Orientações para Coleta,

Transporte, Processamento,
Análise e Meios de Cultura.

• ARTIGOS PARA OS SEMINÁRIOS;

• CONTEÚDO PROGRAMÁTICO;
• CASOS CLÍNICOS;

blog do professor:
http://chitoteixeira.wordpress.com
Colheita de Amostras

Quando se suspeita de doença infecciosa

Técnicas dirigidas à detecção
sorológica de antígenos e anticorpos

Sondas de DNA - PCR

Anticorpos monoclonais

Outros procedimentos sem cultivo

Cultivos apropriados
Colheita de Amostras

É possível que a colheita apropriada de uma

amostra para cultivo seja a etapa mis
importante na confirmação final de que um
microrganismo é responsável pelo processo
de enfermidade infecciosa.

Uma amostra mal colhida:

Fracasso
Na no de
instituição isolamento deincorreta e ainda
uma terapia
microrganismos
danosa, caso o importantes.
tratamento seja dirigido para
um comensal.
Exemplo: (caso clínico)

Klebsiella pneumoniae foi isolada do escarro

de um paciente com pneumonia clínica;

Klebsiella pneumoniae

Escarro colhido de forma inadequada sendo

constituído principalmente de saliva;
pneumonia Nasofaringe
O pior:

O tratamento seria inadequado e só

resultaria efetivo, por casualidade, se a
espécie causadora da pneumonia tivesse um
padrão de susceptibilidade a antibióticos
Pseudomonas aeruginosa
similar à de K. pneumoniae.

A terapia eleita poderia ter sido

errônea.
 Colheita de Amostras
Considerações fundamentais na
colheita de amostras.
• A amostra deve ser material do sítio real de
infecção, devendo ser colhida com o mínimo
de contaminação dos tecidos, órgãos e
secreções adjacentes;
• Deve-se estabelecer o momento ótimo para a
colheita de amostras, com o objetivo de contar
com melhor possibilidade de isolar
microrganismos causadores de enfermidades;
 Colheita de Amostras
Considerações fundamentais na
colheita de amostras.

• Enviar
Deve-se obter uma swab
ao laboratório quantidade
seco ousuficiente
secreçõesde
Calcularam que Swabs o retais para isolar
amostra
escassas para
é uma realização
prática inútil dase detécnicas
custo de
rendimento do isolamento
espécies de Shigella, o material
cultivo solicitadas;
considerável para o paciente;
de microrganismoscolhido a partir deve ser inoculado
de culturas de sanguediretamente na superfície de
• Com
Devem demasiada
aumentavaser em
utilizados
freqüência,
cerca
ágarde dispositivos
são enviados
Mac Conkey de
ou colheita,
ao
caldo
recipientes
laboratório
3% por mL de de
0,5 amostras
mLenriquecido
sangue ou menose meiosde material
parade cultura
gram-
apropriados
identificado
colhido; para
como
(Mermel assegurar
“escarro”
e Maki).
bactérias
isolamento
anaeróbicas
ou “lavadoótimo
negativos
de microrganismos.; brônquico”;
 Colheita de Amostras
Considerações fundamentais na
colheita de amostras.

• Sempre que possível, deve-se obter amostras

Etiqueta
antes dalegível com nome,
administração de antibióticos;
número de idenficacção,
origem, médico e a data/hora
Garganta
Neisseria meningitidis

da colheita;
• O recipiente da amostra deve ser
Líquido
cefalorraquidianode
rotulado (LCR)
forma correta; Haemophilus influenzae
Amostras
geniturinárias
Neisseria gonorrhoea
Colheita de Amostras
Outros exemplos importantes.
Transporte de Amostras

O objetivo primário no transporte de

amostras para diagnóstico consiste em
manter a amostra o mais próximo possível
de seu estado original, com deterioração
mínima, e minimizar os riscos para os
transportadores das amostras, utilizando-se
dispositivos protetores do recipiente da
amostra inseridos no interior de um
recipiente adequado.
Transporte de Amostras
Deve-se evitar:

Calor extremo
Frio Mudanças na pressão

Condições ambientais adversas

Transporte de Amostras

Se for previsto:

Um atraso prolongado (acima de 4 dias por

exemplo) antes da amostra ser processada;

É preferível congelar a amostra a

-70ºC, podendo ser utilizado um
congelador a -20ºC, se o período
de estocagem for breve.
 Transporte de Amostras

As amostras de escarro colhidas principalmente

para o isolamento:

Podem ser remetidas sem qualquer tratamento

desde que colhidas em recipientes de propileno
ou polietileno esterilizados.
micobactérias fungos
 Transporte de Amostras

A maioria das amostras líquidas, em particular

amostra de urina, deve ser transportada ao
laboratório o quanto antes possível:

Recomenda-se um limite
máximo de 2 horas entre
a colheita e a chegada da
amostra ao laboratório.
Contexto hospitalar
Transporte de Amostras

O limite de tempo representa um problema

quando as amostras são colhidas em
consultórios particulares.

Podem ser utilizados

recipientes contendo uma
pequena quantidade de
ácido bórico, se o
transporte rápido não for
possível.
Amostras de urina
Transporte de Amostras
Para a maioria das amostras pode ser utilizado
um meio de manutenção ou transporte,
seguindo-se as instruções do fabricante.

Solução tampão, isenta de

nutrientes e fatores de
crescimento, conserva a
viabilidade sem permitir a
multiplicação das bactérias
Meio de durante o transporte.
transporte Stuart
Transporte de Amostras

• Tioglicolato de sódio – tem função de agente

redutor para melhorar o isolamento de
bactérias anaeróbias;

• Ágar (pequena quantidade) – proporciona

uma consistência semi-sólida que impede a
oxigenação e o derrame durante o
transporte;
Transporte de Amostras

Solução de borato de sódio

Tampão com sacarose,

fosfato e glutamato
Transporte de Amostras

As amostras devem ser embaladas de modo a

suportar golpes ou mudanças de pressão que
podem ocorrer durante a manipulação e
causar vazamento do conteúdo;

Um recipiente que vaza não apenas predispõe

a amostra a uma potencial contaminação, mas
também expõe os microrganismos ao pessoal
que transporta ou recebe a amostra;
Transporte de Amostras
Técnica apropriada para embalar e rotular
agentes etiológicos:

Recipiente primário com

tampa à prova d’água

Recipiente secundário
de preferência de metal

Embalagem para envio

fabricada em cartão
ondulado, cartão grosso
ou gomaespuma
Recepção de Amostras

luvas

máscaras
jalecos
 Processamento de Amostras
• Ingresso de dados essenciais em um livro de
registros ou em um terminal de computador;

• Exame visual e determinação do

cumprimento de todos os critérios para
aceitação da amostra;

• Para certas amostras, o exame microscópico

de montagens úmidas ou de esfregaços
corados, para estabelecer um diagnóstico
presuntivo;
 Processamento de Amostras

USO DE CORANTES EM MICROBIOLOGIA:

É recomendável que os microbiologistas
efetuem exames microscópicos diretos das
amostras enviadas para cultivo;

Rápido diagnóstico
presuntivo Guia para selecionar os meios
de cultura apropriados
 Processamento de Amostras
Coloração de Gram
• Cristal violeta – serve como coloração
primária, unindo-se à parede celular
bacteriana após tratamento com uma
solução de iodo fraca (mordente para a
ligação do corante);

• Descorante (mistura etanol 95% e acetona) –

as bactérias que retêm o corante aparecem
azuladas se observadas ao microscópio e
são denominadas gram-positivas;
 Processamento de Amostras
Coloração de Gram
• Contracorante Safranina – certas bactérias
perdem a coloração primária com cristal
violeta quando são tratadas com o
descorante e captam a contracoloração com
safranina e aparecem em vermelho quando
observadas ao microscópio, denominando-
se gram-negativas;

A coloração de Gram pode ser utilizada para

efetuar identificações presuntivas.
 Processamento de Amostras
Colorações de àlcool-ácido-resistência

Recobertas por um
espesso material ceroso
que resiste à coloração,
entretanto, uma vez
coradas, resistem à
descoloração mesmo por
micobactérias solventes orgânicos fortes,
como o álcool-ácido.

Fenômeno descoberto por Ziehl e Neelsen (1881).

 Processamento de Amostras

OUTROS CORANTES:

Laranja de acridina

Azul de toluidina e Azul de Metileno

Coloração com Prata

Coloração com Wright-Giemsa

Ácido periódico de Schiff
 Processamento dos Cultivos
Após recebimento de amostras para cultivo no
laboratório de microbiologia, devem ser
tomadas as seguintes decisões:
• Selecionar os meios de cultura primários
apropriados para o tipo de amostra
particular;
• Determinar a temperatura e a
atmosfera de incubação para isolar
todos os microrganismos
potencialmente significativos;
 Processamento dos Cultivos
• Determinar qual dos microrganismos
isolados em meios primários requer uma
maior caracterização;
• Determinar se são necessárias provas de
suscetibilidade a antibióticos, uma vez
conhecida a identidade do organismo;
Comum a todos é o reconhecimento das
dificuldades envolvidas na manutenção da
qualidade dos serviços, em vista das políticas de
redução de custos, cada vez mais rigorosas;
 Seleção de Meios de
Cultura Primários
Meios não-seletivos – são isentos de inibidores
e permitem o crescimento de microrganismos
encontrados freqüentemente em laboratórios
clínicos; Gardnerella vaginalis
Haemophilus influenzae

Ágar com 5% de Ágar com sangue Ágar com sangue de

sangue de carneiro cavalo ou de ovelha
humano
 Seleção de Meios de
Cultura Primários
Pode-se tornar o ágar sangue seletivo mediante
a adição de um ou mais antibióticos ou de
certas substâncias químicas;
Inibem gram-positivos

Colistina e o ácido
Canamicina e vancomicina
nalidíxico

Bacilos gram-negativos
Inibe gram-negativos e
anaeróbios
favorece (bacteroides)
o crescimento de
gram-positivos

ÁgarÁgar
Ágar-KV
sangue
McConkey Ágar EMB
 Seleção de Meios de
Cultura Primários
O caldo de enriquecimento é empregado para
isolar microrganismos patogênicos de
amostras, como fezes, nas quais existe uma
elevada concentração de microrganismos
comensais;
Fase logaritmica

Escherichia coli e outros

comensais entéricos

Salmonella e Shigella

Fase de latência
 Transferência e Cultivo
de Amostras Biológicas
Uma vez que a amostra tenha ultrapassado os
vários critérios para rejeição e tenha sido
aceita para cultivo, porções apropriadas da
mesma devem ser transferidas aos vários
meios de cultura descritos no item anterior.
Essa atividade também é usualmente realizada
luvas
em uma parte separada de outras áreas do
laboratório, conhecida como área de
máscaras
“semeadura”;
jalecos
 Transferência e Cultivo
de Amostras Biológicas
O equipamento necessário para a inoculação
primária de amostras é relativamente simples:
Transferência e Cultivo
de Amostras Biológicas

UFC
Espalhamento nos
quatro quadrantes
 Transferência e Cultivo
de Amostras Biológicas
O meio nos tubos pode ser líquido, semi-sólido
(0,3 a 0,5% de ágar) ou sólido. O ágar semi-
sólido é adequado para as provas de
motilidade;
Transferência e Cultivo
de Amostras Biológicas

Os microrganismos diferem quanto à

temperatura ótima de incubação. Porém, a
maioria dos microrganismos cresce a 35ºC;
assim, se o laboratório dispõe apenas de uma
estufa, esta deve estar ajustada para 35ºC;

O crescimento da maior parte dos

microrganismos é potencializado por uma
atmosfera de 5% a 10% de CO2;
Transferência e Cultivo
de Amostras Biológicas
Mais importante que o modo de incubação é a
prevenção de amplas flutuações na
temperatura. Deve-se cuidar para que os tubos
e placas fiquem protegidos de correntes de ar-
condicionado ou de fluxos de calor;

O controle da umidade no interior da estufa

também é importante. A maioria dos
microrganismos tem crescimento máximo
quando a umidade é de 70% ou superior;
Interpretação dos Cultivos

A identificação dos cultivos primários após 24

a 48 horas de incubação requer uma
considerável habilidade;

O microbiologista deve avaliar o crescimento

das colônias e decidir se são necessários
procedimentos adicionais;

Essa avaliação se faz:

Interpretação dos Cultivos
• Anotando as características e o número
relativo de cada tipo de colônia isolada em
meios de ágar;

• Determinando a pureza, reação à coloração

de Gram e morfologia das bactérias em cada
tipo de colônia;;
• Verificando mudanças no meio que circunda
as colônias, o que reflete atividades
metabólicas específicas de bactérias
isoladas;
Interpretação dos Cultivos
Características macroscópicas das colônias
OBRIGADO