Identificação convencional de

fungos filamentosos
e identificação automatizada e
convencional de fungos
leveduriformes
Disciplina: Micologia Médica
Profº.: Luís Henrique
Acadêmicos:
Carlos Alberto; Joilce Portela; Marcos Allan; Maria Inês e Maria Josenilda
 Introdução
• Identificação do fungo de maneira ideal seria: Gênero e
espécie
• O processamento da amostra passa por 3 fases:
• Indicar a coleta
Pré-analítica
• transporte
• Processamento
Analítica • identificação do
microrganismo
• laudo e estocagem
Processamento da
• Estudos
amostra
• Dados epidemiológicos
 Isolamento do fungo

Semear Exame direto

Macroscópico

Gram

Levedura Filamentoso

Microcultivo/ análise
bioquímica
Identificação de fungos filamentosos
Cultura pura (Cultura
mista é uma causa
comum de erro)
• 1. Exame
Macroscópico

Textura: algodonosa,
velutina, pulverulenta
(furfuráceas),
penugentas
Identificação de fungos filamentosos
• 1. Exame Macroscópico
Relevo: cerebriformes, rugosa,
apiculadas, crateriformes
Bordas: vários desenhos (franjas)
Pigmentação: anverso e reverso/
difusível ou não
Tamanho: variável (quantidade e
qualidade do substrato)
Identificação de fungos filamentosos
• 2. Exame Microscópico:
É a base do diagnóstico da
maioria dos fungos
filamentosos

Se baseia nas diferenças

morfológicas das estruturas
reprodutivas e na ontogenia
dos esporos

Os isolados primários e
subcultivo devem ser
submetidos a avaliação
micromorfológica (40x)
 Identificação de fungos filamentosos
• 2. Exame Microscópico - 2 técnicas podem ser
empregadas:
Técnica Material Montagem
Exame Microscópico Direto Amostra biológica Material é colocado entre
lâmina e lamínula com
líquido de montagem
apropriado

Microcultivo Fragmento da cultura 1ª ou Material é previamente

2ª em meio sólido ou líquido,
depositados sobre lâmina
e/ou lâminula
Lactofenol azul de algodão
(hialinos)
Lactofenol de Aman/
KOH/NaOH/ (demáceos)
Identificação de fungos filamentosos
• Exame microscópico Direto
 Identificação de fungos filamentosos
• Técnica de microcultivo em lâmina (método 1)
• 121ºC
• 20- • Agar “cornmeal”
30min • Potato Dextrose Agar (PDA)
• 30ºC • SDA Dextrose Agar (SDA)
• 3-5 dias • Agar malte
Identificação de fungos filamentosos
• Técnica de microcultivo em lâmina (método 1)
 Identificação de fungos filamentosos
• Resistencia à cicloheximida
• Separar as culturas de:
Blastomyces dermatitidis, Fungos
Paracoccidiodes brasiliensis, Oportunistas
Histoplasma capsulatum,
Sporothrix schenckii,
Coccidioides immitis, Absidia,
Epidermophyton floccosum Rhizopus, Mucor
e Aspergillus
Microsporum ssp.,
• 30°C fumigatus
Trichophyton ssp.
• 7 dias
Observação Meio Resultado
Crescimento SDA e Mycosel Resistente
Crescimento SDA Sensível
Não SDA Repetir
Identificação de fungos filamentosos
• 4.Demonstração de balistosporos
• Alguns fungos Zygomycetes tem habilidade de produzir
balistosporos – dilatação propulsiva

Produção de balistosporos

Formação espontânea de colônias periféricas

(Basidiobolus e Conidiobolus)
Identificação de fungos filamentosos

• 4.Demonstração de balistosporos

• 30ºC
• 2-3 dias
Identificação de fungos filamentosos
• 5. Teste da Perfuração do fio de cabelo

Distinção entre
Trichophyton rubrum e T. Mentagrophytes

Extrato de levedura (10%) + fio de cabelo + cultura

suspeita → incubar 30°C/ 10-14 dias
 . Teste da Perfuração do fio de cabelo

Perforations

Trichophyton mentagrophytes, Trichophyton rubrum,

Hair perforation test is positive. Hair perforation test is negative.
Identificação de fungos filamentosos
• 6. Testes Fisiológicos
• Urease
• Habilidade de hidrolisar ou não a Uréia
• Distinguir isolados atipicos de Trichophyton rubrum (-) e
T. Mentagrophytes (+)
• Agar usado: Agar uréia Christensen
• Tempo: 3-4 dias

controle
Identificação de fungos filamentosos

• 7. Dimorfismo
Dimórficos são fungos filamentosos que podem, sob
determinadas condições, assumir forma de levedura,
diminuindo a capacidade de filamentação - colônias aspecto
cremoso

• Filamentosa a 25-30⁰C
• Levedura a 37 ⁰C

É um critério útil para identificação desses fungos patogênicos →

Temperatura, composição do meio e concentração de CO₂
Identificação de fungos filamentosos
• 7. Dimorfismo

Histoplasma capsulatum,
Blastomyces dermatitidis,
Paracoccidiodes brasiliensis,
Sporothrix schenckii,
Coccidioides immitis,
gênero Emmonsia,
Penicillium marneffei
 Técnica de conversão da fase micelial à fase
leveduriforme
Todos os procedimentos devem ser feitos em câmara de
fluxo laminar
• Blastomyces dermatitidis e
Paracoccidioides brasiliensis
• Agar Kelley
• Agar semente de
algodão
• Sporothrix schenckii,
Histoplasma capsulatum
• BHIB + glicose +cisteína
• Sporothrix schenckii,
• BHIA
Exame direto – hifas
• 1º - 30°C 2º - 37°C em levedura
(semanas)
 Identificação de fungos leveduriformes

• 1 - Exame Macroscópico
• Características:

Textura
Topografia meios sólidos
Bordos
Coloração

Formação meios líquidos

de película
 Rhodothorula spp Candida albicans

Macromorfologia (ágar Sabouraud)

Ágar Sabouraud: colônias de Em ágar sangue, colônias de cor

Colônias de cor laranja a vermelha, creme, com formação de franjas
aspecto cremoso. cor branca a creme, cremosas e
lisas. que lembram “ estrelas”.
Candida krusei

Macromorfologia

Macromorfologia em Chromagar
Colônia rosa
 Identificação de fungos leveduriformes
• 2 - Exame Microscópico
• Preparações diretas e/ou cultivo em lâmina
• Célula leveduras
• Blastoporos
• Blastosporos
• Balistosforos
• Pseudo-hifas
• Tubos germinativos
• Clamidosforos
• Artrosporos
• Ascos
• Ascoporos
• Cápsulas
Candida albicans

Micromorfologia

Pseudohifas:
abundantes e ramificadas

Clamidósporos terminais
estruturas arredondadas de
parede espessa

Blastoconídeos
são ovais e formam
aglomerados no septo das
pseudohifas.
 Identificação de fungos leveduriformes

• Tubo Germinativo
• Objetivo: Identificação presuntiva de Candida albicans e
C. stellatoidea (incubado com soro humano a 37°C/ 2-3
horas)
Descrição Método 1 Método 2
Meio de Soro humano ou animal Clara de ovo
cultura
Procedimento 0,3 - 0,5mL (tubo de ensaio) → Inocular a cultura suspeita em
cultura suspeita (idade 18-72h) clara de ovo → incubar a 37°C / 2 -
→ incubar a 37°C / 2-3h → 3h → montagem microscópica
Inocular 1gt entre lâmina e (tubos germinativos)
lamínula → microscópico
 Identificação de fungos leveduriformes

• Tubo Germinativo

ALMEIDA, G. M. D., et al.

 Identificação de fungos leveduriformes

• Demonstração de cápsula
• Indicar presuntivamente o agente
etiológico – Cryptococcus
neoformans (cápsulas em torno da
célula)
• Realizada com preparações
microscópicas com nanquim ou
nigrosina
• Suspensão de levedura em água
destilada + tinta da China + lâmina e
lamínula → microscópio
 Identificação de fungos leveduriformes

 3 – Testes fisiológicos ou bioquímicos

 São usados para identificação final deste grupo de fungos

}
Assimilação de carboidratos
Assimilação de nitrato AUXANOGRAMA

Fermentação de carboidratos
Teste de Urease → ZIMOGRAMA
Sistemas comerciais
Suspensãode
células do = INÓCULO
fungo

Comparação para
Solução- ajuste de turbidez:
padrão= 106 espectrofotômetro
ufc/mL ou visual
 Auxanograma
• Presença de oxigênio
• Utilização de fontes de:
• Carbono (a partir de açúcares)
• Nitrogênio (a partir de nitrato)
 Auxanograma
• Meio basal sem fonte de carbono
• Sólido ou líquido

• Yeast Nitrogen Base (YNB)- 40mL

• Inóculo: escala 1 McFarland (2mL)
• Incorporar suspensão de levedura ao meio
• Aplicação de discos ou açúcar in natura
• Incubação 30oC por 24-48h
 Auxanograma
• Aplicação de compostos nitrogenados
• Peptona (controle positivo)
• Nitrato de potássio
• Incubação 30oC por 24-48 h até 7 dias
• Resultados: presença de zona de crescimento (leitura
visual)
 Identificação de fungos leveduriformes

 Teste da Urease
 Hidrólise da Uréia
 Cryptococcus neoformans (99%), Rhodotorula e Trichosporon
→ urease positivo
 Rápido crescimento em Agar Uréia de Christensen – coloração
rosa escuro (30ºC/5 dias)
 Teste da Urease rápida
 Controle positivo: C. neoformans
 Identificação de fungos leveduriformes

 Sistemas Comerciais
 Manuais
 Automatizados (Vitek 2, ID 32C )
 Para identificação específica de C. albicans

 São empregados tiras ou cartelas contendo uma série de

galerias plásticas com carboidratos desidratados ou outro
substrato bioquímico
 Inoculação nas galerias → incubação (varia de 4h-2-3 dias) →
leitura
 Cultura positiva

Exame direto

Bactéria Levedura

Cultura Pura

Sim Não

Obter Colônia Pura

por isolamento

Cápsula

+ -

Macromorfologia Tubo Germinativo

Colônia bege: - +
Criptococcus sp
Colônia
salmão/laranja: C. albicans
Rhodothorula sp

Provas Bioquímicas e Cultivo em Lâmina (continua)

Cultivo em lâmina
Obrigado!!!
 Bibliografia
• LEVY, C. E. Manual de Microbiologia Clínica para o Controle de Infecção em
Serviços de Saúde, 1ª edição, Módulo VII, Editora Agência Nacional de
Vigilância Sanitária, Campinas SP., 2004. Disponível em:
<http://www.anvisa.gov.br/ servicosaude/manuais/ microbiologia.asp>.
Acesso em 17/10/12.

• SIDRIM, J. J. C.; ROCHA, M. F. G. Micologia Médica à Luz de Autores

Contemporâneos, 1ª edição, Guanabara Koogan, 2004.

• ZAITZ. C, et al, Compêndio de Micologia Médica, 2º edição, Rio de Janeiro,

Guanabara Koogan, 2010.
• Micologia Médica à Luz de
AutoresContemporâneosSidrim JJC, Rocha
MFGGuanabara Koogan