a lâmina, obtendo assim um esfregaço
fino;
5. Deixar secar ao ar 30 a 60 segundos;

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 Microbiologia Clínica

6. Segurar a lâmina com a mão ou com uma pinça;

7. Passar rapidamente a lâmina pela chama para fixar o material (repetir 3
vezes, não aquecer demasiado para não alterar a forma das bactérias);
8. Colocar a preparação num suporte e cobrir a área do esfregaço com
algumas gotas de Cristal de Violeta. Deixar atuar durante 1 min;
Depois deste passo as bactérias ficam coradas de violeta
9. Lavar com água destilada;
10. Colocar algumas gotas de Reagente de Lugol (solução iodada). Deixar
atuar durante 1 min;
O iodo do reagente de Lugol liga-se ao violeta de cristal. O complexo
formado é mais difícil de remover. As bactérias ficam violeta escuro

11. Lavar com água destilada;

12. Colocar umas gotas de Álcool 95% durante uns segundos;
Neste passo, o álcool dissolve os lípidos da membrana externa das
bactérias Gram-negativo e estas perdem o complexo cristal violeta-iodo,
ficando incolores. As bactérias Gram-positivo retêm o complexo violeta de
cristal-iodo, porque a camada de peptidoglicano atua como uma barreira.
As bactérias ficam coradas de violeta escuro.

13. Lavar com água destilada;

14. Colocar umas gotas de Safranina e deixar actuar durante 1 min;
Neste passo, as bactérias incolores ficam coradas de cor-de-rosa (cor da
safranina, também chamada contra-corante).

15. Lavar com água destilada e deixar secar;

16. Observar ao Microscópio Óptico. Usar a Objectiva de imersão (x100);
Não esquecer colocar o óleo de imersão!
17. Limpar a objetiva, retirar o excesso de óleo com papel e de seguida passar com álcool.

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Gram Positivas Gram Negativas

Fixação
Fixação

Violeta de Cristal
Violeta de
Violeta de Cristal
Cristal

Iodo

Descoloração

Safranina

Membrana Externa
Peptidoglicano LPS

Membrana Plasmática

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Aula Teórico-Prática 2

Curva de Crescimento e Fatores de Crescimento

A. CURVA DE CRESCIMENTO BACTERIANO

Crescimento Bacteriano: aumento do número total de células devido à divisão celular dos
organismos individuais na cultura – FISSÃO/DIVISÃO BINÁRIA

• Uma única célula bacteriana de uma população, ao dividir-se por Fissão/divisão

Binária, origina 2 células bacterianas geneticamente iguais.

Tempo de geração (td)

Tempo necessário para que ocorra uma geração, isto é, formação de 2 células filhas a
partir de uma célula mãe. O td é influenciado pela composição nutricional do meio e pelas
condições ambientais: pH, temperatura, etc.

(NOTA: Cada geração tem o dobro de células da geração precedente)

Taxa de crescimento () – número de gerações, por hora

Depende:
1. da espécie bacteriana
2. da composição em nutrientes do meio de cultura
3. das condições físico-químicas de crescimento

Ex. Escherichia coli

td = 30 min (em condições ótimas de crescimento: pH, temperatura, meio de cultura rico)
td’ = 12h (por exemplo, em meio de cultura pobre em nutrientes)

Crescimento Bacteriano num sistema fechado

• Crescimento bacteriano num sistema fechado significa que, após inoculação, não se
volta a inocular o meio de cultura, nem se adiciona ou retira meio de cultura,
durante a monitorização do crescimento.

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 Microbiologia Clínica

• Pode observar-se o crescimento pela medição do aumento da população bacteriana,

em intervalos de tempos regulares – Curva de Crescimento

Figura: Curva de crescimento bacteriano

1- Fase “Lag” ou Latência

2- Fase “Log” ou Exponencial
3- Fase Estacionária
4- Fase de Lise ou Morte

1. Fase “Lag” ou Latência – fase de adaptação das bactérias ao meio de cultura, sem
ocorrer divisão bacteriana
2. Fase “Log” ou Exponencial – elevada atividade metabólica e fisiológica das células
bacterianas. A taxa de crescimento é máxima ( =  Max), no entanto, nesta fase algumas
espécies de bactérias são mais sensíveis aos antibacterianos.
Na fase Exponencial:  =  Max
3. Fase Estacionária – ocorre a paragem do crescimento devido:
- Exaustão dos nutrientes
- Acumulação de produtos tóxicos do metabolismo bacteriano
4. Fase de Lise ou Morte – o número de células viáveis diminui, com perda irreversível da
capacidade de divisão celular.

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 Microbiologia Clínica

B. FATORES QUE AFETAM O CRESCIMENTO BACTERIANO

O meio ambiente exerce uma forte influência sobre as bactérias, tal como sobre outros
microrganismos e outras formas de vida. Esses efeitos podem ser agrupados em:
• Físicos:
- Temperatura
- Pressão osmótica
- pH
- Potencial redox
• Químicos:
- Nutrientes
- Resposta a produtos tóxicos
• Biológicos:
- Influência de espécies coexistentes

1. Efeito da temperatura:
As bactérias não possuem nenhum mecanismo de controlo e regulação da temperatura da
célula, assim a sua temperatura é a temperatura do meio ambiente.
Como resposta a temperaturas adversas ao seu crescimento, as bactérias param a sua
atividade enzimática sem necessariamente ocorrer a sua morte.
Diferentes espécies de bactérias, apresentam diferentes exigências no que diz respeito à
temperatura de crescimento, isto é, existe um valor máximo de temperatura, acima do qual
a bactéria não se desenvolve e um valor mínimo de temperatura abaixo da qual também
não ocorre crescimento. O crescimento ocorre dentro de certos limites e o valor da taxa de
crescimento mais elevado corresponde à temperatura ótima de crescimento.

óptimo

Temperatura

Psicrófilos: 4 -10 C

Mesófilos: 10 - 50 C

Termófilos: 50 - 70 C

Hipertermófilos: 70 – 110ºC

mínimo máximo

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 Microbiologia Clínica

A influência da temperatura no crescimento bacteriano, está relacionada com a influência

da temperatura nas reações enzimáticas que ocorrem dentro das células.
- Com a diminuição da temperatura as reações enzimáticas abrandam, pelo que
abranda também o crescimento.
- À temperatura de congelação o metabolismo cessa, não só porque a atividade
enzimática pára, mas também porque não existe água disponível.
- Com o aumento da temperatura acima da temperatura ótima de crescimento, a
atividade metabólica dentro da célula aumenta, mas ao mesmo tempo ocorre a
desnaturação das enzimas, levando à morte das células.

2. Efeito da pressão osmótica:

Pressão osmótica: pressão que se cria dentro da célula devido à diferença de concentrações
de metabolitos ou solutos dentro e fora da célula
A concentração de um metabolito/soluto no meio, influencia a quantidade de água
disponível para as bactérias, podendo afetar o seu crescimento e até a sua sobrevivência. A
quantidade de água disponível é medida pela atividade da água (aW). A água pura tem uma
atividade da água de 1, outras soluções terão aW inferior a 1.
Quando uma bactéria é colocada num meio de cultura, é exercida uma pressão osmótica
sobre a membrana semipermeável que envolve a célula. As bactérias desenvolvem-se
melhor em meios com uma pressão osmótica ligeiramente inferir à sua.

Pressão osmótica
halófilos: necessitam de elevada concentração de
sal no meio

sacarófilos: necessitam de elevada concentração

de açúcar no meio

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3. Efeito do pH:
A maioria dos microrganismos tem uma concentração de iões H+ ótima para o seu
desenvolvimento, embora cresçam numa zona de pH bastante ampla.
A maior parte dos ambientes naturais têm valores de pH entre 5 e 9, o que é favorável ao
crescimento da maioria dos microrganismos.
Relativamente ao fator pH, os microrganismos dividem-se em três grandes grupos:

pH Acidófilos: pH 1.8 - 5
Neutrófilos: pH 5 - 9
Alcalófilos: pH 9 -11

4. Relação entre o oxigénio livre e o crescimento bacteriano:

- Uma bactéria que necessite de oxigénio é denominada de aeróbia
- Uma bactéria cujo crescimento é inibido por oxigénio é denominada de anaeróbia
- Uma bactéria capaz de crescer em condições aeróbias ou anaeróbias é denominada
aeróbia ou anaeróbia facultativo.
- Uma bactéria que necessite de baixas concentrações de oxigénio livre é denominada
microaerofílica.

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Oxigénio
Aeróbios: crescem apenas na presença de oxigénio

Anaeróbios: crescem apenas na ausência de oxigénio

Facultativos: crecem tanto na ausência como na presença de oxigénio

CO2 Capnófilos: requerem uma concentração elevada de CO2 (ex: Neisseria)

C. MEIOS DE CULTURA

Um meio de cultura pode ser definido como uma preparação líquida ou sólida usada
para o crescimento, transporte e preservação de microrganismos em laboratório. Para ser
efetivo deve conter os nutrientes necessários ao crescimento do microrganismo em
questão, sendo que, meios específicos são bastante importantes para a identificação,
isolamento e estudos acerca de um determinado microrganismo.
O conhecimento do habitat de uma bactéria permite uma aproximação da
reconstituição do meio de cultura.

Classificação dos meios de cultura quanto à composição

• Meios sintéticos:
Estes meios são quimicamente definidos, já que todos os seus componentes são conhecidos.
São usados em culturas de microrganismos que conseguem crescer em meios relativamente
simples contendo CO2 como fonte de carbono (sob a forma de Na2CO3 ou HCO3-), nitrato ou
amónia como fonte de azoto, sulfato, fosfato e outros minerais (Tabela 1). Alguns
organismos podem crescer em meios constituídos apenas por glucose como fonte de
carbono e sais de amónia como fonte de azoto.

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 Microbiologia Clínica

Tabela 1 – Exemplo de um meio de cultura sintético

Meio de Cultura Sintético

Substância Função Quantidade

Glucose Fonte Carbono e Energia 1g

NH4PO4 Fonte de Azoto; Tampão 5g

K2HPO4 Fonte de Fósforo; Tampão 1g

NaCl Sal Inorgânico 5g

MgSO4.7H2O Fonte de Magnésio e Enxofre 0,2 g

Água destilada Solvente; Fonte de Hidrogénio 1000 mL

• Meios complexos:
Ao contrário dos meios sintéticos, estes são constituídos por substâncias acerca das quais
não se conhece a composição química exata, por exemplo: a peptona – frações de proteínas
hidrolisadas contendo, por isso, aminoácidos e péptidos resultantes da digestão proteolítica
de fontes de proteínas; extratos de carne – contêm aminoácidos, nucleótidos, minerais,
vitaminas; e extratos de leveduras – fontes de vitamina B assim como de compostos
carbonados e nitrogenados.
Exemplo de meios complexos mais comuns: o caldo nutritivo (Tabela 2), o caldo de soja
tríptica e o Agar MacConkey (Tabela 3).

Tabela 2 – Constituição de um meio complexo

Caldo Nutritivo Vulgar

Substância Função Quantidade

Extracto de carne Fonte de péptidos, glícidos e vitaminas 3g

Peptona Fonte de péptidos e aminoácidos 5g

NaCl Mantém equilíbrio osmótico 5g

Água Solvente; Fonte de Hidrogénio 1000 mL

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• Meios enriquecidos:
Meios aos quais são adicionados, por exemplo, sangue, soro, albumina do ovo ou outras
substâncias nutritivas, cujo objectivo é promoverem o desenvolvimento de bactérias mais
sensíveis ou bactérias de crescimento lento (bactérias fastidiosas).

Classificação dos meios de cultura quanto ao estado físico

Os meios podem ser classificados como líquidos, sólidos ou semi-sólidos. Quando se

deseja um meio sólido, adiciona-se ao meio líquido cerca de 1,5 % de agar – polímero
sulfatado composto principalmente por D-galactose, 3,6-anidro-L-galactose e ácido D-
glucorónico, extraído das algas vermelhas. O agar não é degradado pelas bactérias, salvo
raras exceções. Na preparação de meios semi-sólidos acrescentam-se menores quantidades
de agar, normalmente, metade da quantidade usada nos meios sólidos, isto é cerca de 0.7%

Classificação dos meios de cultura quanto à função

• Meios seletivos:
Como o próprio nome indica, estes meios promovem o crescimento de uma espécie
específica. Por exemplo, os sais biliares ou corantes como a fucsina e o cristal violeta inibem
o crescimento das bactérias Gram+ não afetando, no entanto o desenvolvimento das Gram-.

• Meios diferenciais:
São meios que permitem a distinção entre diferentes tipos de bactérias, permitindo
identificar determinado microrganismo de acordo com as suas características biológicas,
fenotípicas ou bioquímicas.

• Meios enriquecidos:
Permitem o crescimento, em placas com meio de cultura, de bactérias mais sensíveis ou
bactérias de crescimento lento (bactérias fastidiosas), as quais sem determinados
substâncias no meio de cultura, como por exemplo, sangue, soro, etc. não conseguiriam
crescer.

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 Microbiologia Clínica

Exemplo 1: Meio Agar MacConkey (Figura 1 e Tabela 3)

É um meio seletivo e diferencial! Como contém lactose, as colónias que fermentam a lactose
surgem rosadas (durante a fermentação de lactose há produção de ácido láctico o que,
consequentemente, altera o pH do meio resultando na observação de colónias rosa
choque/vermelhas). As bactérias que não fermentam a lactose utilizam a peptona levando à
formação de amónia, que eleva o pH do meio (surgem colónias brancas/sem cor e observa-
se mudança de cor do meio). A presença de sais biliares e do cristal de violeta confere-lhe
características de meio seletivo, pois apenas crescem neste meio bactérias Gram-.

Figura1: Meio Agar MacConkey. Cultura de uma bactéria que fermenta a lactose
(esquerda) e cultura de uma bactéria que não fermenta a lactose (direita).

Tabela 3 – Constituição do Meio Agar MacConkey

Meio de MacConkey

Substância Função Quantidade

Digesto pancreático de gelatina Fonte péptidos e aminoácidos 17 g

Digesto pancreático de caseína Fonte péptidos e aminoácidos 1,5 g
Digesto de carne animal Fonte péptidos, vitaminas e nucleótidos 1,5 g
Lactose Indicador diferencial 10 g
Sais biliares Inibidor gram-positivas 1,5 g
NaCl Mantém equílibrio osmótico 5g
Vermelho neutro Indicador pH 0,03 g
Cristal violeta Inibidor gram-positivas 0,001 g
Agar Agente solidificante 14 g
Água destilada Solvente; Fonte de Hidrogénio 1000 mL

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Exemplo 2: Agar Sangue/Meio Columbia: enriquecido e diferencial.

Este meio é diferencial porque permite a distinção entre

bactérias hemolíticas e não hemolíticas. As hemolíticas
produzem halos à volta das suas colónias como resultado
da destruição das hemácias (hemólise) e enriquecido
porque o meio contém sangue de carneiro (eritrócitos
íntegros), favorecendo um crescimento rápido.

Streptococcus pyogenes

-hemólise -hemólise γ-hemólise

hemólise total hemólise incompleta não-hemolíticas
(colónias cor castanha)
Staphylococcus aureus Enterococcus faecalis
Staphylococcus epidermidis

Exemplo 3: Meio Agar Chocolate

É um meio não-seletivo porque crescem

praticamente todo o tipo de bactérias, e é um meio
enriquecido, porque tem na sua composição sangue
de cavalo lisado (eritrócitos lisados por aquecimento
a 80ºC) permitindo, em particular, o crescimento de
bactérias “exigentes” do trato respiratório

Haemophilus influenzae

Bactéria que necessita de fatores de crescimento:

NAD, hemina e hematina, que existem no
interior dos eritrócitos)

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 Microbiologia Clínica

Aula Teórico-Prática 3

DNA Genómico Bacteriano

A área da biologia que estuda os organismos do ponto de vista molecular, focada

principalmente na base de todos organismos, os ácidos nucleicos - RNAs e DNA é a biologia
molecular.

A biologia molecular visa compreender e estudar os processos de replicação, transcrição,

tradução do material genético, assim como as regulações desses processos e seus possíveis
erros e características.

Exemplo de aplicações da biologia molécular são as análises com recurso a diferentes

técnicas e tecnologias, utilizadas na identificação de agentes patogénicos (bactérias, vírus,
fungos, ...) em amostras biológicas (urina, expectoração, etc.) colhidas de pessoas para
diagnóstico de uma infeção e, também a determinação de contaminações por
microrganismos em diferentes matrizes como alimentos, superfícies, animais de produção,
etc., com importância fundamental no controle de qualidade de indústrias, empresas
alimentares e de atividade agropecuária.

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 Microbiologia Clínica

Procedimento Experimental:

Objectivo
Extração de DNA Genómico bacteriano

Material
Culturas puras de bactérias
SDS 10% (dodecil sulfato de sódio)
Tampão TE (Tris-EDTA, Tris-HCl 10 mM, pH 8,0; EDTA 1 mM)
Etanol absoluto
Tubos de microcentrífuga Eppendorf (Epp)
Ansas estéreis

Procedimento (Extração de DNA)

1 – Recolher com uma ansa um pouco da cultura da bactéria e ressuspender em 625 μL de

tampão TE. Fechar o tubo Epp e ressuspender por inversão do tubo na mão várias vezes,
suavemente, até a suspensão ficar homogénea.

2 - Adicionar 75 μL de SDS. Inverter como no passo anterior e deixar incubar durante cerca
de 20 minutos, com agitação ocasional do tubo.

3 - Adicionar 1.25 mL de etanol (adicionar etanol no dobro do volume do tampão TE), agitar
suavemente invertendo o tubo suavemente algumas vezes.
Nota: Imediatamente será possível ver o DNA precipitado, de cor branca e aspecto viscoso.

4 - Retirar o DNA precipitado no tubo com uma ansa estéril para um novo tubo Epp.

5 – Deixar o etanol evaporar ao ar e quando o DNA estiver seco, ressuspender em cerca de

50-100 μL de tampão TE. Agitar suavemente até o DNA ficar totalmente dissolvido.
Nota: A solução ficará bastante viscosa, tanto mais viscosa quando maior for a quantidade
de DNA extraído.

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Aula Teórico-Prática 4

Estudo do Efeito de Agentes Antibacterianos no

Crescimento de Bactérias

Um Antibiótico (do grego αντί - anti + βιοτικός - biotikos, "contra um ser vivo"/ “anti-vida”) é
qualquer substância capaz de combater uma infeção causada por uma bactéria e que,
portanto, elimine a bactéria ou iniba a multiplicação da mesma, facilitando o trabalho do
sistema imunitário no controle da infeção.
Um antibiótico pode ser preparado, em laboratório, por síntese química ou ser produzido
por microrganismos [por ex: Penicillium chrysogenum (fungo filamentoso produtor da
penicilina) ou Streptomyces (bactéria produtora da estreptomicina)]. Assim, quando um
antibiótico é adicionado a uma cultura bacteriana em crescimento exponencial, podem
observar-se dois tipos de efeito:

Efeito bacteriostático – quando há inibição do crescimento mas não há morte celular

(ex: tetraciclina, cloranfenicol, eritromicina).

Efeito bactericida - quando há morte das células e se a morte for causada por lise celular é
designado por Efeito bacteriolítico (ex: penicilina, vancomicina).

CLASSIFICAÇÃO DOS ANTIBIÓTICOS:

Quanto à natureza

Naturais - produzidos a partir do metabolismo secundário de organismos vivos (na maioria

microrganismos) como forma de inibir o crescimento ou mesmo de destruir outros
organismos concorrentes, mesmo em baixas concentrações.
São sintetizados principalmente por fungos filamentosos (ex. penicilina), bactérias (ex.
bacitracina) ou actinomicetos (ex. estreptomicina).

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 Microbiologia Clínica

Semi-sintéticos - são antibióticos naturais, modificados (em laboratório) pela adição de

grupos químicos, tornando-os menos suscetíveis à inativação pelos microrganismos
(ampicilina, carbencilina, meticilina).

Sintéticos – são substância sintetizadas em laboratórios farmacêuticos.

Exemplos: Sulfonamidas, Trimetroprim, Cloranfenicol, Isoniazida além de outros antivirais e
antiprotozoários

Quanto ao espectro de ação

Espectro amplo – quando o antibiótico tem efeito sobre um número elevado de grupos de
bactérias.
Espectro restrito - quando o antibiótico tem efeito sobre um grupo restrito de bactérias ou
sobre uma bactéria específica.

Tabela 5. Exemplos de diferentes antimicrobianos, classificadas de acordo com o espectro

de ação (Adaptado de Madigan et al., Brock Biology of Microorganisms, 2003)

ANTIBIOGRAMA
Teste de sensibilidade aos antibióticos

Antibiogramas são bio-ensaios conduzidos “in vitro” que visam testar a sensibilidade de
bactérias aos antibióticos.
A suscetibilidade aos antibióticos pode ser classificada qualitativamente como sensível,
intermediário ou resistente; ou quantitativamente em termos de MIC (minimun inhibitory

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concentration - concentração mínima inibitória) ou MBC (minimun bactericidal

concentration - concentração mínima bactericida).

1 - Teste Quantitativo da sensibilidade aos antibióticos - Método das diluições:

Consiste em preparar sucessivas diluições dos antibióticos em meio sólido ou líquido e em
seguida semear a bactéria em estudo. Após incubação determina-se MIC e/ou MBC.

2 - Método de difusão de Kirby-Bauer (Qualitativo):

Segundo este método, o antibiótico é impregnado num disco de papel e é colocado na
superfície do agar previamente semeado (de forma uniforme) com a cultura da bactéria a
testar. Durante o período de incubação, o antibiótico vai difundir-se no agar sendo a sua
concentração menor à medida que se vai afastando do ponto de partida, sendo a atividade
antibacteriana detetada por uma zona de inibição em volta do disco. Forma-se então um
halo de inibição em volta do disco, o qual será maior ou menor conforme a sensibilidade da
bactéria ao antibiótico em questão. Regista-se a eficácia relativa de cada antibiótico
medindo o diâmetro das zonas de inibição em milímetros e comparado com tabelas
padronizadas.

OBS:
O Método Kirby-Bauer não é só aplicado a antibióticos, pode também ser usado para medir
a sensibilidade de um microrganismo a outros agentes químicos – desinfetantes ou
antissépticos.

Antibiogramas

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 Microbiologia Clínica

Tabela 4: Tabela de Halos de Susceptibilidade (Exemplo)

Halos de Inibição (mm)
Antibiótico Código [µg]
Moderadamente
Resistente Intermediário Sensível
sensível

Bacitracina BAC 10 <8 9 a 12 - > 13

Cefotaxima CTX 30 < 14 - 15 a 22 > 23

Gentamicina GEN 10 < 12 13 a 14 - > 15

Tetraciclina TET 30 < 14 15 a 18 - > 19

Vancomicina VAN 30 <9 10 a 11 - > 12

Mais recentemente foi criado um método de difusão em

agar, nas condições descritas acima, que permite avaliar a
CMI (Concentração Mínima Inibitória – mg/L) de cada
antibiótico contra a estirpe bacteriana em ensaio. Trata-se
do –teste (Epsilon-teste), em que se usa uma tira de
plástico impregnada com um gradiente de antibiótico,
tornando possível determinar a CMI pela linha de
intersecção do crescimento bacteriano com a respectiva tira.

Relativamente à associação de antibióticos podem ocorrer duas situações:

1. Sinergismo - a combinação de certos antibióticos pode ter um efeito na atividade de tal

modo que, o efeito total resultante é superior à soma das duas atividades quando medidas
separadamente.
2. Antagonismo - a combinação de certos antibióticos pode ter um efeito na atividade de tal
modo que, o efeito total resultante é menor do que a soma das atividades dos dois
antibióticos medidos separadamente.

ESEnfC 1º Ano - 2022/2023 22

 Microbiologia Clínica

Procedimento Experimental:
Objetivo
Determinar a suscetibilidade de algumas bactérias a diferentes antibacterianos, usando o
método de Kirby-Bauer

Material
• Discos de antibióticos • Culturas puras de microrganismos
• Zaragatoas • Placas de meio de cultura TSA
• Pinças (Triptona Soja Agar)

Procedimento (Antibiograma)
1. Introduzir uma zaragatoa no tubo com a cultura pura e espalhar em toda a superfície da
placa (com TSA). Deixar secar aproximadamente 15 minutos.
2. Colocar os discos dos antibióticos, com a ajuda de uma pinça (passada por álcool e
flamejada), sobre a superfície da placa já com bactéria.

3. Incubar numa estufa a 37ºC durante 16 a 18 horas – Não inverter as placas.

4. Após incubação, observar e medir os halos de inibição dos diferentes antibióticos.

5. Interpretar os resultados obtidos e analizar a eficácia relativa de cada antibiótico –

analisar com base na tabela fornecida.
(Nota: A eficácia relativa de cada antibiótico está relacionada com o diâmetro do halo de
inibição em volta do disco).

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 Microbiologia Clínica

Tabela 1: Tabela de interpretação dos resultados dos antibiogramas para E. coli.

Antibiótico Código (μg) Halos de inibição (mm)

Resistente Intermediário Sensível
Penicillina G10 Pen G 10 U NA* NA* NA*
Tetracyclina 30 Tet 30 ≤ 11 12 - 14 ≥ 15
Gentamicina 10 Gent 10 ≤ 12 13 - 14 ≥ 15
Sulfametoxazol/Trimetropin SXT 25 ≤ 10 11 - 15 ≥ 16
SXT 23.75 /1.25
Vancomycin 30 Van 30 NA* NA* NA*
Imipenem 10 IMP 10 ≤ 19 20 - 22 ≥ 23
Oxacilina Ox 1 NA* NA* NA*
* Não aplicável

Tabela 2: Tabela de interpretação dos resultados dos antibiogramas para S. aureus.

Antibiótico Código (μg) Halos de inibição (mm)

Resistente Intermediário Sensível
Penicillina G10 Pen G 10 U ≤ 28 - ≥ 29

Tetracyclina 30 Tet 30 ≤ 14 15 - 18 ≥ 19

Gentamicina 10 Gent 10 ≤ 12 13 - 14 ≥ 15

Sulfametoxazol/Trimetropin SXT 25 NA* NA* NA*

SXT 23.75 /1.25

Vancomycin 30 * Van 30 - - ≥ 17- 21

Imipenem 10 IMP 10 ≤ 13 14 - 15 ≥ 16

Oxacilina OX 1 ≤ 10 11 – 12 ≥ 13
≤ 17** - ≥ 18
*Para verificação da sensibilidade do S. aureus à vancomicina, os resultados não são fiáveis pelo método de difusão em
disco para valores ≤ 17-21 µg/mL
** para Staphylococcus não produtores de coagulase

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Aula Teórico-Prática 5
Procedimento Experimental 1:

Ação de antisséticos sobre a microbiota das mãos

Objetivo:
Testar a eficácia do uso antisséticos na desinfeção das mãos

1 - Dividir uma placa de Petri contendo meio de cultura em 4 partes iguais, utilizando uma
caneta de acetato (Atenção: a marcação com a caneta é feita na parte de baixo da placa);

2 - Identificar cada quadrante com os respetivos títulos:

• Controle (C),
• Mão Suja (MS),
• Detergente (Det), C MS
• Álcool Etílico (A).
Det A
Deve ser preparada 1 placa por grupo
seguindo o esquema ao lado

3 - No quadrante identificado como “MS” deve encostar o dedo (sem lavar) no agar, durante
1 minuto;

4 - A seguir, deve lavar as mãos com detergente, secá-las ao ar e encostar o mesmo dedo no
quadrante do agar identificado como “Det”, durante 1 minuto;

5 – Por último deve lavar as mãos com álcool, secá-las ao ar e encostar o mesmo dedo no
quadrante do agar identificado como “A”, durante 1 minuto;

6 - Incubar uma das placas de Petri numa estufa a 30ºC;

OBS: Não deve encostar nada no quadrante identificado como “C”;

7- Ao fim de 24h, caso apareçam colónias nos quadrantes, proceder à sua contagem e
registo;

8 – Verificar se os resultados obtidos estão de acordo com os resultados esperados. Caso

sejam discordantes, registar comentários e/ou sugestões;

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Procedimento Experimental 2:

Pesquisa de Microrganismos do Microbioma Humano

Um indivíduo saudável convive harmoniosamente com o seu microbioma - total de

comunidades estáveis de microrganismos dos diferentes locais do corpo humano,
juntamente com os seus genes e que se estabelece (coloniza) em determinados locais do
corpo desde o nascimento. A microbiota humana – comunidade específica de
microrganismos nos diferentes locais do corpo humano - protege o corpo contra os
microrganismos causadores de doença e, geralmente, quando a microbiota é alterada,
rapidamente recupera e consegue estabelecer-se novamente. Porém, se tal não acontecer
por determinados motivos, a pessoa poderá desenvolver algumas patologias.
Lactobacillus, por exemplo, são microrganismos que vivem no intestino dos indivíduos,
consomem uma grande quantidade de produtos lácteos que são ingeridos e protegem
contra microrganismos invasores e infeciosos. Fatores, como por exemplo: dieta, condições
sanitárias, poluição do ar e hábitos de higiene, influenciam as espécies que compõem a
microbiota intestinal de um indivíduo.
No entanto, sob certas condições, os microrganismos que fazem parte da microbiota
residente podem causar doença – são chamados patogénicos oportunistas. Por exemplo, a
bactéria Streptococcus pyogenes pode habitar a garganta sem causar danos mas quando
ocorre um enfraquecimento das defesas do organismo pode causar a faringite streptocócica
(infecção da garganta). Do mesmo modo, outros microrganismos que fazem parte da
microbiota residente podem tornar-se invasores, causando doença em indivíduos cujas
barreiras de defesa foram destruídas. Por exemplo, os indivíduos com cancro do cólon são
vulneráveis à invasão por microrganismos que habitam normalmente o intestino. Estes
microrganismos podem deslocar-se através do sangue e infectar as válvulas cardíacas.

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 Microbiologia Clínica

Objetivo:

Isolar microrganismos residentes no corpo humano

Procedimento

Cavidade Nasal (Pesquisa de Staphylococcus aureus)

1. Acenda a lamparina antes de iniciar as operações;

2. Pegue numa zaragatoa esterilizada e embeba a ponta em soro fisiológico estéril,

escorrendo-a nas paredes do tubo;

3. Introduza a zaragatoa no nariz o mais profundo que conseguir, e rode-a nos dois sentidos;

4. Retire a zaragatoa do nariz e perto da chama, toque com ela no canto de uma placa de
Petri com meio Manitol Salt Agar (MSA);

5. Faça o isolamento com a ansa a partir da zona contaminada;

6. Incubar a 37º C durante 24 horas;

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Mãos – Superfície da pele

1. Passar uma zaragatoa estéril, e previamente humedecida em soro fisiológico estéril, na

zona interdigital dos dedos da mão ou junto às unhas;

2. Toque com a zaragatoa numa placa de MSA, TSA e MacConkey;

3. Faça o isolamento com uma ansa a partir da zona contaminada;

4. Incubar o os meios a 37ºC durante 24 horas.

Procedimento Experimental 3:

Pesquisa de Microrganismos em objetos de uso pessoal

1. Passar uma zaragatoa estéril, e previamente humedecida em soro fisiológico estéril, no

objeto escolhido numa área de ~ 5cm x 5cm (telemóvel, canetas, estojos, batas, tesoura,
cartão, etc...)

2. Toque com a zaragatoa numa placa de TSA;

3. Faça o isolamento com uma ansa a partir da zona contaminada;

4. Incubar o meio a 37ºC durante 24 horas.

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Aula Teórico-Prática 6

Fungos e Parasitas

FUNGOS
Os fungos são microrganismos eucariotas, quimio-organo-heterotróficos, encontram-se em
grande número na natureza e desempenham um papel fundamental como decompositores
da matéria orgânica. Podem ainda associar-se por simbiose com algas e formar os líquenes e
com plantas do solo formando micorrizas.
Os fungos podem ser benéficos para o homem através da produção de antibióticos como a
penicilina e na fermentação e maturação de alguns alimentos como o queijo. Os fungos são
também responsáveis pela deterioração de materiais como os têxteis e madeira; produzem
toxinas, como a aflatoxina entre outras e, podem ser ainda patogénicos para o homem,
plantas e animais.
Fungos leveduriformes - leveduras - unicelulares
Fungos filamentosos – pluricelulares
Fungos dimorfos (espécies patogénicas)
ex: À temperatura ambiente, desenvolvem-se como um bolor/fungo filamentoso
À temperatura corporal, desenvolve-se como uma levedura.

PARASITAS
A Parasitologia é uma área importante dentro das infeções que afetam o Homem. O
conhecimento dos parasitas patogénicos, dos síndromes clínicos que causam é fundamental
no tratamento e manipulação dos doentes. O diagnóstico laboratorial neste âmbito
tem particular ênfase dadas as particularidades destes agentes patogénicos.
Para diagnosticar uma parasitose podemos empregar métodos diretos (identificação e
isolamento do parasita) e métodos indiretos (exames serológicos para pesquisa de
anticorpos e eosinofilia).
Existem parasitoses intestinais, vasculares e musculares, utilizando-se para o seu diagnóstico
os seguintes métodos diretos, com exames macroscópicos e microscópicos:

• Exame parasitológico de fezes e coprocultura parasitológica

• Pesquisa de ovos de Oxiuros vermicularis.

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 Microbiologia Clínica

• Biópsias musculares (Trichinela spiralis)

• Biópsias rectais (Schistosoma mansoni)
• Exame parasitológico de urina (Schistosoma haematobium)
• Exame parasitológico de exudato vaginal (Trichomonas vaginalis)
• Exame parasitológico do sangue.

Procedimento Experimental:

Observação Macro e Microscópica de Fungos e Parasitas

- Rever aula TP1 sobre manuseamento do microscópio ótico;

- Observação de colónias de fungos ambientais em placas de Petri;

(Nota: a morfologia das colónias de fungos são bastante distintas das colónias de bactérias)

- Observação macro e microscópica de parasitas vivos, protótipos de parasitas ou

preparações definitivas, consoante disponibilidade.

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