Curso Multidisciplinar para Graduandos em Saúde da Universidade

Anhanguera/SP – Polo República.

Módulo: Microbiologia Clínica/Microscopia – Bacterioscópico.

Prof. : Ricárdo Mello - Biólogo/Biomédico

• Especialista Pós Graduado em Imunologia .
• Especialista Pós Graduado em Hematologia.
• Atualmente, Prof. e Assistente de Coordenação nos Cursos de
Graduação em Saúde da Universidade Anhanguera – Polo República
 Técnicas de
Visualização de microrganismos
 Microscopia e técnicas de
visualização de microrganismos
PREPARAÇÕES PARA A MICROSCOPIA E TÉCNICAS DE
VISUALIÇÃO DE MICRORGANISMOS:

A perfeita visualização dos microrganismos e/ou das suas

estruturas só é possível se, além da escolha do tipo mais eficiente
de microscopia, a preparação estiver adequada.

A escolha do tipo de preparação depende da informação desejada e

do microrganismo a ser avaliado.
 Microscopia e técnicas de
visualização de microrganismos
TÉCNICA A FRESCO:

 células, pequenos organismos vivos ou fragmentos de tecidos

vivos  meio líquido o mais próximo possível do meio natural

Conservadores fisiológicos

Naturais Artificiais
água doce, água do mar, soro fisiológico, líquido de
humor aquoso, soro Ringer, líquido de Knop
sanguíneo, líquido
amniótico
 Microscopia e técnicas de
visualização de microrganismos
TÉCNICA A FRESCO:

 Vantagem:
 não produz modificações na forma e função
 serve de contraprova para outros métodos
 rapidez

 Restrições:
 objetos finos e transparentes
 não permite observações prolongadas
 mostra parte dos detalhes das estruturas

 Modo de preparo
 lâmina com lamínula
 gota pendente
 Microscopia e técnicas de
visualização de microrganismos
TÉCNICA A FRESCO:
 Microscopia e técnicas de
visualização de microrganismos
TÉCNICAS FIXADAS E CORADAS:

 Morfologia de células mortas

Etapas:

Esfregaço Fixação Coloração

Simples ou diferencial
 Microscopia e técnicas de
visualização de microrganismos
TÉCNICAS FIXADAS E CORADAS:

 Coloração simples
 Microscopia e técnicas de
visualização de microrganismos
TÉCNICAS FIXADAS E CORADAS:

 Coloração diferencial – Coloração de Gram

Escherichia coli Sthaphylococcus sp

Salmonella sp Clostridium sp
Shigella sp Pseudomonas sp
Enterobacteriaceae
 Bactérias

Quanto a coloração de Gram:

• Christian Gram (1884) classificou as bactérias em Gram-
positivas ou Gram-negativas;
• Neste procedimento as bactérias são submetidas à ação
de diferentes corantes e se coram de maneira diferente,
dependendo da parede celular.
 Microscopia e técnicas de
visualização de microrganismos
TÉCNICAS FIXADAS E CORADAS:

 Coloração diferencial – Coloração de Gram

Violeta
30
Gram +:Violeta Gram - :Incolor

Gram +:Violeta Gram - :Rosa

 Coloração de GRAM

Passar a lamina c/
esfregaço por 3x
Alça sob a chama.

Fixação do
esfregaço pelo
calor

Bactériasisolada Esfregaço

Técnicade GRAM

1. Cobrir lamina com cristal violeta e deixar por 1 min.

2. Escorrerexcesso do corante e lavar.

3.Cobrirlamina com Lugol e deixar por 1 min.
Proceder a coloração
4. Escorrerexcesso do corante e lavar. de GRAM

5. Cobrirlamina com Eter-acetona e deixar por 30s.

6.Escorrerexcesso do corante e lavar.

7.Cobrirlamina com Fucsina e deixar por 30s.

Fucsina
8 . Escorrerexcessodo corante, lavar e deixar secar.
 Coloração de Ziehl-Neelsen
Passar a lamina c/
esfregaço por 3x
Colônias de
sob a chama.
Micobactérias Usar capela de fluxo
laminar.

Fixação do
esfregaço pelo
Esfregaço calor
Meio de cultura
para
Micobactérias a)Cobrir os esfregaço com fucsina de Ziehl. Aquecer até a emissão de
vapores (Não deixar o corante secar). Esperar 5 minutos;
b) Lavar com água corrente;
Resultado c) Descorar com álcool (97%), ácido clorídrico (1%);

d) Lavar em água corrente; Proceder a coloração

e) Corar com azul de metileno por 1 minuto; de Ziehl-Neelsen
f) Lavar e secar;
g) Observar ao microscópio as lâminas coradas;
h) Como se apresentam os BAAR.
Bases físico-químicas da coloração de bactérias e fungos.

Físicas: capilaridade, osmose, adsorsão e absorção.

Químicas: reações de corantes com organelas, inclusões e

estruturas celulares.

Aí é que se firmam as bases desta metodologia (colorações).

Desta forma é observada uma reação estequiométrica entre corantes e
uma dada estrutura, por força da afinidade de suas cargas opostas.
Normalmente o que é uma reação de dupla troca de cátions e aníons, do
tipo[1]:

(Microrganismos) - (Na+, K+, etc..) + (cromóforos) IR (microrganismo) -

(cromóforos) + + (Na+ K+, etc.. ) + (Cl-, oxalato, etc..)
 Coloração de Fungos com Azul de Metileno

Material: Material biológico em suspensão, lâminas, lamínulas, microscópio, pipeta Pasteur (ou conta-gotas),
corante (azul de metileno, verde Malaquita, Giemsa, etc.)

Método: Colocar uma gota do material biológico sobre a lâmina e mais uma gota de corante (azul de
metileno), cobrir com lamínula e observar ao microscópio com lente de 40X.

PREPARAÇÃO FIXA: Fazer um esfregaço com o material biológico. Esperar secar. Fixar ao calor.
Cobrir o esfregaço com o corante.
Esperar por 1 a 5 min. Lavar com água, secar e observar ao microscópico com objetiva de imersão.
Fungos de Importância Médica e Classificações
Superficiais:
• Pitiríase versicolor
• Piedra branca
• Piedra negra

Cutâneas:
• Dermatofitoses
• Candidíase

Subcutâneas:
• Cromomicose,
• Esporotricose
• Micetoma (eumicetoma e actinomicetoma)
 Continuação:
Sistêmicas:
• Paracoccidioidomicose
• Histoplasmose

Oportunistas:
• Criptococose
• Aspergilose
• Zigomicose
• Rinosporidiose
• Doença de Jorge Lobo
• Feo-hifomicose • Hialo-hifomicose
 Oportunistas:
Acometem indivíduos com imunodeficiência.
Porta de entrada variável, quadro clínico variável. As lesões podem
ser cutâneas, subcutâneas, sistêmicas. Exemplo: aspergilose,
mucormicose, fusariose, candidíase sistêmica e pneumocistose.

a)mucormicose b)pneumocistose c)fusariose

 Algumas técnicas de coloração p/ micologia médica

Lactofenol azul algodão (Lactofenol de Aman)

Fenol............................................. 20 g
Ácido láctico................................. 20 ml
Glicerina....................................... 40 ml
Água destilada.............................. 20 ml
Cotton blue (azul algodão)........... 0,05 g

a. Misturar: ácido láctico, glicerina e água.

b. Acrescentar fenol e dissolver com calor uniforme.
c. Acrescentar azul algodão.
d. Filtrar em papel.
 Continuação

• KOH Hidróxido de Potássio diluído a 10 ou 20% em água destilada

Hidróxido de Potássio Azul de Algodão

 Exemplos de Lâmina

Candida ControlLab :: Ferramenta de Visualização de Lâminas (control-lab.com.br)

Sporotrix - Sporotricose ControlLab :: Ferramenta de Visualização de Lâminas (control-lab.com.br)

 Fungos IN NATURA
Os organismos do Reino Fungi são relevantes para a decomposição de matéria
orgânica no ambiente. Ao lado das bactérias, participam da renovação de
materiais e do ciclo do carbono. Assim, os nutrientes necessários para o
desenvolvimento das plantas e processos autotróficos, que garantem a vida.
 Fungos – IN VITRO

Com os estudos e pesquisas em biotecnologia cada vez mais avançados,

empresas e investidores enxergam nos fungos uma forma de aumentar a sua
renda. Isso porque, eles são utilizados em diversos setores, do gastronômico ao
farmacêutico.
 Curiosidades: Cordyceps

Taxonomia:

Nome científico: Ophiocordyceps sinensis

Classificação superior: Ophiocordyceps
Classe: Sordariomycetes
Espécie: O. sinensis
Família: Ophiocordycipitaceae
Filo: Ascomycota
Ordem: Hypocreales
 Endemia
O Ophiocordyceps sinensis, chamado popularmente na Índia de Kira Jari ou
Yakasumba, é um fungo que ocorre no sudeste asiático que tende a crescer
sobre o corpo de lagartas, aparecendo no solo quando a neve começa a

derreter, por volta dos meses de maio e junho.

Na natureza, existem mais de 400 espécies de fungos somente do gênero

Cordyceps. Destes, o Ophiocordyceps unilateralis é o que age de forma mais
parecida com o da série – só que em insetos.
 No Brasil
O O. unilateralis ocorre predominantemente em regiões de florestas tropicais, assim como
seus hospedeiros, já tendo sido relatado em regiões remanescentes de Mata Atlântica em
Minas Gerais, na Zona da Mata. Apesar de muitos trabalhos publicados focados em O.
unilateralis infectando formigas em habitats tropicais tragam o consenso de que a
ocorrência dessa interação é pouco provável em florestas temperadas, outros trabalhos
mais recentes relatam a ocorrência de grandes populações de formigas do
gênero Camponotus parasitadas pelo fungo O. unilateralis nessa região, demonstrando,
portanto, sua ampla distribuição geográfica nas Américas.
 Transformando Insetos em Zumbis
Este fungo realmente transforma a formiga em um zumbi porque secreta neurotoxinas
dentro do animal, que então comprometem o funcionamento dos músculos do inseto,
alterando o seu comportamento no formigueiro. Após ser infectada, a formiga fica
desnorteada e começa a procurar por locais mais iluminados, e acaba saindo do
formigueiro. Nesse processo, ela espalha os esporos do fungo que já tomam o seu corpo.
 Realidade vs. Narrativa
No entanto, ele não é capaz de infectar humanos – como acontece na série,
devido à alta temperatura corporal. A narrativa ficcional cria um contexto em que
essa espécie consegue evoluir ao longo do tempo devido às mudanças
climáticas e ao aquecimento global, adquirindo uma capacidade de parasitar
humanos e de controlá-los.
 Referencias Bibliográficas:

• ALMEIDA SANDRO ROGÉRIO DE - Apostila de Micologia Clínica, 1998

• DEL NEGRO, G.; LACAZ, C. DA S.; FIORILLO, A.M. (eds) - Paracoccidioidomicose. Blasto
micose sul-americana. São Paulo, EDUSP, 1982.
• FENN, J.P. et al – Comparison of updated vitek yeast biochemical card and API20C yeast
identification system. J. Clin. Microbiol. 32: 1184-1187, 1994 FREY, D.; OLDFIELD, R.J.;
BRIDGER, R.C. - A colour atlas of pathogenic fungi. London, Wolfe, 1979.
• HOWARD, D.H. - Fungi pathogenic for humans and animals. New York, Marcel Dekker, 1983.
• KIRSCH, D.R.; KELLY, R.; KURTZ, M.B. - The genetics of Candida. Boca Raton, CRC, 1990.
• KONEMAN, E.W.; ALLEN, S.D.; DOWELL Jr., V.R.; SAMMERS, H.M. - Color atlas and
textbook of diagnostic microbiology. 2 ed. Philadelphia, Lippincott, 1983.
• KONEMAM, E.W.; ROBERTS, G.D. - Micologia. Practica de laboratorio. 3 ed. Buenos Aires,
Panamericana, 1992.
• KWOW-CHUNG, K.J.: BENNETT, J.E. - Medical mycology. Philadelphia: Lea e Febiger, 1992.
• Fungo de The Last of Us não é perigoso na vida real e pode ser usado em remédios
https://shre.ink/l3i0 <consultado em 22/06/2023 – 12:01>