02 Diagnostico Micologico Red

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DIAGNSTICO MICOLGICO
Captulo
Laerte Ferreiro
PONTOS CHAVE
A Lmpada de Wood presta-se para o estabelecimento de diagnstico inicial de microsporase por Microsporum canis, para o seguimento clnico na
trans e ps terapia.
A positividade Lmpada de Wood d-se quando da produo in vivo pelo dermatfito do metablito triptofano.
A Lmpada de Wood pode gerar tanto reaes falso-positivas (presena de: resqucios de xampu base de alcatro, de bacterias dos gneros Cory-
nebacterium sp e Pseudomonas sp) ou falso-negativas (terapia prvia com iodo ou iodforos).
O exame micolgico direto (pelos, escamas, unhas ou garras, gros) com a utilizao de produtos clareadores (KOH), corantes (Giemsa, Wright-
-Giemsa, Tinta Parker, calcofluor) auxilia, em muito, a consecuo do diagnstico etiolgico.
O cultivo micolgico mtodo de diagnstico considerado como padro-ouro para o estabelecimento do diagnstico etiolgico de toda e qualquer micose.
O material a ser submetido ao cultivo micolgico inclui: pelame perilesional (avulsionado ou disposto em fragmentos de carpetes estreis), escamas,
secrees e exsudatos, unhas ou garras, material biopsiado semeados nos meios clssicos, com ou sem impedientes, ou naqueles especiais.
O exame histopatolgico de material biopsiado, submetido s coloraes especiais pelo PAS, s argnticas (Gomori, Grocott), ao Azul alciano, ao
Mucicarmin de Mayer, por ser procedimento invasivo, custoso e menos eficaz nas infeces fngicas superficiais, mais indicado em micoses inter-
medirias e profundas.
Nas malassezioses, ainda, o cultivo segue sendo o padro-ouro de diagnstico quanto sensibilidade e especificidade.
Nas malassezioses, o exame direto de escamas, submetidas colorao (Gram, tipo Romanovsky, panptica) tem boa especificidade e baixa sensibilidade.
O exame direto nas suspeitas de malasseziose, a despeito da sempre controvertida interpretao, considerado como positivo, quando da presena,
em mdia, de mais de cinco ou mais de dez blastocondeos, respectivamente, na epiderme ou meato acstico externo, em cinco campos microscpi-
cos de 400 aumentos.
Na criptococose, o exame direto de secrees, excrees, material decalcado ou biopsiado, lquido cefalorraquidiano submetido colorao pela Tinta
da China ou Nigrosina permite fcil evidenciao dos blasticondeos.
Na criptococose, o cultivo micolgico, tambm, o mtodo definitivo de diagnstico etiolgico, mormente nos meios micolgicos padronizados, no
seletivos (gar Sabourad) desprovidos de impedientes (actidione/ciclo-heximida).
Para a diferenciao das espcies de Cryptococcus, neoformans e gattii, deve-se recorrer ao gar canavanina glicina azul de bromotimol (CGB).
O histopatolgico, visando ao diagnstico da criptococose tegumentar mandatrio, propiciando melhores resultados quando do emprego do Muci-
carmim de Mayer ou do Fontana-Masson.
Na criptococose, a sorologia, pelo teste de aglutinao do ltex, detecta antgenos polissacardeos e no anticorpos, permitindo o estabelecimento do
diagnstico e mesmo da prognose.
Na esporotricose, principalmente, dos felinos, possvel a evidenciao das estruturas leveduriformes (ovaloides arredondadas, em charuto), em
preparados corados (corantes panpticos, Gram, Giemsa) em exame direto, com objetiva de imerso (1000x).
O diagnstico etiolgico da esporotricose envolve no s o citolgico, como o micolgico, comprovando ser fungo dimrfico (formas y 37C ou
M 25 a 27C em gar infuso de crebro e corao BHI).
Como opo para o estabelecimento do diagnstico da esporotricose, pode-se recorrer ao hemocultivo (BHI) de sangue total ou do cogulo sangu-
neo, a 25C ou, ainda, a histopatologia de leses (ppulas, ndulos, gomas, lceras), em preparados corados (PAS, Azul alciano, Gomori, Grocott).
INTRODUO
Os fungos constituem um grupo diversificado de micro- conhecidas como potencialmente patognicas para animais
-organismos suficientemente diferenciados de outros seres e humanos. Os fungos so eucariotas, heterotrficos no fo-
vivos, estando alojados em um reino prprio. Embora exis- tossintetizadores que produzem exoenzimas e obtm seus
tam milhares de espcies no Reino Fungi, cerca de 400 so nutrientes por absoro.205
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18 Parte 1DERMATOLOGIA BSICA
Os fungos crescem aerobicamente, embora muitos sejam favorveis, com a atividade metablica aumentando antes da
aerbicos estritos. A nutrio ocorre atravs da absoro de produo de projees tubulares que os transformam em hi-
nutrientes, parasitismo de seres vivos ou de matria morta, fas ramificadas. As ramificaes laterais desenvolvem-se em
atuando como saprbicos, simbiontes ou parasitas. reas localizadas de plasticidade que permitem crescimento
A temperatura de crescimento e o tempo de incubao a partir da parede celular madura e rgida. Os septos, forma-
ideais para o desenvolvimento de caractersticas coloniais pe- dos por crescimentos internos da parede celular, tm poros
culiares variam em funo dos diferentes grupos de fungos centrais pelos quais nutrientes e organelas podem transitar.
patognicos. Os fungos podem tolerar condies adversas A extenso das hifas (com ou sem septos) e suas ramifica-
5,45
como altas presses osmticas e meios com pH inferior a 5. es laterais resultam na formao do miclio vegetativo
A reproduo dos fungos pode ser sexuada ou assexuada (nutrio) e do miclio areo (reproduo) que caracterizam
45,113
e, em algumas espcies, podem ocorrer as duas formas. O o aspecto macroscpico dos fungos filamentosos.
reino Fungi composto por quatro filos, dos quais em trs A parede celular das hifas, que lhes confere rigidez e es-
deles: Ascomycota (ascomicetos), Basidiomycota (basidio- tabilidade osmtica, composta principalmente de compo-
micetos) e Zygomicota (zigomicetos), a taxonomia baseada nentes de carbo-hidratos, incluindo macromolculas de qui-
nas caractersticas das formas sexuadas (teleomorfas) (Qua- tina com ligaes cruzadas de celulose. Nas leveduras, a
dro 2.1). Fungos imperfeitos ou deuteromicetos (Filo Deute- parede celular contm protena associada com polissacar-
romycota), assim chamados porque a forma sexuada inexiste deos e, em algumas espcies, uma srie de compostos lipdi-
ou ainda no foi evidenciada, constituem um quarto filo he- cos. Na membrana celular dos fungos, o esterol predomi-
terogneo, cuja classificao fundamentada nas caracters- nante o ergosterol enquanto que, em contraponto, o
55,118,159,172,200,215
ticas reprodutivas assexuadas (anamorfas). Em colesterol o principal constituinte da membrana celular
bora a quase totalidade dos fungos de importncia na medi- dos animais. Tanto os fungos filamentosos quanto as leve-
cina humana ou veterinria seja constituda por deuteromi- duras tm ncleos com membrana nuclear bem definida,
118,159
cetos, alguns fungos pertencentes aos outros filos, eventual- mitocndrias e rede de microtbulos.
mente, tambm, podem produzir doena em animais. Alguns fungos, denominados dimrficos, apresentam
Os fungos de interesse na micologia mdica so os fila- duas formas de crescimento (filamentosa e leveduriforme)
mentosos (com ou sem septos) e as leveduras. Os fungos fila- dependendo da temperatura. A forma leveduriforme ocorre
mentosos crescem como filamentos ramificados chamados nos tecidos do hospedeiro e em cultivos a 37C, enquanto a
de hifas (o conjunto chamado de miclio), enquanto as leve- filamentosa observada em culturas entre 25 e 28C. Uma
duras (unicelulares) de relevncia mdica, tm geralmente exceo o dimorfismo particular do complexo Coccidioi-
formas globosa, oval ou esfrica. Os filamentosos tm melhor des immitis C. posadasii que, na forma tecidual, apresenta
crescimento entre 24 e 28 e as leveduras, por sua vez, entre 24 s esfrulas. Fatores ambientais geralmente determinam a
e 37C. Alguns fungos (zigomicetos) possuem rarssimos forma na qual os fungos dimrficos iro se desenvolver.
115,120
septos, sendo descritos como asseptados ou cenocticos. Diversas leveduras, entre elas Candida albicans, produzem
Os propgulos fngicos transportados pelo ar e gua formas adicionais, sendo descritas at mesmo, em algumas
101
germinam em locais nos quais as condies ambientais so citaes, como polimrficas.
QUADRO 2.1. Reino Fungi com quatro filos e taxonomia de alguns fungos importantes na casustica clinica veterinria brasileira.
Zygomycota Ascomycota Basidiomycota Deuteromycota
Classe: Classe: Classe: Classe: Classe:
Zygomycetes Ascomycetes Basidiomycetes Blastomycetes Hyphomycetes
Ordem: Gnero: Gnero: Gneros: Famlia: Famlia: Famlia:
Mucorales Arthroderma Filobasidiella Cryptoccocus Moniliaceae Dematiaceae Tuberculariaceae
Gneros: Malassezia Gnero: Gnero: Gnero:
Absidia Candida Aspergillus Alternaria Fusarium
Mucor Rhodotorula Coccidioides Bipolaris
Rhizomucor Torulopsis Geotrichum Cladosporium
Rhizopus Trichosporon Histoplasma Curvularia
Ordem: Microsporum Drechslera
Entomophthorales Paecilomyces Exophiala
Gneros: Penicillium Phialophora
Conidiobolus Scopulariopsis Wangiella
Basidibolus Sporothrix Xylohypha
Trichophyton

Captulo 2Diagnstico Micolgico 19
As espcies fngicas podem ser saprbicas (saprotrfi- com o meio bifsico e, atualmente, dispem-se da lisecentri-
cas), parasitas ou mutualistas. Os fungos mutualistas tm fugao (Isolator) e de sistemas automatizados, continua-
associao obrigatria com outros micro-organismos e no mente controlados (Bactec e BacT/Alert). A lisecentrifuga-
so patognicos. Os saprbicos, que esto amplamente dis- o considerada padro ouro para o isolamento de
tribudos no ambiente e envolvidos na decomposio de ma- leveduras e fungos dimrficos, especialmente Histoplasma
tria orgnica, algumas vezes causam infeces oportunsti- capsulatum. Independentemente desses avanos tecnolgi-
cas em animais. O crescimento excessivo de leveduras, que cos, a fungemia marcador de baixa sensibilidade para a
frequentemente so comensais na pele e nas mucosas, pode identificao de infeco fngica, quando comparada com o
118 4,20,72
causar leses localizadas ou disseminadas. diagnstico histopatolgico que sucede a necropsia.
O fungo pode se desenvolver no organismo por contato Consideradas como enfermidades emergentes, as mico-
superficial (direto na epiderme), por inoculao percutnea ses ditas oportunsticas (p. ex., candidose, feohifomicoses,
(trauma), por inalao ou por disseminao endgena a par- zigomicoses) tiveram um notvel incremento na casustica
tir de um foco de infeco preexistente. de doenas humanas e animais. O advento de drogas citot-
As infeces fngicas cutneas (p. ex., dermatofitose, xicas, o uso de drogas imunossupressoras e, principalmente,
malasseziose) resultam da ao dos fungos especializados as retroviroses contribuem para o constante aumento e exa-
em atacar os tecidos queratinizados. Embora a leso esteja cerbao das manifestaes clnicas das micoses. Atual-
confinada camada morta da pele e de seus fneros cornifi- mente, qualquer fungo saprbico, isolado de um animal
cados, a reao imune do hospedeiro pode ser acentuada. Os imunodeprimido, deve ser considerado potencialmente pa-
dermatfitos, principais agentes de quadros cutneos, por tognico. Os fatores predisponentes que aumentam a fre-
no invadirem o tecido vivo, so considerados saprbios es- quncia e a gravidade dessas infeces incluem alteraes na
pecializados, j que se utilizam to somente de estruturas barreira mucocutnea, defeitos ou disfunes em neutrfi-
mortas, semi ou queratinizadas do hospedeiro (pelos, pele, los e de fagcitos mononucleares ou na imunidade mediada
33,47
cornos, cascos, unhas e garras). por linfcitos T.57
J as micoses subcutneas ou intermedirias constituem Para a identificao de uma micose, necessrio que um
um grupo heterogneo de doenas causadas por ampla va- pressuposto agente fngico seja includo como probabilida-
riedade de fungos (exceto os dermatfitos), que somente de etiolgica j no incio do diagnstico diferencial. As in-
aps implante traumtico, invadem tecidos cutneo e subcu- formaes obtidas a partir do exame citolgico so impor-
tneo, isto , possuem capacidade de invaso tecidual limita- tantes porque pode ser a primeira indicao de que um
da. Algumas infeces mantm-se localizadas, expandindo- agente infeccioso est presente. O exame consiste na realiza-
-se lentamente aos tecidos contguos (cromoblastomicose e o de impresses por contato, em lmina de vidro, limpa e
micetoma), enquanto outras (esporotricose) frequentemente seca, com o exsudato presente na leso cutnea ou mucosa.
205
se propagam via linftica. Alm disso, o desafio esbarra no fato de que as opes para
No que concerne s micoses sistmicas ou profundas, nor- o diagnstico definitivo de uma provvel micose animal tm
malmente so elas adquiridas atravs da inalao de propgu- sido limitadas na prtica veterinria (Quadro 2.2). Os mto-
los fngicos, ocorrendo, ento, o desenvolvimento de doenas dos tradicionais para o diagnstico de vrias micoses so
pulmonares. Os fungos por elas responsveis normalmente baseados no exame direto, cultivo, histopatologia ou na evi-
so dimrficos, tais como os agentes da histoplasmose e cocci- denciao de resposta sorolgica ao agente agressor.
57,72,147,167
diomicose, de distribuio geogrfica mais restrita e causado-

209
res de endemias, principalmente em humanos. Tais agentes
QUADRO 2.2. Mtodos de diagnstico micolgico.
so patgenos primrios e tm capacidade de causar doena
no hospedeiro, na dependncia da densidade de propgulos Lmpada de Wood
no ambiente e no tempo de exposio (dose infectante). Ou- Exame direto
trossim, preciso considerar a interao com as defesas do Cultivo
hospedeiro, que fundamental para a evoluo e a gravida- Histopatolgico
57
de da doena. Nessas micoses, todos os rgos vitais po- Deteco de anticorpos
dem ser afetados e as leses podem ser extensas. As formas Deteco antgenos
cutneas e subcutneas das micoses sistmicas resultam de Deteco de DNA/RNA
disseminao hematognica e, raramente, proveem de ino- Deteco de metablitos fngicos
culao direta aps traumatismo, especialmente em aciden- Intradermorreao
te laboratorial. Inoculao em animais
Especificamente em relao ao hemocultivo, nas ltimas
duas dcadas houve grande progresso nos procedimentos de Em termos gerais, a interpretao dos exames sorolgi-
isolamento fngico a partir do sangue perifrico. Iniciou-se cos no considerada totalmente confivel, pois os testes

disponibilizados, at o presente momento, apresentam sen- colgico, seja na medicina humana, seja na veterinria. O de-
sibilidade e especificidade muito variveis. Por outro lado, a senvolvimento de novos testes visando deteco de DNA ou
especificidade das tcnicas de citologia, de cultivo e de his- RNA espcieespecfica, a partir de espcimens clnicos, veio
topatologia, pode ser considerada muito elevada se o profis- aumentar, com muito maior acuidade e rapidez, a possibili-
sional for bastante experiente e o laboratrio bem equipa- dade de um diagnstico correto.122 Testes baseados na reao
do, enquanto que a sensibilidade baixa, em termos gerais, em cadeia da polimerase (PCR) e sequenciamento do DNA
devido ao nmero varivel de elementos fngicos na rea fngico j vm sendo utilizados, ainda que em escala muito
lesional.57 reduzida, em alguns laboratrios de diagnstico veterinrio.
Os mtodos tradicionais (Figuras 2.1 e 2.2), so, ainda,
muito utilizados na maioria dos servios de diagnstico mi-
ETAPAS DO DIAGNSTICO DOS FUNGOS FILAMENTOSOS
EXAME DIREITO OU
HISTOPATOLGICO
Hifas asseptadas ou com pouco Hifas septadas com dimetro

septos/dimetro irregular (6 a 15m) regular (<=5m)
MACROMORFOLOGIA MACROMORFOLOGIA
Crescimento rpido ou lento, textura penugenta,

Crescimento rpido preenchendo toda a
aveludada, algodonosa ou pulvurulenta, com
placa, textura com denso miclio algodonoso,
colorao esbranquiada, diversas matizes de cores
com colorao branca, acinzentada a amarronzada
de cores at marron ou verde-escura a totalmente preta
MICROMORFOLOGIA MICROMORFOLOGIA
Miclio com hialinas largas, asseptadas Miclio com hifas septadas, com
(ou raramente com septos), com propgulos propgulos fngicos externos (condios)
fngicos internos (esporos) com 2 a 5 m de dimetro
Estruturas fngicas com Estruturas fngicas

diversas composies com diversas composies
ZIGOMICETOS de cores escuras a pretas de cores claras
FEOHIFOMICETOS HIALOHIFOMICETOS
FIGURA 2.1. Etapas do diagnstico dos fungos filamentosos.

ETAPAS DO DIAGNSTICO DAS LEVEDURAS E FUNGOS LEVEDURIFORMES
CULTURA PURA
ASPECTO COLONIAL
Branco Creme/ Rosa Coral Creme/Irregilar

Cremosa Mucide Vermelho Aspecto Micelial
MICROMORFOLOGIA MICROMORFOLOGIA
Blastocondios hifas Blastocondios Blastocondios

Pseudo-hifas Hifas Artrocondios
Rhodotorula spp.
UREASE UREASE
TUBO
GERMINATIVO + +
TINTA DA CHINA
+
Trichosporon spp.* Geotrichum spp.*
(cpsula)
(Levedura) (Fungo Filamentoso)
C. albicans
Assimilao de
+
C. tropicalis
Carboidratos Cryptococcus spp.
Fermentao AGAR SEMENTE NIGER Cryptococcus luteolus Artrocondios Artrocondios
CLAMIDOSPORO e Blastocondios
+
+ Cryptococcus Assimilao
C. albicans Candida spp. neoformans de Carboidratos
Cryptococcus spp.
FIGURA 2.2. Etapas do diagnstico das leveduras e fungos leveduriformes.
Os mtodos histolgicos de rotina esto sendo aperfei- QUADRO 2.3. Material de origem cutnea/subcutnea.
oados pelo desenvolvimento de tcnicas especficas de Material Tcnica Principais indicaes
imuno-histoqumica (IHQ), as quais permitem identifica-
Dermatofitose, Malasseziose
o de espcies, mesmo a partir de tecidos fixados e emblo- Escamas, crostas Raspado, carpete
Candidose
cados. 2 Tais avanos tecnolgicos, provavelmente, nunca
podero substituir totalmente a metodologia tradicional de Pelos Raspado, pinagem Dermatofitose
diagnstico das micoses animais, embora exista a expectati- Unhas, garras Raspado Dermatofitose
va de uma notvel melhoria na identificao de certos agen- Cerume Curetagem, suabe zaragatoa Malasseziose
57
tes que normalmente so difceis de serem detectados.
Abscesso Puno, biopsia Criptococose, Esporotricose
Um protocolo rotineiro para a conduta inicial de diag-
nstico das micoses, deve estar correlacionado com os qua- Ndulo Puno, biopsia Criptococose
dros sintomatolesionais, assim como ao exame fsico e aos Criptococose, Candidose,
Ulcera Puno, biopsia
dados oriundos de exames complementares. Da mesma for- Esporotricose, Feohifomicose
ma, para se otimizar a identificao do agente causador, os
achados histopatolgicos devem ser acompanhados dos re- A coleta de espcimens clnicos deve ser realizada assep-
sultados obtidos do cultivo, imuno-histoqumica e dos testes ticamente. As leses cutneas devem ser limpas com lcool
mais recentes baseados na deteco de anticorpos, antgenos 70GL, evitando-se as solues iodadas, que dispem de ao
57
ou de DNA/RNA fngicos. antifngica. No Quadro 2.3 so apresentadas as tcnicas de

obteno de materiais de origem cutnea e subcutnea. O vo-

lume e a qualidade do espcimem obtido relacionam-se de
maneira direta eficcia diagnstica. O tempo transcorrido
entre a coleta e o processamento laboratorial deve ser o me-
nor possvel e, preferencialmente, no deve ultrapassar duas
horas, principalmente nos casos de leses cutneas midas
devido possibilidade de proliferao bacteriana.47
Outro aspecto relevante que o animal no deve estar
sendo tratado com antifngicos, tpicos ou sistmicos, por
um perodo mnimo anterior de uma semana, pois a utiliza-
o prvia dessas substncias pode inibir o crescimento ou
modificar a morfologia fngica, dificultando sobremaneira
o diagnstico.150
A seguir, so apresentados, de forma resumida, os mto-
dos de diagnstico, atualmente disponibilizados e aqueles
ainda em fase de desenvolvimento, das micoses, com clssi-
ca apresentao cutnea ou subcutnea, alm daquelas de-
nominadas profundas ou sistmicas e que, eventualmente, FIGURA 2.3. Teste da Lmpada de Wood: positivo para Microsporum canis. Pelame
tambm causam manifestaes clnico-dermatolgicas. longo. (Mauro Machado, HCV-UFRGS, RS).
Convm ressaltar que, alm da casustica estritamente fn-
gica, outras doenas, com repercusses dermatolgicas, se-
ro brevemente abordadas, em funo de serem tradicional-
mente apresentadas em tratados de diagnstico micolgico,
a exemplo das chamadas doenas parafngicas (pitiose e ri-
nosporidiose), as algoses (prototecose) e as actinomicetoses
(nocardiose e dermatofilose), que so causadas por bactrias
filamentosas.
1. DERMATOFITOSES
Os dermatfitos, fungos de distribuio universal, inva-
dem estruturas queratinizadas, como pele, pelos/cabelos e
unhas. Mais de 30 espcies de dematfitos so reconhecidas
e classificadas em trs gneros anamrficos: Microsporum,
Trichophyton e Epidermophyton. As espcies que tm a fase
sexuada conhecida so classificadas no gnero teleomrfico
Arthroderma, dentro do filo Ascomycota. Em animais as FIGURA 2.4. Teste da Lmpada de Wood: positivo para Microsporum canis. Pelame
doenas podem ser denominadas mais especificamente de curto. (Mauro Machado, HCV-UFRGS, RS).
microsporose ou tricofitose. O gnero Epidermophyton al-
berga apenas a espcie E. floccosum, que raramente acomete Os matizes de cores mais observadas na fluorescncia
animais.33,173 positiva para o M. canis so verde-ma ou amarelo-esver-
deado, embora em alguns casos, os pelos possam ter uma
2. LMPADA DE WOOD cor azul-esverdeada. Observaes de fluorescncia de cores
Em animais de companhia, o teste com a Lmpada de mais comumente associadas a resultados falso-positivos in-
Wood serve como triagem inicial para deteco da dermato- cluem: branca-azulada (escamas epidrmicas), reas amare-
fitose causada por Microsporum canis, embora outras esp- ladas (seborreia), vermelho-coral (descolorao da pele de-
cies (M. distortum, M. audouinii, M. ferrugineum e Tricho- vido medicao tpica), e tambm verde-ma simile
phyton schoenleinii) incomuns nos animais possam gerar (fibras sintticas de carpete). Nos casos confirmados de der-
fluorescncia. bastante til para seleo dos pelos para a matofitose, a Lmpada de Wood pode ser usada para moni-
submisso ao exame direto e para cultura com a finalidade torar a resposta ao tratamento. Dependendo do estgio da
de confirmar a presena do M. canis (Figuras 2.3 e 2.4). Os infeco os padres de fluorescncia dos pelos podem variar
gatos com leses ativas de dermatofitose so os pacientes bastante. Durante a infeco ativa (s vezes j no estgio ini-
mais provveis de apresentarem pelos fluorescentes.150 cial), o pelo inteiro est fluorescente. Durante o tratamento,

medida que a infeco vai regredindo, somente a parte de uma a duas horas paras as unhas, enquanto que as esca-
mais distal do pelo a que se mostra fluorescente e, tambm, mas podem ser examinadas de imediato. Deixar o prepara-
47
o nmero de pelos fluorescentes decresce. do para ser examinado muito tempo depois, ou acelerar a
A fluorescncia devida interao entre a luz UV e o reao de clareamento poder ressecar o KOH, levando ao
metablito (triptofano) do M. canis que est infectando o diagnstico errado de artrocondios (denominados pelos
pelo, mas essa mesma reao no ocorre com os elementos autores de artefatocondios).
fngicos presentes nas escamas. O tamanho e a disposio dos artrocondios (Figura 2.5)
O maior problema com a interpretao dos resultados diferem um pouco de acordo com o dermatfito. Como
obtidos com essa tcnica o seu relativo baixo valor prediti- exemplos, podem ser citados os agrupamentos de pequenos
vo negativo. Alguns tratamentos tpicos base de halogena- (2-4 m) artrocondios no parasitismo pilar causado por M.
do (Iodo) podem eliminar a fluorescncia, escamas infecta- canis ou cadeias de pequenos (2-3 m) artrocondios por
das no so fluorescentes e os pelos parasitados por outras Trichophyton mentagrophytes.
espcies de dermatfitos que normalmente acometem ani-
mais, jamais fluorescem. Da mesma forma, no recomen-
dvel a utilizao de lcool 70GL imediatamente antes des-
se exame. Por essas razes, os resultados obtidos com a
Lmpada de Wood devem ser rotineiramente confirmados
47
pelo exame micolgico direto e cultura fngica.
EXAME DIRETO
O exame microscpico (fungoscopia) visa detectar a pre-
sena de hifas e artrocondios na situao de parasitismo pi-
lar. Os artrocondios so as formas infecciosas mais frequen-
temente associadas ao parasitismo pilar. So eles formados
173
pela fragmentao das hifas nas estruturas queratinizadas.
Essas formas so bastante resistentes e podem permanecer
viveis por meses, ou mesmo anos, em distintos ambientes.
muito importante salientar que as hifas e os artrocon- FIGURA 2.5. Presena de artrocondios. Parasitismo pilar do tipo ectothrix. Exame
dios podem ser confundidos com alguns artefatos muito se- direto com KOH 10% (Obj. 40).
melhantes como, por exemplo, fibras de algodo (usados
para a desinfeco), materiais sintticos, gotas de gordura, Exame com corante
detritos vegetais e, na epiderme, cristais de colesterol depo- Raspados cutneos preparados com corantes Giemsa,
sitados em torno das clulas, formando um mosaico mistu- Wright-Giemsa (ou outros usados em citologia) permitem
rado s hifas. uma melhor visibilizao dos artrocondios dispostos (Figu-
ra 2.6) ao longo da haste pilosa, alm de ser uma tcnica de
EXAME DOS PELOS fcil e rpida execuo.37
O aspecto e a estrutura dos plos so variveis em fun-
o do hospedeiro e, consequentemente, a observao do
parasitismo pilar mais fcil em gatos e coelhos, pois so
37
animais com pelos mais finos. Por outro lado, necessrio
um tempo mais prolongado de clareamento e uma micros-
copia mais detalhada para se poder firmar o diagnstico a
partir de amostras de espcies como a canina e a equina que
tm o pelame mais espesso e, em geral, com pigmentao
mais escura.
Exame clssico
So utilizados produtos clareadores, dentre os quais, o
mais empregado o Hidrxido de Potssio (KOH) em con-
centraes entre 10 e 20%, para o exame dos pelos e das es-
camas epidrmicas, e a 40% para unhas, garras e cascos.
FIGURA 2.6. Presena de artrocondios. Parasitismo pilar do tipo ectothrix. Exame
recomendvel deixar o preparado (montagem entre lmina e
direto com KOH 10% + tinta Parker (Obj. 40).
lamnula) repousar no mnimo 30 minutos para os pelos e

O material distribudo numa lmina limpa e deixado se- outras combinaes de filtro, tais como G-365 e LP420. O
car ao ar para posterior colorao. Nesse tipo de exame im- procedimento consiste em adicionar uma gota da soluo de
portante que a rea lesada seja suficientemente raspada para calcoflor e uma gota de KOH 20% na lmina com o mate-
ocasionar uma escoriao, pois o sangue e as protenas sricas rial a ser examinado. A parede fngica liga-se ao calcoflor,
facilitam a fixao dos pelos na lmina, evitando que eles sejam facilitando a visibilizao dos elementos fngicos em tecidos
removidos durante o procedimento de colorao e lavagem. e em outros espcimens. Os elementos fngicos aparecem
Se for observada a presena de artrocondios, o trata- em azul ou verde, dependendo da fonte luminosa. O calcof-
mento pode ser imediatamente iniciado, pois o diagnstico lor tambm pode ser usado para a observao da micro-
laboratorial da dermatofitose j est confirmado. Ainda as- morfologia de cultivo e, para alguns pesquisadores, os resul-
sim, recomendvel a realizao da cultura fngica para a tados so superiores aos obtidos com o emprego do
identificao especfica do agente em questo, o que permite tradicional lactofenol (Azul de algodo/Azul de Aman).
orientar quais as medidas profilticas pertinentes devem ser
preconizadas e adotadas.33,47 EXAME DOS GROS
Para a obteno desse material preciso que o veterinrio
EXAME DA EPIDERME E DAS UNHAS tenha em mente a possibilidade de se tratar de um caso de
Para o exame da epiderme (ou escamas) tambm podemos pseudomicetoma, atravs da observao de ndulo(s) que
recorrer ao emprego de agentes claredores (p. ex., KOH 10%) ou pode(m) ou no estar fistulizado(s). A abertura do ndulo re-
da citologia (citofungoscopia). A microscopia revelar a presen- vela um contedo finamente granuloso e melicrico (Figura
a de hifas hialinas, as quais, eventualmente, podero ter as- 2.7), onde, aps montagem com KOH 10% entre lmina e la-
mnula, o exame microscpico revela a presena de estruturas
pecto segmentado embora no sejam artrocondios. Em geral, 47
vesiculosas e hifas septadas hialinas (Figura 2.8).
quando acompanhado das leses mais caractersticas, o resul-
tado positivo considerado altamente sugestivo da dermatofi-
tose. Se persistir qualquer dvida, recomendvel esperar o
resultado da cultura para se iniciar o tratamento sistmico.14
O exame de fragmentos de unhas ou de garras deve ser rea-
lizado a partir de material obtido pela raspagem (com bisturi
ou objetos pontiagudos como pontas de tesouras) da regio afe-
tada (quase sempre da poro distal das unhas). Os primeiros
raspados devem ser eliminados devido ao acmulo de agentes
contaminantes. As escamas obtidas das partes mais profundas
da leso so usadas para o exame micolgico. Quando as unhas
forem distrficas, obtm-se a amostra com tesoura.150
O material queratinizado, que bastante enrijecido, exi-
ge para melhores resultados, o emprego de solues como FIGURA 2.7. Presena de gros melicricos de consistncia macia aps exciso de
KOH 30 a 40%. A microscopia direta tambm revelar a pre- ndulo subcutneo em gato. (Ren Chermette, Service de Parasitolo-
sena de hifas hialinas, as quais eventualmente podero ter gie-Mycologie/ENVA,Maisons Alfort, Frana).
aspecto segmentado. Na maioria dos casos, essa observao
est relacionada com atividade dermatoftica, embora mui-
tos casos de onicomicoses possam ser causados por outros
hifomicetos, que normalmente vivem em saprobiose.47,150
Alternativamente, recomendvel acrescentar tinta Pa-
rker (azul preto permanente) soluo de KOH (concentra-
o opcional), pois aquela deixa os elementos fngicos (hifas
e/ou blastocondios) presentes na pele ou unha, com cor
azulada, o que facilita muito a visibilizao. Para acelerar o
processo, recomenda-se passar rapidamente a lmina por
sobre a chama do bico de Bunsen e depois coloc-la na base
da estufa (37C) por 30 minutos ou deixar, tambm, de um
dia para outro em cmara mida.
Outra opo de reativo para auxiliar a observao das
FIGURA 2.8. Presena de hifas septadas hialinas e estruturas vesiculosas (Detalhe).
estruturas o calcoflor, sendo necessrio apenas o empre-
Exame direto do gro em KOH 10% (Obj. 40). (Ren Chermette,
go de microscpio ptico com luz UV, filtro K530 e barreira
Service de Parasitologie-Mycologie/ENVA, Maisons Alfort, Frana).
BG12 (como para fluorescena). Tambm so compatveis

CULTIVO do crescimento de uma variedade de fungos saprbicos devido

O cultivo micolgico continua sendo o mtodo padro- contaminao de algumas amostras (Figura 2.9), notada-
-ouro para o diagnstico da dermatofitose e nico mtodo mente daquelas obtidas de ces com pelame longo.33,47
para a identificao fenotpica das espcies de dermatfitos.
Dependendo da localizao e aspecto das leses, as amostras
obtidas de pelos, escamas, crostas, unhas e tecidos biopsia-
dos (especialmente nos casos de pseudomicetomas) so
cultivadas em meios com formulao especfica. A rea lesa-
da deve ser previamente desinfetada com lcool a 70GL
para remover detritos e sujidades e limitar o crescimento de
contaminantes. Em raas de pelame longo recomendvel,
para diminuir a probabilidade de crescimento de fungos sa-
prbicos, que se faa uma prvia tricotomia da poro distal
dos pelos, pois os dermatfitos desenvolvem-se nas reas
prximas epiderme e ao longo do folculo piloso e nunca
nas extremidades.47,150
Amostras obtidas das bordas de leses mais recentes
permitem uma porcentagem maior de cultivo positivo. Pode
se raspar o local afetado, com lmina ou bisturi, ou realizar FIGURA 2.9. Fungos contaminantes (hialohifomiceto (esquerda) e feohifomiceto
a avulso dos pelos que fluorescem ao exame feito com a in- (direita)) e bactrias em amostra obtida sem prvia desinfeco.
terposio da Lmpada de Wood. Carpetes135 ou escovas de
cabelo ou de dentes 131 esterilizadas tambm so muito em- Os dermatfitos so aerbicos estritos e a maioria cresce
pregados para se obter material das reas lesionais suspeitas lentamente no gar SCC e, usualmente, so identificados
ou para se investigar a presena de artrocondios em ani- por caractersticas macroscpicas, como textura da superf-
mais sem infeco (simples portadores sos) ou com infec- cie da colnia, topografia e pigmentao, que podem ser
o pr-clnica. Nos casos de suspeita de onicomicose, im- bastante variveis e, portanto, so critrios de menor confia-
portante analisar amostras das unhas e do leito ungueal. bilidade. Por outro lado, estruturas microscpicas, tais
O cultivo fngico tambm pode ser til para distinguir como macrocondios e microcondios so os elementos mais
animais que esto no estgio inicial do processo infeccioso indicados para confirmar a identificao das espcies, mui-
(ainda sem rea alopcica) dos verdadeiros portadores assinto- to embora, no raramente, sejam cultivados isolados atpi-
mticos (aqueles que nunca desenvolvero leses). O nmero cos. Para se verificar os detalhes dos condios, necessrio
de colnias fngicas, comumente, muito maior em amostras um cuidado especial no preparo da lmina a ser observada
obtidas do primeiro grupo de animais. Entretanto, preciso (Tcnica de Riedel) e a utilizao de meios estimuladores da
considerar, para a correta interpretao dos resultados, que produo de condios.107
eles so dependentes do grau de contaminao ambiental.47
Havendo a possibilidade da realizao de cultivos repeti- gar Borelli
dos de um mesmo animal, muitos desses considerados apenas Muitas vezes necessrio o emprego de meios especiais
como portadores tero suas amostras cultivadas ora positivas, como o gar Borelli ou Lactrimel, meio enriquecido que se
ora negativas para o dermatfito persistente no ambiente. presta para estimular a conidiao de alguns hifomicetos e,
especialmente, daqueles dermatfitos que no produzem co-
Meios clssicos ndios na primocultura.
gar Sabouraud Cloranfenicol-Ciclo-heximida (SCC)
Existe uma variada gama de meios de cultivo, mas o gar gar Batata
Sabouraud glicosado suplementado com ciclo-heximida A ultilizao desse gar constitui uma proposta, total-
(Actidione) para evitar crescimento de contaminantes e fr- mente contrria a anterior, isto , fazer subculturas em meios
macos antimicrobianos como cloranfenicol, o mais empre- pobres para promover a formao de propgulos fngicos.
gado para as primoculturas. Na micologia veterinria, o uso importante salientar a existncia de outros meios con-
de placas de Petri (em substituio aos meios distribudos em cebidos com a finalidade de estimular a formao de con-
tubos inclinados, muito utilizados em micologia humana, dios. Para a manuteno de uma micoteca, fundamental
que ocupam menos espao e so mais econmicos por unida- que se faa um rodzio dos meios empregados nos sucessivos
de) fundamental para aumento da porcentagem de xito de repiques, para diminuir a ocorrncia de pleomorfismo que,
isolamento dos dermatfitos, pois apesar da presena de im- na maioria das vezes, irreversvel e acarreta a perda das
pedientes nos meios de cultivo, sempre existe a possibilidade caractersticas fenotpicas essenciais para a especificao.

gares Trichophyton amostras humanas demonstrou excelente especificidade e

Por outro lado, muitos dermatfitos raramente produ- sensibilidade. recomendvel que o DIM seja testado, na
zem condios e, alm disso, as colnias so muito semelhan- prtica veterinria, para avaliao comparativa com os
47
tes e no podem ser identificadas to somente por critrios atuais meios disponveis.
morfolgicos. Desde 1957, foi proposta uma metodologia
taxonmica baseada em requerimentos nutricionais de al- Macro e micromorfologia
gumas espcies do gnero Trichophyton que acometem prin- Neste captulo, ser citada apenas a casustica mais fre-
cipalmente grandes animais, como T. verrucosum (inositol, quentemente associada s dermatoses fngicas de animais
tiamina, ou tiamina e inositol) em bovinos, e T. equinum de companhia e de guarda, especialmente ces e gatos.
(cido nicotnico) em equinos. Outras espcies, como T.
Microsporum canis
mentagrophytes e T. rubrum, aparentam ser independentes
, indubitavelmente, o dermatfito zooflico mais isola-
(autotrficas) de qualquer suplementao vitamnica. Esses
do de gatos e ces, assim como de uma grande variedade de
meios especiais tambm podem ser utilizados para auxiliar
outros animais domsticos. importante agente de zoono-
no diagnstico de isolados atpicos.47,173
se, sendo comumente isolado de crianas e adultos. Dados
importante salientar que esses meios (distribudos em
oriundos de muitos levantamentos demonstram sua fre-
tubos) so utilizados para caracterizar cultivos puros (obti-
quente ocorrncia em humanos, a qual j supera, em alguns
do da primocultura), sendo o inculo pequeno e realizado
casos, a prevalncia de dermatfitos antropoflicos, outrora
em tubos (no se deve utilizar as amostras obtidas direta-
predominantes.
mente das leses).
Apresenta crescimento rpido, entre 4 a 10 dias. Col-
Meios especiais nias espraiadas, de tonalidade branquicenta a creme, com
DTM textura que varia de plana a algodonosa, podendo apresen-
Desde o seu desenvolvimento, esse meio especfico para tar sulcos radiais (Figura 2.11). O reverso ostenta geralmente
isolamento de dermatfitos (Dermatophyte Test Medium), matizes entre amarelo-ouro e amarelo-alaranjado. Na maio-
inicialmente concebido para auxiliar os dermatologistas hu- ria das vezes, ocorre a produo de numerosos macrocon-
manos, tornou-se popular entre os clnicos veterinrios de dios, fusiformes e verrucosos, de paredes espessas e com
pequenos animais porque rapidamente pode indicar a etiolo- vrias (de 5 a 15) septaes (Figura 2.12). Alguns isolados
gia dermatoftica (Figura 2.10). Existem poucos trabalhos de no apresentam conidiao ou pigmentao em primoculti-
avaliao desse meio com material obtido de animais. Uma vo, ento recomendvel o subcultivo em gar Lactrimel ou
pesquisa, com o emprego de pelos de cobaios infectados expe- em gros de arroz, polidos e autoclavados. Os microcondios
rimentalmente, claramente demonstrou que a rapidez da mu- so produzidos em quantidade variveis e no tm valor
64,107,173,184
dana de cor est relacionada temperatura de incubao e como critrio de diagnstico.
quantidade de pelos infectados semeados no DTM. A utiliza-
o desse meio apresenta o risco potencial de fornecer resulta-
dos tanto falsos-positivos, quanto falsos-negativos.92,173,200
FIGURA 2.10. Meio DTM. Cultivos com 10 dias. Resultado positivo para dermatfito
no tubo direita (meio torna-se vermelho).
DIM
Um novo meio chamado de DIM (Dermatophyte Iden-
FIGURA 2.11. Colnias de Microsporum canis obtidas de diferentes casos clnicos.
tification Medium) foi desenvolvido para diminuir sensi-
Cultivos (10 dias) em agar Sabouraud CC.
velmente os resultados falso-positivos. Um estudo com

Microsporum gypseum
Espcie geoflica que acomete vrias espcies animais e o
homem atravs do contato com o solo contaminado. Nos
animais domsticos isolada essencialmente de ces.
As colnias apresentam crescimento rpido que pode
ocorrer entre 3 a 5 dias. As colnias planas apresentam tex-
tura acamurada a pulverulenta com matiz amarelo-acasta-
nhado, com a parte central elevada (umbelicada). O reverso
pode apresentar variaes de cores que vo do rosa-alaranja-
do ao marrom-claro. Possuem macrocondios simtricos
que tm paredes finas e superfcie levemente rugosa, com
uma a seis septaes, sendo que a maioria tem a extremidade
levemente arredondada (Figura 2.14). Os raros microcon-
FIGURA 2.12. Micromorfologia de Microsporum canis. Macrocondios com paredes dios presentes, podem ter forma de clavas, mas no tm im-
espessas (Obj. 40). portncia diagnstica.14,64,107,173,184
Trichophyton mentagrophytes
O T. mentagrophytes apresenta duas variedades: T. men-
tagrophytes var. mentagrophytes (ou apenas T. mentagro-
phytes) a espcie zooflica, frequente em diversas espcies
animais, enquanto que T. mentagrophytes var. interdigitale
(ou, segundo outra classificao, T. interdigidale) adaptada
ao homem (antropoflica). A diferenciao entre as duas va-
14,64,107,173,184
riedades exige experincia laboratorial.
As colnias geralmente crescem rapidamente, so planas
com textura pulverulenta a granular, e matizes que podem
variar do branco-amarelado ao creme-bege. Os matizes do
reverso usualmente variam do amarelo-castanho ao casta-
nho-avermelhado.
Microscopicamente observa-se grande quantidade de FIGURA 2.14. Micromorfologia de Microsporum gypseum. Macrocondios com pare-
microcondios (Figura 2.13), de parede lisa, predominante- des delgadas (Obj. 40).
mente esfricos e densamente agrupados, o que lhes confere
o aspecto em cacho. Os macrocondios, quando presentes,
HISTOPATOLOGIA
tm um aspecto semelhante a um charuto, parede delgada e
As caractersticas histopatolgicas mais observadas na
lisa com uma a seis septaes. comum a presena de um
dermatofitose animal so de: a) foliculite e furunculose, b)
nmero muito varivel de estruturas especiais como hifas
hiperplasia perivascular ou dermatite intersticial e c) derma-
espiraladas e clamidocondios esfricos.
tite pustular intraepidrmica. Em ces, com infeco por
Trichophyton mentagrophytes, o exame pode revelar ainda
uma marcada acantlise epidrmica ou folicular e o quadro
poder ser confundido com pnfigo foliceo.164
As hifas e os artrocondios so facilmente detectados em
cortes histolgicos (Figura 2.15) de tecidos corados com ci-
do Peridico de Schiff (PAS), Metanamina argntica de Gro-
cott (GMS), corante de Bauer e Gridley. O exame histolgico
muito til nos casos de apresentaes atpicas de dermato-
fitose e para afastar as simples colonizaes fngicas evi-
denciadas nos animais portadores-sos.81,87,104
Esse exame, tambm, um excelente auxiliar no exame
dos gros quando da suspeio do quadro de pseudomiceto-
ma (Figura 2.16). Ocorre uma inflamao piogranulomatosa
com presena de clulas gigantes, macrfagos, neutrfilos e
FIGURA 2.13. Micromorfologia de Trichophyton mentagrophytes. Microcondios e
linfcitos ao redor dos elementos fngicos circundados por
hifas espiraladas (Obj. 40).
material eosinoflico amrfico.

IMUNO-HISTOQUMICA
Procedimentos de colorao imuno-histoqumica
(IHQ) tm sido usados para a identificao de pseudomi-
cetomas causados por Microsporum canis atravs da am-
plificao parcial do gene do rDNA 18S atravs da PCR.
Como nem sempre possvel o cultivo de isolados fenoti-
picamente compatveis com o agente etiolgico, a IHQ
deve ser considerada como uma valiosa ferramenta de
diagnstico.1,156
Nos ltimos anos, a IHQ vem se tornando um mtodo
rotineiro para a deteco e especificao de agentes infeccio-
sos em tecidos biopsiados ou necropsiados.
O princpio da IHQ similar ao teste ELISA indireto
realizado com amostras teciduais. A sensibilidade e especifi-
cidade da colorao pela IHQ so muito dependentes do an-
FIGURA 2.15. Diagnstico histopatolgico de dermatofitose aps dois cultivos nega- ticorpo primrio direcionado contra o antgeno-alvo. Os
tivos. Artrocondios (seta) parasitando o plo com infiltrado inflama- anticorpos variam significativamente em sua afinidade pelo
trio misto ao redor (H&E, Obj. 20). (Setor de Patologia Veterinria- antgeno-alvo e possuem diferentes nveis de reatividade
-UFRGS, RS). para antgenos similares ou associados.
Um fator que pode interferir negativamente na colora-
o IHQ um prolongado contato dos tecidos com a forma-
lina, pois ela interfere no reconhecimento do antgeno pelo
anticorpo devido ao grande nmero de ligaes entre as
protenas que ocorre durante a execuo da tcnica.
A maior vantagem da IHQ sobre os cultivos e outras tc-
nicas de diagnstico, a visibilizao do micro-organismo
in situ e a possibilidade de se avaliar as reaes que esto
ocorrendo no tecido infectado.57
DETECO DE DNA/RNA
Esses mtodos, que ainda esto em fase de desenvolvi-
mento, visam identificar qualquer tipo de fungo em qual-
quer rea no campo da micologia. Recentemente, vrios
avanos tecnolgicos foram obtidos com tcnicas baseadas
FIGURA 2.16. Exame histopatolgico dos gros: estruturas fngicas vesiculosas na PCR para deteco, identificao e quantificao dos
disseminadas em cimento eosinoflico circundado por reao pio- fungos, inclusive PCR em tempo real.57
granulomatosa. Pseudomicetoma em gato por Microsporum canis Em relao ao tempo necessrio para o estabelecimento
(PAS, Obj. 40). (Martine Mialot, Laboratoire IDEXX Maisons Al- do diagnstico, a PCR tem uma notvel vantagem em rela-
fort, Frana). o s tcnicas convencionais baseadas nos cultivos in vi-
tro. Embora a maioria dos dermatfitos possa ser identifi-
cada entre 10 a 15 dias, alguns podem requerer um tempo
Os mtodos histolgicos de rotina podem se tornar
bem maior. Um mtodo rpido de preparao do DNA ge-
mais eficazes quando associados com tcnicas de imuno-
-histoqumica, as quais permitem at a identificao da nmico dos dermatfitos permite a sua obteno, a partir
espcie. 57 do cultivo, em menos de uma hora. A amplificao e a de-
teco dos produtos da PCR so completadas dentro de
SOROLOGIA quatro horas. Portanto, um resultado definitivo poder ser
Vrios testes foram propostos para a deteco de anti- fornecido a partir de um primocultivo de dermatfitos em
corpos antidermatfitos em ces e gatos, e j foi demonstra- apenas um dia.127
do o potencial deles para monitorar a dermatofitose causada Alm disso, AP-PCR (Arbitrarily Primed Polymerase
por M.canis, entretanto nenhum se encontra, ainda, dispo- Chain Reaction) indubitavelmente fornece um resultado
nibilizado comercialmente.74,119,168 muito mais preciso que os mtodos convencionais porque

avalia caractersticas genotpicas. Uma vantagem suplemen- s reinfeces e dos portadores assintomticos. A falta de
tar da PCR que ela no requer organismos viveis para os desenvolvimento de uma adequada resposta mediada por
126
testes. clulas ao dermatfito tem sido sugerida como a provvel
O futuro desenvolvimento de tcnicas de isolamento de causa de dermatofitose crnica em alguns gatos.
DNA a partir de pele, pelos, unhas e garras, aumentar
enormemente a eficincia e especificidade na identificao 3. LEVEDUROSES
laboratorial dos dermatfitos. A seguir so, resumidamente, relacionadas as principais
Recentemente, um enorme passo nessa direo foi obti- etapas dos procedimentos e testes da metodologia conven-
do com a deteco do DNA de dermatfitos diretamente de cional, rotineiramente empregada, para a identificao das
material clnico. A PCR amplificou regies do DNA ribosso- principais leveduras e fungos leveduriformes causadores de
mal e foi possvel detectar DNA de vrias espcies de fungos, dermatomicoses em animais. Posteriormente, sero aborda-
inclusive dermatfitos, em amostras clnicas de origem hu- dos alguns testes mais especficos para o diagnstico de al-
206
mana e animal. Em outra pesquisa compararam-se os re- gumas leveduroses, tais como, malasseziose, candidose,
sultados do emprego da PCR-RFLP (Polymerase Chain criptococose e tricosporonose.
Reaction Restriction Fragment Lengthy Polymorphism),
no qual fragmentos de DNA do dermatfito, contidos no
CULTIVO
material de leso, foram extrados, amplificados e, poste-
importante que somente amostras frescas sejam cultiva-
riormente, digeridos com enzimas de restrio para o diag-
das. Para o isolamento primrio de espcies potencialmente
nstico especfico. Os resultados apresentaram uma corres- 0 0
patognicas, a cultura deve ser incubada entre 30 C e 37 C. O
pondncia de 98,7% com os obtidos no cultivo em gar
130 perodo de incubao usualmente varia entre trs a sete dias.
Sabouraud cloranfenicol-ciclo-heximida (SCC).
As colnias de leveduras s devem ser identificadas,
Por outro lado, o diagnstico baseado na deteco e
quando estiverem puras, ou seja, sem contaminao por
identificao de DNA fngico contido no material prove-
bactrias ou outras leveduras. Os meios bsicos mais utiliza-
niente da leso dermatoftica, ainda no pode ser considera-
dos na rotina para a semeadura de amostras suspeitas de al-
do como metodologia recomendada para uso rotineiro, ten-
bergarem leveduras so: gar Sabouraud adicionado de clo-
do em vista a inexistncia, at o momento, de uma
ranfenicol (SC) e Yeast Medium (YM).
padronizao para os diferentes ensaios genticos, o alto
Atualmente, existem diversos testes laboratoriais, dispo-
custo dos reagentes utilizados, a infraestrutura necessria e,
nveis no mercado, para facilitar a identificao das levedu-
portanto, uma relao custo/benefcio que justifique a sua 9
53,184 ras. O grande entrave para a utilizao desses testes o alto
utilizao na rotina laboratorial veterinria.
custo e a baixa procura por diagnstico nos laboratrios de
diagnstico veterinrio.
INTRADERMORREAO
A recuperao de uma infeco dependente do desen- Macro e micromorfologia
volvimento de uma resposta imunocompetente. Sob o ponto A morfologia colonial no auxilia muito na distino
de vista clnico, a reao de hipersensibilidade do tipo retar- presuntiva das leveduras e deve ser interpretada com caute-
dado (DTH) via teste intradrmico (IDT) o meio de diag- la, pois os mesmos fatores (meios, temperatura e tempo de
nstico mais prtico, fcil e barato para avaliar a resposta incubao) que interferem no aspecto macroscpico dos
mediada por imunidade celular (CMI), e que pode ter apli- fungos filamentosos, tambm influenciam as caractersticas
cao clnica no que concerne ao diagnstico e acompanha- macromorfolgicas das leveduras. Observar as caractersti-
mento da dermatofitose. cas coloniais (Figura 2.17) como cor (branca/esbranquiada
Testes intradrmicos, com antgenos fngicos, e avalia- a mais comum, alm de creme, acinzentada, parda, amare-
o da reao DTH j vm sendo usados h muitos anos la, alaranjada, rosa e vermelha), brilho (brilhante, opaca),
para anlise da resposta CMI em humanos e, em outras es- forma (circular, oval ou fusiforme), margem (regular, irre-
pcies, como a bovina. gular, lobada ou difusa), superfcie (lisa ou rugosa), elevao
Recentemente, as reaes de hipersensibilidade dos ti- (plana, convexa ou umbilicada), consistncia (cremosa, mu-
pos imediato e retardado aos antgenos do Microsporum ca- coide, butirosa, glabrosa, membranosa, esfarelada, dura,
nis, foram estudadas em gatos com ou naquelas sem derma- seca). Apesar de o aspecto colonial ser um critrio macro-
tofitose e provvel que o teste intradrmico feito com morfolgico menos importante para uma distino presun-
extratos do M. canis possa ser usado para se investigar o es- tiva das leveduras, a colorao um importante procedi-
151
tado imune dos gatos com dermatofitose. Existem muitas mento de excluso. Por exemplo, a presena de cores
questes a serem elucidadas sobre o estado imune dos gatos avermelhadas (pigmentos carotenoides) indica provvel
cronicamente infectados, daqueles facilmente susceptveis diagnstico do gnero Rhodotorula.115,143,159

Assimilao de fontes de carbono

Esse teste baseado na capacidade de assimilao das
leveduras de determinadas fontes de carbono, tais como: gli-
cose, galactose, maltose, celobiose, trealose, lactose, melibio-
se, rafinose, inulina, amido solvel, xilose, L-arabinose, ra-
mnose, glicerol, eritritol, manitol, glucitol, citrato, inositol e
N-acetil-glucosamina. A capacidade ou no de assimilar
diferentes acares permite a separao das espcies de
acordo com seu padro de assimilao.
Assimilao de fontes de nitrognio

As leveduras e fungos leveduriformes possuem diferen-
tes capacidades de utilizar sulfato de amnio, asparagina,
peptona, ureia, nitrato de potssio, nitrato de sdio, lisina,
creatinina, aminas alifticas e alguns aminocidos aerobica-
mente como fonte de nitrognio. Dessa forma, a capacidade
de uma levedura em assimilar uma determinada fonte uma
caracterstica importante para identificao.
FIGURA 2.17. Presena de gros melicricos de consistncia macia aps exciso de
ndulo subcutneo em gato. (Ren Chermette, Service de Parasitolo- Crescimento em diferentes temperaturas
gie-Mycologie/ENVA,Maisons Alfort, Frana). As leveduras crescem numa ampla faixa de variao tr-
mica (0 a 47C) o que contribui para a identificao de algu-
A micromorfologia das leveduras, ao contrrio do que mas espcies. avaliada a capacidade de crescimento das
ocorre com os fungos filamentosos, no apresenta muita di- leveduras e fungos leveduriformes nas temperaturas de 37,
40 e 42C. As espcies patognicas usualmente se desenvol-
versidade. Por ter poucas estruturas fngicas que permitam
vem entre 30 e 37C, sendo o crescimento a 37C bem carac-
a identificao das espcies, o exame microscpico deve ser
terstico. O teste realizado com a utilizao do meio caldo
acompanhado de estudo do perfil bioqumico. Porm, em
Sabouraud com cloranfenicol.
determinadas situaes, o exame microscpico das estrutu-
ras vegetativas e reprodutivas de alguns isolados primrios
4. MALASSEZIOSE
ou subcultivos pode subsidiar a identificao, pelo menos,
genrica das leveduras. Atravs de preparaes diretas e/ou Atualmente j so reconhecidas onze espcies epissapr-
cultivos em lmina possvel, com o uso de microscpico bias estritas do gnero Malassezia, sendo dez lipodependen-
tes como M. furfur, M. globosa, M. obtusa, M. restricta, M.
ptico convencional, objetivas de 10x e 40x e luz de baixa
sloofiae, M. sympodialis, M. dermatis, M. nana, M. japonica
intensidade, a visibilizao de estruturas como blastocon-
e M. yamatoensis, e uma lipidioindependente M. pachyder-
dios e seus tipos de brotamentos (uni, bi ou multipolar),
matis. A anlise genmica tem possibilitado uma classifica-
pseudo-hifas, tubos germinativos, clamidocondios e cpsu-
o mais confivel das leveduras que constituem o gnero
las, entre outras caractersticas.113,147,159
Malassezia, entretanto, ainda no h conhecimento sufi-
ciente para se estabelecer o nmero exato de espcies.11,44
TESTES FISIOLGICOS Recentemente, foi proposta a criao de duas outras espcies
Os testes fisiolgicos ou bioqumicos so utilizados para relativas aos animais, que seriam M. equina e M. caprae.34
a identificao final das leveduras, j que a maioria no pro- Algumas chaves tm sido propostas para diferenciar as
duz estruturas morfolgicas que permitam a sua distin- mais recentes espcies de Malassezia, utilizando caracters-
o.115,118,120,143,159 tiscas fisiolgicas e bioqumicas, alm da micromorfologia.
Basicamente a distino fundamentada no crescimento em
Fermentao de carbo-hidratos diferentes meios de cultivo e diversificada termotolerncia,
A fermentao alcolica pode ser considerada como a reao de catalase, atividade de beta-glicosidase, capacidade
oxidao anaerbica de um carbo-hidrato, por ao das le- de crescer em diversas concentraes de Twens e cremophor
veduras, com a produo final de etanol e CO2, alm de ou- EL como substratos fornecedores de lipdios, alm da hidr-
tros produtos secundrios. Se um carbo-hidrato for fermen- lise da esculina.91
tado, ele ser assimilado, porm o contrrio no Vrias tcnicas de citologia, cultivo e histologia j foram
necessariamente verdadeiro. Se a fermentao ocorre, a gli- utilizadas para a pesquisa quantitativa e qualitativa de M.
cose ser sempre fermentada. pachydermatis obtidas de vrias regies do corpo, tanto de

23
animais saudveis quanto daqueles com dermatopatias com os dados da anamnese e do aspecto do quadro clnico.
mas, ainda, no se conseguiu padronizar, nem determinar Cabe ressaltar que a frequncia e o nmero dos blastocon-
quais as mais eficazes. O cultivo continua sendo o padro- dios variam muito em funo do stio anatmico pesquisado
51,91,129
-ouro para se avaliar e comparar os resultados, principal- em ces.
mente no que concerne a sensibilidade e especificidade das Alguns autores consideram como resultado positivo se
129
tcnicas alternativas. forem observados, como valor mdio, mais de cinco blasto-
condios na epiderme e mais de dez no meato acstico em
EXAME DIRETO cinco campos microscpicos (aumento de 40x) escolhidos
91
Tcnicas citolgicas, por impresso em lmina de vidro aleatoriamente.
desengordurada, zaragatoas ou suabes da pele, raspados Quando se comparam os resultados da citologia e cultu-
cutneos e fita adesiva transparente (scotch test ou tape ra fngica, normalmente a levedura encontrada com maior
strip technique), so preconizadas para a contagem do n- frequncia na cultura do que no exame citolgico. Este lti-
mero de leveduras (Figura 2.18). A citofungoscopia, obser- mo muito til para o diagnstico de dermatites por Malas-
vada com fita adesiva, um dos mtodos mais utilizados, sezia sp., mas quando o resultado negativo, necessrio o
porm, vrios estudos comprovam que, apesar da boa espe- auxlio do cultivo para se excluir efetivamente a suspeita de
cificidade, a sensibilidade do teste baixa. Algumas dessas infeco mictica.
tcnicas parecem ser mais sensveis que outras, mas nenhu-
ma ainda aceita como padro. O exame pode ser feito com OBTENO DAS AMOSTRAS PARA CULTIVO
o emprego de corantes como Gram, Papanicolau e Rosen- O cultivo pode ser feito a partir de esfregao realizado
feld, May-Grunwald Giemsa, Panptico Rpido, Azul de com carpete esterilizado, de zaragatoa esterilizado do pela-
Aman (LPCB), Azul de Metileno, sendo realizado com au- me, do lavado cutneo ou do contato direto do meio de cultu-
23
mento de 400x, ou preferencialmente, com objetiva de imer- ra por sobre a rea lesional (tcnica das placas de contato).
44,51,60,91
so (1000X). As regies mais afetadas nos ces com malasseziose cutnea
so: abdominal, torcica, face, mentoniana, cervical ventral,
axilar, patas, regio interdigital e reas intertriginosas.
Atualmente, o mtodo mais utilizado o esfregao com
zaragatoa ou carpete (Figura 2.19) nas regies a serem anali-
sadas, por sua praticidade e por no ser necessrio depilar a
rea selecionada, principalmente em animais hgidos.
FIGURA 2.18. Malassezia pachydermatis. Presena de blastocondios no exame cito-

lgico atravs da tcnica da fita adesiva (Lactofenol azul de algodo,
Obj. 100).
Apesar de serem micro-organismos epissaprbios na

maioria dos vertebrados, difcil de encontrar leveduras de
FIGURA 2.19. Malassezia pachydermatis. Cultivo em meio de Dixon aps obteno
Malassezia pelo exame direto de impresso e, geralmente,
uma ou duas leveduras so achadas quando segmentos de 1 da amostra com carpete. (Mauro Machado, HCV-UFRGS, RS).
2
cm de lmina so examinados. A avaliao no nmero de
leveduras encontradas nos exames citolgicos, entretanto, O mtodo do lavado cutneo (detergent scrub techni-
ainda controversa. A presena de numerosas leveduras que) consiste num lavado regional (imerso da pele em so-
altamente significativa, enquanto que a interpretao do luo tampo-PBS contendo 0,1% Triton X-100) e posterior
achado de poucas leveduras deve ser sempre feita cotejando cultivo deste lquido de lavagem em gar Extrato de Malte

61
modificado. A tcnica, apesar de ser eficaz, muito demo- recomendados para cultivo de Malassezia sp., tais como os
rada, necessita de cooperao do paciente (por vezes at a meios de Dixon modificado, de Leeming e de Ushijima. A
sedao), no pode ser utilizada em todas as regies do cor- vantagem desses meios, principalmente o meio de Dixon
po e o material deve ser processado logo aps a obteno, modificado, que muito utilizado para o isolamento de Ma-
preferencialmente dentro de uma hora, devido progressiva lassezia pachydermatis, permitir o crescimento de outras
reduo na contagem de leveduras viveis. espcies de Malassezia (eventualmente presentes na pele de
ces e gatos) e tambm de alguns isolados de M. pachyder-
QUANTIFICAO DE MALASSEZIA SPP. NA PELE matis que requerem suplementao lipdica. J foi demons-
Um problema crucial para o diagnstico de malasseziose trado que outras espcies, como M. furfur e M. sympodialis,
cutnea reside na quantificao, pois como essa levedura podem ser encontradas na pele de ces, assim como j foi
comensal da pele, para se firmar com convico o diagnsti- encontrada uma alta porcentagem de M. sympodialis em ga-
co dessa dermatite necessrio comprovar uma elevada tos com otite.60
contagem de clulas fngicas. A temperatura da incubao pode influenciar no isola-
A tcnica das placas de contato eficaz e prtica para a mento principalmente quando se utiliza o meio de Sabou-
quantificao de Malassezia sp. na pele de animais com ma- raud, para o qual a melhor temperatura acima de 32C.
lasseziose, porm, parece no ser muito sensvel para detec- Para outros meios de cultura, as temperaturas de incubao
tar baixas populaes de Malassezia-comensal em animais variam de 25 a 37C, embora a temperatura tima de cresci-
hgidos. So utilizadas placas de contato quadriculadas (Ro- mento situa-se entre 32 e 35C.11,91
dac) com meio de Dixon (Figura 2.20), o que propicia que
ele entre em contato direto com a pele do animal.
23 Macro e micromorfologia
As colnias so foscas, convexas, eventualmente cnca-
vas, de cor creme e apresentam, em mdia, 5 mm de dime-
tro. A textura macia e frivel. Microscopicamente so leve-
duras de pequeno tamanho (2,0 2,5 x 4,0 a 5,0 m) de
formas esfricas, elipsoidais ou, mais raramente, alongadas
e que se reproduzem por brotamento unipolar em base lar-
ga. Hifas so raramente observadas no exame direto das le-
ses ou a partir dos meios de cultura.
TESTES FISIOLGICOS
A exigncia lipdica o primeiro critrio para a identifi-
cao desse gnero. Fisiologicamente, M. pachydermatis,
dentre as espcies de Malassezia, a nica capaz de crescer
em meios de culturas comuns (gar com glicose e peptona),
sem adio de cidos graxos de cadeia longa, sendo, portan-
to, esta caracterstica de lipidiofilia sem lipidiodependncia,
a principal forma de sua identificao. Ademais, apresenta
FIGURA 2.20. Malassezia pachydermatis. Cultivo em meio de Dixon aps obteno reao de catalase usualmente positiva, urease positiva e
da amostra com placa de contato (Rodac). (Mauro Machado, prova de colorao por DBB (azul de diazonium B) positiva.
HCV-UFRGS, RS). A incorporao de Tween 10% em gar glicose-peptona ini-
be o seu crescimento.
Por outro lado, o mtodo do lavado cutneo j propor- As outras espcies, que crescem somente em meios su-
cionou contagens at 100 vezes superiores quelas obtidas plementados com cidos graxos, so ditas lipodependentes.
com as placas de contato, sugerindo que a contagem por esse Essas leveduras so semelhantes e sua identificao correta
mtodo similar populao microbiana da pele, portanto, somente possvel atravs de anlise genmica.3,21,38
mais fidedigna que aquela mensurada pelas placas de conta-
61
to, pelas quais se subestimaria a real populao. HISTOPATOLOGIA
Frequentemente a presena de leveduras na superfcie de
CULTIVO leses escamocrostosas no est relacionada dermatite por
A utilizao do meio de Sabouraud em temperaturas en- Malassezia. Para caracterizar um caso de malasseziose cut-
tre 27C e 35C permite o isolamento da maioria das levedu- nea, necessrio encontrar numerosas leveduras no stio
ras. Entretanto, meios enriquecidos com lipdios tm sido dos folculos pilosos.

Entretanto, algumas alteraes histolgicas (Figura pica, a dermatite alrgica picada de pulgas e as alergias ali-
2.21) so evocativas de uma dermatite por Malassezia. A hi- mentares, frequentemente associadas com malasseziose
perplasia irregular da epiderme um dos principais achados cutnea.
para o diagnstico. Ela geralmente acompanhada de hiper- importante ressaltar que Malassezia pachydermatis
queratose orto ou paraqueratsica da epiderme e de hiper- comensal na pele canina e pode ser observada na queratina
queratose folicular compactada, o que favorece a prolifera- superficial em muitas dermatopatias cutneas, porm o
o das leveduras. Observa-se frequentemente a presena de achado de leveduras nos folculos pilosos parece ser muito
espongiose epidrmica multifocal associada exocitose de significativo para o diagnstico de malasseziose cutnea por
linfcitos intraepidrmica. A derme superficial est geral- histologia.
mente inflamada com a presena de uma dermatite perivas- A evidncia de leveduras em exames histolgicos de ani-
91,167
cular predominantemente com clulas mononucleares. mais com malasseziose cutnea clinicamente manifesta e
citologia apresentando vrias leveduras, ocorre em aproxi-
madamente 70% dos casos. Entretanto, vrios autores rela-
tam que mais comum encontrar-se leveduras de amostras
cutneas superficiais em exames citofungoscpicos do que
81,168,213
em histopatolgicos.
SOROLOGIA
Ces com dermatite atpica podem apresentar aumento
de resposta de anticorpos da classe Ig-E a alergenos deriva-
24,44
dos de Malassezia. Um aumento desses anticorpos tam-
bm j foi detectado no soro e em testes cutneos de hiper-
24,44
sensibilidade imediata. Entretanto, em ces com
dermatite por M. pachydermatis, no foram observadas rea-
26
es a esses alergenos.
Existem evidncias de que a multiplicao de Malassezia
FIGURA 2.21. Malassezia pachydermatis. Numerosos blastocondios na superfcie causando dermatite canina est associada ao aumento da
e entre restos celulares no estrato crneo (E.C.) de um co (H&E, resposta imune humoral, entretanto, os efeitos protetores
Obj. 100). (Martine Mialot, Laboratoire IDEXX Maisons Alfort, desta resposta no esto esclarecidos, pois mesmo ces que
Frana). apresentam altos ttulos de Ig-G apresentam dermatite por
25
esta levedura.
Em alguns casos pode-se observar, tambm, um festona- Protenas e carbo-hidratos parecem ser ambos impor-
mento das camadas mais profundas da epiderme, sem es- tantes antgenos de Malassezia spp., entretanto a proporo
pongiose marcante, associada inflamao drmica de in- de cada um varia durante o ciclo de vida da levedura.12 Ant-
tensidade variada, como descritas na displasia epidrmica genos de diferentes pesos moleculares tm sido detectados
dos ces West Highland White Terriers. em Malassezia spp. e vm sendo empregados para avaliao
Alguns dos critrios padronizados para o diagnstico de de resposta imune celular in vitro (ensaios imunolgicos) e
dermatite por Malassezia so: 1) pronunciada e irregular hi- in vivo (testes intradrmicos), sem contudo terem sido pa-
perplasia infundibular e epidrmica; 2) proeminente hiper- dronizados para uso em diagnstico.12,25
queratose paraquerattica infundibular e epidrmica; 3)
edema (espongiose) intracelular infundibular e epidrmica DETECO DE RNA/DNA
difusa; 4) exocitose linfoctica infundibular e epidrmica di- A diferenciao entre as vrias espcies lipodependentes
fusa; 5) dermatite superficial perivascular paraintersticial, s pode ser realizada atravs de anlise gentica, ainda no
quando linfcitos apresentam tipos celulares proeminente- incorporada rotina de diagnstico laboratorial veterinrio.11
mente inflamatrios, e 6) presena de leveduras com brota- Dentre os vrios mtodos empregados na tipificao das
mento unipolar na queratina superficial ou infundibular. Se espcies de Malassezia, a tcnica de eletroforese em campo
ao menos cinco desses critrios estiverem presentes, mesmo pulstil (Pulsed Field Gel Electrophoresis PFGE) revela-
sem nenhuma levedura encontrada, o diagnstico presunti- -se adequada, pois as espcies apresentam diferentes cari-
21
vo de dermatite por Malassezia sp.23,61,91,167 tipos, que so marcadamente estveis. Entretanto, essa
Todas essas alteraes histolgicas so sugestivas de tcnica tem mostrado pouco valor em investigaes epide-
uma dermatite por Malassezia, porm, tambm so comuns miolgicas, pois na maior parte dos casos, no detecta va-
21
a alguns tipos de hipersensibilidade, como a dermatite at- riaes intraespcie.

Utilizando a tcnica de amplificao aleatria do poli- CULTIVO

morfismo do DNA (Random Amplified Polymorphic Os meios bsicos utilizados rotineiramente so: gar Sa-
DNA RAPD) foram verificados subtipos intraespcie, su- bouraud adicionado de cloranfenicol (SC) e Yeast Medium
gerindo a presena de diferentes populaes e sua aplicabili- (YM), incubados na temperatura de 30C. Lembrar que al-
dade sob o ponto de vista epidemiolgico.
3,21,38
A presena de gumas espcies de Candida frequentemente isoladas de ca-
vrios subtipos genticos de Malassezia pachydermatis j foi sos clnicos (C. krusei, C. parapsilosis e C. tropicalis) so sen-
constatada no mesmo animal, inclusive nas mesmas regies sveis ciclo-heximida, que uma vez presente no meio pode
115,159
gerar resultados falso-negativos.
entretanto, at o momento, no se pode correlacionar dife-
renas genticas das subpopulaes com o papel que o mi- Macro e micromorfologia
cro-organismo est desempenhando, isto , comensal (mi- As colnias aparecem em gar SC como colnias de textu-
3,38
crobiota) ou patgeno (infeco). ra cremosa, branco-amareladas, observando um reverso com
199
o mesmo matiz do anverso e pigmento no difusvel no meio.
INTRADERMORREAO Preparar lminas a fresco a partir do crescimento de cul-
Os trabalhos de pesquisa apontam para o desenvolvi- tivo primrio, com no mximo uma semana de incubao.
mento de reaes de hipersensibilidade dos tipos imediata e As caractersticas micromorfolgicas a serem observadas
retardada aos antgenos fngicos. Recentemente, um estudo so: forma e tamanho da clula, pseudo-hifas com ramifica-
es e produo de blastocondios nos pontos de constrio,
evidenciou 34% de resposta do tipo imediata e 9% do tipo
155 alm de possveis hifas verdadeiras (Figura 2.22).
retardada em 50 ces com dermatite seborreica.
5. CANDIDOSE
O gnero Candida frequentemente isolado do homem,
de todas espcies de animais domsticos, de uma imensa va-
riedade de mamferos selvagens, de pssaros e, tambm, de
vegetais e at do solo. At o presente, no foi encontrada
Candida em anfbios. Isolar C. albicans do meio ambiente
uma condio excepcional e geralmente est relacionada a
45,172,199
uma contaminao, sobretudo com matria fecal.
As espcies mais comumente isoladas de quadros clni-
cos so: C. albicans, C. tropicalis, C. parapsilosis, C. glabra-
ta (Torulopsis glabrata) e C. krusei. Outras espcies menos
frequentes so C. lusitaniae, C. rugosa, C. pseudotropicalis e
C. guilliermondii. O estabelecimento do diagnstico da
candidose (cutnea, mucocutnea, sistmica e alrgica) FIGURA 2.22 Candida albicans. Presena de blastocondios e pseudo-hifas (Gram,
muitas vezes dificultado pelo fato de as espcies de Candi- Obj. 40).
da serem, tambm, frequentemente isoladas de indivduos
hgidos.172,197,205 TESTES FISIOLGICOS
Para o diagnstico diferencial podemos utilizar testes Formao de tubo germinativo
rpidos como induo da formao de tubos germinativos A prova do tubo germinativo um procedimento diag-
ou formao de clamidocondios (identificao de Candida nstico que fornece uma identificao presuntiva rpida de
albicans). Candida albicans. A estrutura representa o estgio inicial de
uma hifa verdadeira que se desenvolve a partir do blastocon-
dio (Figura 2.23). O seu desenvolvimento influenciado pelo
EXAME DIRETO
tamanho do inculo e pelas condies de cultivo (meio, mi-
Raspados de leses cutneas (ou de mucosas), podem
croaerobiose e temperatura de incubao). O inculo feito
ser examinados em montagens diretas com gua destilada,
em soro humano ou em clara de ovo e incubado a 370C por
KOH 10% ou ainda fixadas por corantes especficos. Po- 2-3 horas. O tubo germinativo formado dentro de duas ho-
dem ser encontrados blastocondios (clulas gemulantes) ras por C. albicans, mas outras espcies, como C. tropicalis
de forma ovoide, pseudo-hifas e, eventualmente, hifas ver- podem produzi-lo aps trs horas. Aproximadamente 95%
dadeiras. Uma vez que a filamentao representa in vivo das amostras de C. albicans so positivas nessa prova.59,64,143,159
indcio de patogenicidade, suspeita-se de candidose quan- O tubo germinativo difere da pseudo-hifa por no ser
do os elementos citados so observados diretamente na septado, apresentar paredes paralelas e no possuir constri-
16,197,199
amostra clnica. o na sua extremidade abaulada.

muito importante o conhecimento da espcie de Can-

dida causadora da infeco, pois existem diferentes perfis de
susceptibilidade entre elas, para se poder avaliar a probabili-
166
dade de sucesso teraputico no combate candidose.
FIGURA 2.24. CHROMagar Candida com isolados de C. albicans (verde), C. tropicalis

(azul), C. parapsilosis (branca) e C. glabrata (rosa). (David Ellis,
Mycology Unit, Womens and Childrens Hospital, Adelaide, Austrlia).
HISTOPATOLOGIA
FIGURA 2.23 Candida albicans. Formao de tubo germinativo (1300x). (David H presena de reao tecidual inflamatria supurativa
Ellis, Mycology Unit, Womens and Childrens Hospital, Adelaide, aguda, composta predominantemente por neutrfilos e lin-
Austrlia). fcitos. A formao de abscessos bastante comum, rara-
mente ocorrendo uma reao inflamatria do tipo granulo-
matosa. Blastocondios (estruturas de aspecto ovoide e
Produo de clamidocondios usualmente apresentando 3 a 4 m de dimetro) e pseudo-
A formao de clamidocondios serve como triagem em -hifas podem ser visibilizados em cortes histolgicos (Figura
culturas de leveduras possivelmente patognicas, servindo 2.25). Essas formas so melhor visibilizadas atravs de colo-
como um critrio de identificao. A tcnica preferencial o raes especiais, tais como PAS, GMS e Gridley. Algumas
microcultivo utilizando o meio gar fub. A produo de espcies de Candida sp. podem produzir, sob certas condi-
clamidocondios especialmente interpretada como diag- es, hifas verdadeiras.41,104,172,197,213
nstico presuntivo de Candida albicans. A colnia suspeita
inoculada atravs de estrias paralelas na superfcie do meio
e, posteriormente, coberta com uma lamnula. Aps 24-48
horas de incubao a 30C, so procuradas as seguintes ca-
ractersticas: formao de hifas, pseudo-hifas, blastocon-
101,115,147
dios e clamidocondios terminais.
GARES CROMOGNICOS
Entre os Sistemas Comerciais de Identificao, desta-
cam-se os chamados meios cromognicos (CHROMgar
Candida (Figura 2.24)/Candida ID (bioMrieux SA),
empregados na triagem e identificao rpida de espcies
patognicas como Candida albicans, C. parapsilosis, C. gla-
brata e C. krusei, alm dos testes bioqumicos que podem ser
realizados atravs do padro de assimilao de substratos
existentes no sistema de galerias API 20 e API 32 (bioM-
rieux SA), sendo ambos processados segundo a indicao
FIGURA 2.25. Candidose cutnea. Hifas septadas, pseudo-hifas e blastocondios em
do fabricante. Existem tambm outros testes comerciais dis-
epitlio necrtico (PAS contracorado com H&E, Obj. 20). (Setor de
ponveis comerciais. O grande entrave para a utilizao na
Patologia Veterinria-UFRGS, RS).
rotina desses testes o seu alto custo.

SOROLOGIA A maior parte dessas tcnicas ainda est em fase investi-

A deteco de anticorpos tem a sua utilizao limitada gatria, no havendo mtodos facilmente aplicveis para uso
por duas razes. Primeiro, a colonizao por Candida spp. em rotina.197 O diagnstico baseado na pesquisa de DNA
no trato gastrintestinal ou em outros rgos pode levar a tem vantagens como maior sensibilidade (significativamen-
uma falsa resposta em indivduos no infectados. E, segun- te melhor do que a dos testes convencionais), rapidez na res-
do, pacientes imunocomprometidos podem no apresentar posta e, portanto, reduo no tempo de identificao do
uma resposta detectvel.214 agente.149,197 Portanto, ele til para deteco de infeco
Para deteco de anticorpos em soro so utilizados os pr-clnica ou crnica, com baixos nveis de fungemia.149
testes de imunodifuso em gel (ID), imunoeletroforese quan-
titativa, ELISA e Aglutinao em Ltex (LA). O maior pro-
DETECO DE METABLITOS FNGICOS
blema em utilizar esses testes a baixa sensibilidade deles.197
O arabinitol um metablito liberado pela maioria das es-
Na realizao de imunodiagnstico, a combinao de tes-
pcies patognicas de Candida (exceto C. krusei e C. glabrata) e
tes (deteco de anticorpo e de antgeno) deve ser utilizada
encontra-se aumentado em fluidos corporais durante a infec-
para aumentar a sensibilidade do diagnstico de candidose.197
A deteco de antgenos de Candida em soro e fluidos o. As tcnicas para sua deteco geralmente utilizam soro,
corporais uma importante ferramenta de diagnstico, parti- embora o arabinitol tambm possa ser encontrado na urina.214
cularmente em pacientes imunocomprometidos que tm difi- As tcnicas para detectar arabinitol incluem a cromato-
culdade em produzir um limiar detectvel de anticorpos.197,199 grafia gs-lquido (CGL) e mtodos mais recentes que utili-
Vrias tcnicas tm sido descritas para deteco de ant- zam medio fluoromtrica-enzimtica.197
genos de Candida spp. Atualmente os testes mais ampla- A deteco desse metablito pode ter algum valor diag-
mente utilizados so aglutinao em ltex (LA) e ELISA, nstico. Contudo, nveis sricos de arabinitol podem estar
sendo alguns comercialmente disponveis, como o Cand- elevados em pacientes com insuficincia renal e algumas ou-
-Tec (Ramco Laboratories) e Pastorex LA (Bio-Rad). O tes- tras condies clnicas. Nesse caso, a proporo arabinitol/
te de aglutinao em ltex Cand-Tec foi o primeiro teste creatinina deve ser determinada.197
disponibilizado comercialmente, entretanto os resultados de
sua sensibilidade e especificidade so muito variveis.214 En- 6. CRIPTOCOCOSE
saios que empregam anticorpo monoclonal, como aglutina- Cryptococcus um gnero composto por vrias espcies,
o em ltex Pastorex Candida e Platelia Candida Antigen
dentre as quais Cryptococcus neoformans, uma levedura cap-
(Bio-Rad) (imunoensaio enzimtico), tambm so utiliza-
sulada, saprbica e ubqua. Normalmente a micose con-
dos. Embora eles tenham especificidade similar, o imunoen-
197 trada por inalao de propgulos desidratados e/ou basi-
saio mais sensvel do que o teste de aglutinao em ltex.
diosporos, encontrados em excretas e restos fecais de poleiros
Os antgenos detectados pelos diferentes sistemas in-
de pombos, solo e vegetais (inclusive rvores como eucalipto,
cluem manana (Pastorex), uma glicoprotena indefinida
figueira etc). Pode, no entanto, penetrar no organismo por
(Cand-Tec LA), uma protena 47 kDa (HSP), enolase (ELI-
197 via percutnea. As formas clnicas mais descritas so: cut-
SA) e mananosdeos especficos (Platelia). 124
A deteco direta de antgenos de Candida sp. possibilita nea, mucocutnea, pulmonar, enceflica, visceral e ssea.
o diagnstico precoce. A partir de diferenas filogenticas foi proposta uma va-
71
riedade denominada C. neoformans var. grubii. Entretan-
to, a tendncia de denominar como variedade grubii os iso-
DETECO DE RNA/DNA
lados de C. neoformans sorotipo A, inadequada na viso de
As tcnicas moleculares esto sendo amplamente utiliza-
taxonomistas e causa confuso na literatura mdica, uma
das na identificao de Candida spp., entretanto, poucos la-
boratrios veterinrios oferecem testes para a deteco de vez que nem todo C. neoformans sorotipo A obrigatoria-
DNA.109 Essas tcnicas so baseadas na amplificao do DNA mente variedade grubii.123
de Candida utilizando sondas especficas. Vrias sondas tm Atualmente, com base em estudos de filogenia e reviso
sido descritas, como actin gene (gene que codifica a citocro- de cruzamento sexuado, so reconhecidas duas espcies:
mo P450 14-lanosterol demetilase), chitin synthetase gene, Cryptococcus neoformans (antes C. neoformans var. neofor-
SAP genes, DNA mitocondrial e elementos repetitivos do mans) sorotipos A, D e AD, com correspondente sexuado
DNA de Candida (CARE).197 Algumas dessas sondas so es- Filobasidiella neoformans, e Cryptococcus gattii (antes C. ne-
pcie-especficas enquanto outras tm ampla especificidade. oformans var. gattii) sorotipos B e C, com correspondente
123
A deteco de DNA/RNA feita principalmente pela sexuado F. bacillispora.
tcnica de reao em cadeia da polimerase (PCR).13,57 Majo- Essas espcies diferem bioqumica, gentica, ecolgica e
ritariamente os estudos utilizam soro para deteco de epidemiologicamente.71,123,124,132
DNA, entretanto alguns deles analisam outros espcimens Outras espcies, como C. albidus e C. laurentii, tambm
clnicos como urina, aspirado traqueal e, ainda, material obtm sido isoladas de quadros clnicos descritos em humanos
tido de bipsias cutneas.149 e diversos animais.

O diagnstico laboratorial da criptococose fundamen- da filtrao ou centrifugao (5600 rpm por 30 minutos) e,
tado na demonstrao da levedura encapsulada presente na mesmo havendo pouca quantidade disponvel, devem-se
amostra clnica, isolamento com testes complementares e inocular no meio 3-4 gotas de espcimen clnico.
73,143,147,159
presena de antgenos circulantes. Dentre as vrias espcies do gnero Cryptococccus, ape-
nas C. neoformans e C. gattii so capazes de crescer sob tem-
EXAME DIRETO peratura de 37C.64
Em particular, pesquisa-se a presena de cpsula muco-
polissacardica quando existe a suspeita de se tratar da esp- Macro e micromorfologia
cie Cryptococcus neoformans. Blastocondios globosos so As colnias so cremosas ou gomosas, de consistncia
facilmente visualizados na maioria dos materiais clnicos, mole, de cor branca, canela ou marrom. As clulas so glo-
tais como lquido cefalorraquidiano (LCR) e pequenos frag- bosas, isoladas ou em pares, capsuladas, com parede grossa,
mentos de tecidos, em preparaes com KOH 10%, tinta da podendo apresentar brotamento.
China (tinta nanquim) ou nigrosina (colorao de fundo)
(Figura 2.26). A cpsula pode no estar presente.
120 TESTES FISIOLGICOS
A sntese de pigmentos de melanina, a partir do fenol,
propriedade caracterstica da espcie C. neoformans, devido
presena da enzima fenoloxidase.143 A produo da fenolo-
xidase caracteriza-se pela formao de colnias castanho-
143
-escuras ou negras em meio de cido cafeico , sendo um
teste til para diferenciar Cryptococcus de Candida.
gar Semente de Nger utilizado para recuperao e iden-
tificao de Cryptococcus. Esse meio adicionado de antimicro-
biano, a exemplo do cloranfenicol (Figura 2.27) tem sido reco-
mendado especialmente para espcimens contaminados, como
124
exsudato nasal e urina. Nesse meio ocorre produo de col-
nias de tonalidade marrom de Cryptococcus, possibilitando
64
diferenci-las de outras leveduras e de fungos filamentosos.
FIGURA 2.26. Cryptococcus neoformans. Presena de cpsula no exame direto com nigro-
sina (Obj. 100). (IPD-Complexo Hospitalar Santa Casa, Porto Alegre, RS).
Para preparar a montagem microscpica, uma gota do

sedimento centrifugado e uma alquota do material in natu-
ra devem ser misturadas a uma gota de tinta da China sobre
a lmina; uma lamnula justaposta e a preparao micros-
cpica examinada para se verificar a presena de blastoco-
ndios gemulantes com cpsulas.147
A partir de leses cutneas, como granulomas no plano
nasal de um gato, pode-se fazer um decalque ou um aspirado,
que , ento, distribudo e corado em lmina, para a procura
de blastocondios semelhantes aos pesquisados no LCR.133
CULTIVO
A cultura permanece sendo o mtodo definitivo para
diagnosticar a infeco. A levedura cresce bem em meios FIGURA 2.27. Cryptococcus neoformans. Crescimento de colnias marrons no agar
micolgicos padronizados, no seletivos, mas inibida pela Semente de Nger com antimicrobiano. (David Ellis, Mycology Unit,
ciclo-heximida. A identificao de C. neoformans baseia-se Womens and Childrens Hospital, Adelaide, Austrlia).
na presena de uma cpsula, na produo da enzima urease,
no padro de assimilao de substratos de carbono e em ou- O gar Canavanina glicina azul de bromotimol (CGB)
tras reaes bioqumicas especficas.153,159 til para diferenciar as espcies Cryptococcus neoformans e
Devem-se inocular aspirados e tecidos (processado em Cryptococcus gattii. A espcie C. neoformans no produz al-
homogeneizador) nos gares SC ou SC+BHI (SABHI), e interao na cor do meio CGB, enquanto que C. gattii apresen-
cubar a 37C. O crescimento ocorre em dois a seis dias. O ta cor azul cobalto resultante da hidrlise da glicina e conse-
132,146
lquido cefalorraquidiano pode ser processado pela tcnica quente aumento do pH de 5,8 para 7,0.

Riscos laboratoriais SOROLOGIA

H riscos quando ocorrer inoculao acidental de culturas A deteco de anticorpos sricos no tem interesse diag-
e de outros materiais contaminados, mordidas de camundon- nstico (em geral no ocorre soroconverso), mas sua even-
57
gos infectados experimentalmente, manipulao de materiais tual deteco no curso da doena um bom prognstico.
ambientais infectados (p. ex., fezes de pombo) e contato com Ao contrrio das outras micoses sistmicas, os procedi-
material contaminado com urina de animais infectados. Nos mentos sorolgicos utilizados no estabelecimento do diagns-
casos de exposio laboratorial o nvel de patogenicidade para tico da criptococose esto baseados na deteco de antgenos e
adultos imunocompetentes normais baixo. no de anticorpos. O teste de aglutinao do ltex evidencia a
Precaues recomendadas: nvel de biossegurana 1 presena de antgenos polissacardeos do Cryptococcus no
para o trabalho com materiais clnicos, com culturas e soro de animais com criptococose pulmonar e no LCR daque-
100
com animais infectados experimentalmente. Cabine de les com envolvimento do sistema nervoso central.
segurana biolgica classe II dever ser usada durante o O teste de aglutinao do ltex para deteco de antge-
manuseio de solo e outros materiais contendo clulas de nos polissacardicos criptoccicos, combinado com trata-
leveduras ou quando se trabalha com a fase sexuada do mento prvio com protease, no lquido cefalorraquidiano e
agente (Filobasidiella neoformans).171 no soro, um teste sensvel, especfico e simples de ser reali-
zado rotineiramente nos laboratrios clnicos (Figura 2.29).
O teste feito com partculas de ltex revestidas com anti-
HISTOPATOLOGIA
corpo anticriptoccico obtido de coelho. O antgeno polis-
A reao tecidual , inicialmente, uma degenerao mu-
sacardeo capsular presente na amostra liga-se aos anticor-
coide com reas de inflamao, assumindo uma aparncia 132,153
pos, aglutinando as partculas de ltex.
gelatinosa. Grande nmero de clulas arredondadas en-
contrado na matriz mucoide. Com o progresso das leses,
pode ocorrer reao granulomatosa. Os organismos decres-
cem numericamente e so normalmente encontrados no in-
terior de clulas gigantes e histicitos. Com a involuo do
quadro, os granulomas antigos apresentam clulas de leve-
dura mortas com a cpsula desintegrada. Eles podem ser
difceis de ser vistos nas preparaes corados pela H&E. As
leveduras so redondas, tipicamente encapsuladas e com 5 a
15 m de dimetro. Os blastocondios esto ligados por uma
81,87,41,81,87
base estreita.
Nos tecidos, C. neoformans (Figura 2.28) pode ser me-
lhor identificado em cortes corados com mucicarmim de
Mayer, que evidencia a cpsula em vermelho, facilitando o FIGURA 2.29. Teste de aglutinao do ltex para diagnstico de criptococose. Poos da
146
seu reconhecimento. A colorao argntica de Fontana parte superior: aglutinao positiva em trs amostras. Parte inferior: con-
Masson tambm pode ser utilizada para mostrar o depsito troles negativos. (IPD-Complexo Hospitalar Santa Casa, Porto Alegre, RS).
104,213
de melanina na parede do Cryptococcus.
Esse teste tambm utilizado para estabelecer o prog-
nstico de criptococose.100 O teste fornece resultado semi-
quantitativo (titulao da antigenemia) muito importante
para a avaliao do tratamento e prognstico do quadro cl-
nico. Uma titulao elevada est correlacionada com mani-
festaes clnicas e, por sua vez, sua diminuio indica bom
prognstico. J foram registrados raros casos de falso-nega-
tivos ou falso-positivos.118
Kits de aglutinao do ltex so comercialmente dispon-
veis (Murex, Meridian, Wampole, e Immunomycologics). As
vantagens desse teste incluem: facilidade para realizao; poder
ser executado a partir de soro e lquido cefalorraquidiano; e no
requerer equipamentos especiais. No entanto, existem algumas
FIGURA 2.28. Criptococose. Presena de blastocondios (isolados ou em brotamento)
limitaes, tais como a leitura subjetiva da aglutinao e neces-
com cpsula em escassa reao inflamatria (Azul de Toluidina, Obj.
sidade de um pr-tratamento da amostra para aumentar a sua
100). (Martine Mialot, Laboratoire IDEXX Maisons Alfort, Frana).
sensibilidade. A sensibilidade do teste pode ser de at 99%.141

Um imunoensaio enzimtico tambm pode ser utilizado Macro e micromorfologia

para deteco de antgeno polissacardico do Cryptococcus e A colnia tem aspecto rugoso, elevada, membranosa a
est comercialmente disponvel (Meridian). As vantagens aveludada, de colorao branca a creme. O gnero caracte-
desse mtodo diagnstico que o ponto de corte objetivo, rizado pelo desenvolvimento de hifas hialinas, septadas, que
no requer tratamento prvio dos espcimens clnicos e, se fragmentam produzindo artrocondios retangulares ou
analiticamente, o ensaio mais sensvel do que o do ltex. As ovalados, alm de blastocondios.
limitaes desse ensaio so a necessidade de instrumentos
141
especiais para leitura e interpretao, alm do alto custo. HISTOPATOLOGIA
Presena de abscessos e infartos nodulares com invaso
DETECO DE RNA/DNA vascular de estruturas fngicas (clulas leveduriformes pleo-
Recentemente, alguns mtodos de identificao a partir mrficas e hifas septadas, alm de raros artrocondios), trom-
de amostras clnicas vm sendo desenvolvidos e avaliados bose e infiltrado inflamatrio composto por neutrfilos e ma-
por multicentros de estudos que comparam tcnicas padro- crfagos. Todos os elementos fngicos coram-se positivamente
87,172
nizadas. A deteco de sequncias gnicas especficas para quando se empregam as tcnicas de PAS e GMS.
Cryptococcus neoformans, em espcimens clnicos, pode ser
realizada atravs de tcnicas moleculares como PCR, hibri- 8. GEOTRICOSE
dao ou metodologias combinadas. Essas tcnicas so bas-
O gnero Geotrichum, fungo filamentoso, inclui vrias es-
tante especficas, no entanto no tm adequada sensibilida-
73,132 pcies como G. candidum (mais comum), G. clavatum e G. fici.
de, rapidez e baixo custo.
A fonte de contaminao pode ser originria do meio ex-
terior ou do prprio animal, pois o fungo j foi isolado de fezes
7. TRICOSPORONOSE de humanos ou animais hgidos (endossaprobiose), e o cont-
45
, essencialmente, uma levedurose oportunista causada gio pode ocorrer por via oral, respiratria ou traumtica.
por espcies do gnero Trichosporon e que pode acometer
diversos rgos, alm de provocar formas cutneas localiza- CULTIVO
das. As espcies desse gnero so comensais do trato gas- fundamental para o estabelecimento do diagnstico o
trintestinal e respiratrio de mamferos e pssaros, e esto cultivo que pode ser feito em gar SC. A temperatura tima
45
amplamente distribudas no meio ambiente. de crescimento 25C e muitos isolados tm crescimento li-
Por muitos anos, por falta de testes discriminatrios re- mitado ou, mesmo, no se desenvolvem a 37C.
115
produzveis, todas espcies patognicas eram classificadas

como T. beigelii (atual T. cutaneum). As espcies consideradas Macro e micromorfologia
potencialmente patognicas so T. asahii (Figura 2.30), T. As espcies desenvolvem-se rapidamente como colnias
inkin, T. mucoides, T. ovoides e, particularmente, aquelas asso- brancas que variam de pulverulentas a algodonosas. Em
ciadas s infeces cutneas, T. cutaneum e T. asteroides.
64,115,143
condies adversas, as colnias adquirem um aspecto leve-
duriforme.
O aspecto micromorfolgico caracterstico apresenta ar-
trocondios unicelulares resultantes da fragmentao conse-
cutiva de hifas (Figura 2.31), com formato retangular e arre-
143,147
dondado nos cantos.
FIGURA 2.30. Trichosporon ashii. Lado esquerdo: anverso da colnia; lado direito:
micromorfologia (Lactofenol azul de algodo, 850x). (David Ellis,
CULTIVO
Pode ser realizado em gar (Sabouraud Cloranfenicol) in-
cubado sob temperatura de 25C a 30C. Posteriormente se
FIGURA 2.31. Micromorfologia de Geotrichum candidum. Presena de hifas e artroco-
pode fazer repiques em gar fub-tween 80 para a obteno de
159 ndios com formato retangular (Lactofenol azul de algodo, Obj. 40).
estruturas fenotpicas que podero auxiliar na identificao.

HISTOPATOLOGIA A citopatologia do exsudato proveniente de leses cut-

H presena de leso granulomatosa composta por ma- neas ou de mucosas de gatos revela, normalmente, numero-
crfagos e clulas gigantes multinucleadas. Nos tecidos in- sas clulas leveduriformes pleomrficas que podem ter for-
fectados possvel observar hifas hialinas septadas, curtas, mato oval, arredondado ou em forma de charuto, com
com 3-7 m de dimetro e artrocondios retangulares a dimetro de 5 a 7 m (Figura 2.32). Podem estar localizadas
ovais que frequentemente formam cadeias.41,172 no interior de macrfagos ou estarem livres, sendo envolvi-
das por um halo transparente por vezes semelhantes aos
66
9. ESPOROTRICOSE blastocondios de Histoplasma ou Cryptococcus. Em ces
189 190
e no homem , normalmente o exame citofungoscpico
A esporotricose micose subcutnea causada pelo fungo
revela raras estruturas fngicas.
dimrfico, Sporothrix schenckii, afora outras espcies ora
conhecidas, como S-albicans, S-globosa, S. mexicana e S.
brasiliensis, que acomete o ser humano e uma grande varie-
dade de animais como ces, gatos, cavalos, bovinos, came-
los, golfinhos, cabras, mulas, sunos, ratos, chimpanzs e
aves. Solo rico em matria orgnica, vegetao em decompo-
sio e ambientes quentes e midos constituem o habitat do
S. schenckii na forma saprbica.106,128,172,177
Suabes estreis so utilizados para a obteno de secre-
o de leses cutneas, cavidades nasal e oral, conjuntiva ou
outra mucosa.192 No caso de abscessos fechados, a obteno
do material purulento feita por puno com seringa esteri-
lizada. Quando ocorrer drenagem espontnea, o material
purulento deve ser colhido, aps limpeza prvia da rea le-
sional, preferencialmente com esptula, ala ou ento suabe,
e transferido para um recipiente estril.177
Para a coleta de fragmentos de leses cutneas ou de mu-
cosas, visando realizao de cultura fngica ou exame his-
topatolgico, devemos utilizar sacabocados (punchs)66 ou FIGURA 2.32. Diagnstico citolgico de Sporothrix schenckii. Esfregao de secreo
bisturis estreis. Lminas de vidro, limpas e secas, so utili- cutnea. Observao de abundantes blastocondios (seta) arredonda-
zadas na coleta de decalques (imprints) para realizao de dos, ovalados ou em formas de charuto, com halo claro em caso de
exame citopatolgico. Para coleta de sangue para cultura, esporotricose felina (Pantico, Obj. 100). (Setor de Patologia Veteri-
sempre utilizar seringas descartveis.194 nria-UFRGS, RS).
importante ressaltar que Sporothrix Spp micro-orga-
nismo classificado como classe de risco 2, isto , representa Nos casos de esporotricose disseminada, em animais
risco individual moderado e limitado para comunidade.171 com doenas imunossupressoras ou que sofrem tratamento
Estudos relatam o isolamento de S. schenckii de unhas e ca- com frmacos que interferem na resposta imune, o nmero
vidade bucal de gatos, acometidos com esporotricose, desta- de blastocondios tende a aumentar, podendo apresentar,
cando o perigo de inoculaes do agente atravs de arranha- alm da forma de charuto, formas pleomrficas e, ainda,
dura e/ou mordedura.195 presena de brotamentos.
EXAME DIRETO CULTIVO

Os mtodos de colorao para visibilizao de estruturas O diagnstico definitivo da esporotricose obtido a par-
leveduriformes, quando se suspeita de um caso de esporotri- tir do isolamento do fungo. Como se trata de um fungo di-
cose, so os do tipo Romanowsky (pan-ptico), Gram e mrfico (Figura 2.33), fundamental que se demonstre a
Giemsa.159 Pode-se, tambm, utilizar a colorao pelo cido 177
converso para a forma leveduriforme. Sporothrix schen-
peridico de Schiff (PAS) e Gomori-Grocott com sucesso.66 ckii apresenta a forma filamentosa no meio ambiente e in
um exame de simples execuo, baixo custo, rpido, que vitro em temperatura entre 25 e 27C formando hifas e con-
no exige treinamento tcnico sofisticado ou estrutura labo- dios, e a forma leveduriforme (s blastocondios) in vivo e in
ratorial complexa.205 vitro a 37C.
117
A lmina deve ser observada em microscpio ptico Os meios de cultivo utilizados inicialmente para o isola-
convencional utilizando-se a objetiva de imerso (aumento mento do S. schenckii so os gares SC e SCC. O material
1000x) com a finalidade de se procurar estruturas leveduri- semeado deve ser incubado por at quatro semanas. Para se
formes sugestivas de Sporothrix Spp.177 obter maior produo de propgulos fngicos, os isolados

podem ser repicados em meio gar batata dextrose a 25C. O Hemocultivo

dimorfismo deve demonstrado pela converso a 37C em O cultivo do Sporothrix schenckii obtido a partir de san-
gar infuso de crebro e corao (BHIA).177,210 gue perifrico, em 34,4% de gatos comprovadamente com
esporotricose, demonstra a fungemia e a consequente disse-
193
minao hematgena desse fungo.
A coleta do sangue deve ser feita aps os cuidados de as-
sepsia e antissepsia, sendo o material semeado em frascos
apropriados para hemocultivo (Figura 2.35). Os tubos de-
vem ser incubados temperatura ambiente e em posio in-
vertida e 1 mL do sobrenadante deve ser aspirado no segun-
do e no stimo dia, e partes iguais devem ser inoculadas em
dois frascos que contenham gar BHI incubados a 25C e
observados por seis semanas. Os isolados suspeitos devem
ser subcultivados em gar batata dextrose a 25C para estu-
dos macro e micromorfolgicos e, posteriormente, inocula-
dos em gar BHI a 37C para promover a converso para
193
forma leveduriforme.
FIGURA 2.33. Sporothrix schenckii e as duas fases: lado esquerdo (filamentosa) e
lado direito (leveduriforme). (Laboratory of Microbiology, VMTH-
-UCDavis, EUA).
Macro e micromorfologia
Na forma filamentosa as hifas hialinas so finas, septa-
das e ramificadas, com conidiforos delgados, em cujo pice
se forma uma pequena vescula com dentculos simpodial-
mente dispostos, do qual surgem simpodiocondios hialinos,
conferindo uma forma semelhante margarida ou ao crisn-
temo (Figura 2.34) e ao longo das hifas existem os condios
demceos. Os condios hialinos tm a parede celular fina,
enquanto que os escuros tm a parede espessa. Os blastoco-
ndios da fase leveduriforme so pequenas clulas esfricas,
147,159
ovais ou alongadas, que se assemelham a charutos.
FIGURA 2.35. Frascos com meios para hemocultura de Sporothrix schenckii. (LAP-
CLIN-DERMZOO/IPEC)/IPEC-FIOCRUZ, RJ).
O cultivo do cogulo sanguneo um mtodo alternati-

vo ao hemocultivo para o diagnstico da esporotricose dis-
seminada em gatos. Apresenta concordncia de 84% com o
hemocultivo, porm um mtodo mais prtico e econmi-
co. Realiza-se um macerado do cogulo que semeado nos
194
meios convencionais anteriormente citados.
HISTOPATOLOGIA
O infiltrado granulomatoso evidenciado em quadros de
esporotricose pode apresentar trs diferentes zonas caracte-
rsticas: zona central ou supurativa, constituda por poli-
morfonucleares rodeados de histicitos, linfcitos e escassos
eosinfilos (nesta zona so observados as leveduras e os cor-
pos asteroides); zona mdia ou tuberculoide, com clulas
FIGURA 2.34. Micromorfologia de Sporothrix schenckii. Presena de hifas hialinas
epitelioides, clulas gigantes multinucleadas dos tipos Lan-
finas e condios dispostos em forma de margarida (simpodiocondios)-
ghans e corpo estranho; e, zona sifiloide, formada por clu-
-(Lactofenol azul de algodo, Obj. 40). 72,87,117
las plasmticas, linfcitos e fibroblastos.

O corpo asteroide consiste de rea central, com o micro- Estudos tm sido conduzidos no intuito de desenvolver
-organismo apresentando ou no brotamento, rodeada por tcnicas sorolgicas para utilizao no diagnstico da espo-
material eosinoflico, com aspecto estelar ou radiado, carac- rotricose em humanos. muito importante a determinao
terizado como uma reao antgeno-anticorpo, similar ao da sensibilidade, especificidade e valor preditivo dos testes
fenmeno de Splendore-Hoeppli.104,213 A utilizao de tcni- em desenvolvimento.6
cas especiais, como a impregnao por GMS e a colorao
pelo PAS, permite definir a etiologia fngica, atravs da visi- DETECO DE RNA/DNA
bilizao de estruturas leveduriformes.41,117 Esses mtodos so geralmente restritos a pesquisas. A
A histopatologia das leses de pele, oriundas de gatos, reao em cadeia pela polimerase (PCR) foi utilizada como
com esporotricose revela a presena de um infiltrado infla- mtodo de diagnstico em estudos sobre a esporotricose fe-
matrio amplamente distribudo na derme composto por lina realizados no Japo.96,108 Entretanto, tais mtodos no
clulas mono e polimorfonucleares, predominantemente so aplicados rotineiramente no diagnstico da esporotrico-
macrfagos e neutrfilos. Numerosas clulas leveduriformes se animal.
pleomrficas sugestivas de Sporothrix schenckii so comu-
mente encontradas, podendo ter formato oval, arredondado INTRADERMORREAO
ou em forma de charuto, com dimetro de 5 a 7 m, algu- Testes intradrmicos utilizando esporotriquina como
mas vezes exibindo brotamentos (Figura 2.36).191 Em ces, a antgeno so teis em estudos epidemiolgicos e como m-
anlise histopatolgica das leses de pele normalmente evi- todo auxiliar na deteco de formas atpicas da esporotrico-
dencia reaes granulomatosas caracterizadas por hiperpla- se humana. No rotineiramente utilizada devido ocor-
sia histioctica e infiltrado neutroflico. rncia de resultados falso-positivos e falso-negativos.128 O
resultado negativo esporotriquina permite assegurar-se
que no se trata de esporotricose.
10. FEO-HIFOMICOSES
Os feo-hifomicetos so fungos filamentosos, pigmenta-
dos com melanina (phaeo=escuro), causadores das feo-hifo-
micoses, termo bastante genrico, que abrange um amplo
grupo de infeces fngicas.39,46,67,137 Os agentes etiolgicos,
cujo habitat natural o solo e os vegetais, pertencem classe
Hyphomycetes e famlia Dematiaceae (dematiceos ou de-
mceos) e possuem hifas, condios ou conidiforos negros.
Quando houver a suspeita clnica de feo-hifomicose, indis-
pensvel a realizao de exames laboratoriais. Habitual-
mente se observa a presena de hifas septadas demceas nos
tecidos, as quais podem ser curtas ou longas, tortuosas, intu-
mescidas ou regularmente formadas ou, ainda, podem apre-
FIGURA 2.36. Diagnstico histopatolgico de esporotricose. Presena de blastocon-
sentar uma combinao de todas essas formas, as quais po-
dios arredondados (setas) de Sporothrix schenckii associados a infiltra-
dem estar associadas a outros elementos fngicos tambm
do inflamatrio polimorfonuclear na derme de um gato (PAS contraco-
pigmentados. Os agentes etiolgicos variam quanto ao grau
rado com H&E, Obj. 40). (Setor de Patologia Veterinria-UFRGS, RS).
de pigmentao formada in vivo, portanto, pode ser necess-
ria a utilizao de colorao especial (p. ex., Fontana-Mas-
Estruturas leveduriformes podem ser observadas em son), para demonstrao do pigmento na parede celular.41
cerca de 17 % dos casos.183,189 Em ces, gatos e humanos, As principais formas clnicas podem ser cutneas, sub-
oriundos da epidemia do Rio de Janeiro, no foram encon- cutneas (geralmente localizada, formando cistos, granulo-
trados corpos asteroides.17,189,191 mas ou abscessos) e disseminadas. So classificadas dentre
as feo-hifomicoses, doenas ou formas clnicas conforme a
SOROLOGIA etiologia, mais genricas como feo-hifomicoses cutneas e
Diversas classes (IgG, IgM e IgA) de anticorpos so pro- subcutneas, ou mais especficas, como cromoblastomicose
duzidas durante a infeco por Sporothrix schenckii. Entre- e micetomas eumicticos. importante ressaltar que a mes-
tanto, poucos dados esto disponveis a respeito de aspectos ma espcie de feo-hifomiceto, como, por exemplo, Clado-
imunolgicos, particularmente no que diz respeito respos- phialophora bantiana, pode causar diferentes feo-hifomico-
ta humoral que ocorre na esporotricose.6 ses (subcutnea, cerebral e at micetoma).

FEO-HIFOMICOSES CUTNEAS E SUBCUTNEAS cinza-escura, amarronzada, verde-oliva com bordos claros

EXAME DIRETO (Figura 2.38). Pode, eventualmente, ser coberta com um pe-
Em alguns casos, o exame direto do pus, obtido por aspi- queno miclio areo acinzentado. A textura varia do tipo
rao ou por drenagem cirrgica de um abscesso ou, ainda, acamurada at flocosa. O reverso negro.55
o raspado cutneo da rea lesional, suficiente para eviden-
ciar elementos fngicos filamentosos septados, com morfo-
logia varivel e pigmentao mais ou menos acentuada. Os
materiais clnicos, tais como pus e tecidos, so mesclados
com KOH 10% para o exame direto (Figura 2.37). A nature-
za demcea do fungo a chave para o diagnstico da feo-
-hifomicose, mas muitas vezes a quantidade de pigmento
46,199
detectvel na parede fngica muito pequena.
FIGURA 2.38. Macromorfologia de Alternaria sp. Cor escura com bordos claros.
As hifas so septadas, ramificadas e escuras. Os conidi-

foros so septados e de comprimento variado, algumas vezes,
ramificados, com condios em sua extremidade. Os condios,
de paredes lisas ou verrucosas, isolados ou em cadeias, so
grandes, marrons, com septaes transversais e longitudi-
nais, muriformes, ovalados a alongados (Figura 2.39), nor-
FIGURA 2.37. Feohifomicose. Exame histopatolgico de biopsia de pele evidencian-
malmente mais arredondados na regio prxima ao conidi-
do a presena de hifas septadas demceas (Grocott, Obj. 40). No
foro e mais estreito e afilado na poro distal.35,64,120
cultivo foi isolado o fungo demceo Alternaria. (Laboratory of Micro-
biology, VMTH-UCDavis, EUA).
CULTIVO
Inocular os espcimens clnicos, tais como aspirados pe-
ritoneais, secrees respiratrias, fragmentos de bipsias de
tecidos infectados nos gares SC e SCC. Todavia, muitos feo-
-hifomicetos so sensveis ciclo-heximida, o que pode gerar
falsa negatividade. A maioria dos feo-hifomicetos cresce me-
lhor a 30C, e somente depois de quatro semanas que se
deve considerar o cultivo como negativo. Quando for neces-
srio, deve-se proceder subculturas ou microcultivos em
113,115,159
gar fub ou gar batata para a estimular a conidiao.
116 134
Drechslera spicifer, Exophiala jeanselmei, Exophiala
46,114
spinifera, Phialophora verrucosa,59 Scolecobasidium hu-
208 46 67
micola, Alternaria alternata , Curvularia sp. so espcies
de feo-hifomicetos j descritas, entre outras, como causado- FIGURA 2.39. Micromorfologia de Alternaria sp. Condios demceos ovalados a alon-
ras de enfermidades cutneas ou subcutneas em ces e gatos. gados com septaes transversais e longitudinais (Lactofenol de
Macro e micromorfologia Amann, Obj. 40).
Alternaria sp
Desenvolve-se rapidamente e atinge a maturidade em A maioria das 44 espcies do gnero fitopatgena, mas
cinco dias, na temperatura ideal entre 25C e 28C. A cor Alternaria alternata, A. infectoria e A. tenuissima j foram
inicial branco-acinzentada, mas gradualmente se torna isoladas de casos de dermatoses em ces e gatos.180

Bipolaris sp poros na parede dos conidiforos, so grandes (at 35 mm),

Crescimento moderamente rpido. A superfcie da col- escuros, lisos a rugosos, geralmente cilndricos ou ligeira-
35,64
nia plana e espraiada. A cor varia de cinza a marrom-escu- mente curvos, com septos transversais (Figura 2.40).
ra. A textura varia do tipo acamurada, aveludada e at flo- O gnero contm 35 espcies e a maioria fitopatgena,
cosa. O reverso tem colorao negra.115 sendo C. geniculata, C. pallescens e C. lunata as espcies
As hifas so septadas, ramificadas e marrons. Os conidifo- mais isoladas de seres humanos e animais.
ros so bem desenvolvidos, escuros, septados, frequentemente
simples, mas algumas vezes ramificados. Os condios so ciln-
dricos, com pigmentao marrom-clara, grandes e, horizontal-
mente, pseudosseptados e produzidos isoladamente atravs de
poros (porocondios) na parede do conidiforo.35,55,120
Os gneros Drechslera, Bipolaris, Curvularia e Exserohi-
lum so muito semelhantes, e a diferenciao micromorfol-
gica baseada na combinao da forma do condio, da presen-
a ou no de hilo protuberante, da germinao bipolar ou no,
da sequncia e posio dos trs primeiros septos conidiais.64
O gnero contm 45 espcies, cuja maioria fitopatge-
na, entretanto B. australiensis, B. hawaiiensis e B. spicifera
tm sido consideradas como potencialmente patognicas.64
Cladosporium sp
Crescimento relativamente lento, em temperatura no FIGURA 2.40. Micromorfologia de Curvularia sp. Condios demceos cilndricos ou ligeira-
mente curvos, com septos transversais (Lactofenol de Amann, Obj. 40).
superior a 34C. A superfcie apresenta uma colorao cinza,
cinza-esverdeada, marrom-esverdeada, verde-oliva escura ou
negra. A topografia plana ou elevada, com dobras radiais. A Drechslera sp
textura acamurada, aveludada e at flocosa, mas pode tam- O crescimento rpido e a colnia pode atingir a matu-
bm se tornar pulverulenta devido abundante conidiao.55,64 ridade em apenas cinco dias. A colnia, inicialmente, mar-
As hifas so septadas, ramificadas e escuras. Os conidi- rom-acinzentada ou marrom-escura e, posteriormente,
foros, tambm escuros, so irregularmente ramificados e os apresenta um centro escuro com uma periferia acinzentada.
condios apresentam pigmentao marrom-escura e so A textura do tipo acamurada, aveludada ou at penugen-
64
ovais, cilndricos ou em forma de escudo, usualmente lisos ta. O reverso tem pigmentao negra.
a rugosos, com cicatrizes nos pontos de ligao com o coni- As hifas so escuras e septadas. Os conidiforos so
diforo ou com outros condios.35,159 marrons, septados ou, raramente, ramificados, encurvados,
O gnero Cladosporium um dos fungos mais comuns e produzindo condios atravs de pequenos poros nos cantos,
onipresente em todos os continentes, com dezenas de esp- conferindo-lhes aparncia de zigue-zague. Os condios so
cies j descritas. As mais patognicas para humanos e ani- plidos a escuros, de paredes espessas, cilndricos a subci-
55,64
lndricos e septados transversalmente (Figura 2.41).
mais foram transferidas para o gnero Cladophialophora: C.
bantiana (ex-Xylohypha bantiana e ex-Cladosporium tri-
choides) que pode crescer em at 43C, agente de feo-hifo-
micose cerebral, e C. carrionii (ex-Cladosporium carrionii)
que cresce bem sob temperatura entre 35C e 36C, pode
causar cromoblastomicose.64
As principais espcies do gnero Cladosporium so C. cla-
dosporioides, C. elatum, C. oxysporum e C. sphaerospermum.
Curvularia sp
O crescimento rpido e a colnia pode atingir a maturida-
de em apenas cinco dias, na temperatura ideal situada entre 25
e 28C. A cor do anverso da colnia cinza a marrom, verde-
-oliva escura ou negra. A textura varia do tipo acamurada,
flocosa ou at algodonosa. O reverso tem colorao negra.55
FIGURA 2.41. Micromorfologia de Dreschlera sp. Condios plidos a demceos com
As hifas so septadas, ramificadas e demceas. Os co-
paredes espessas, cilndricos a sub-cilndricos e septados transversal-
nidiforos so marrons, eretos, simples, mas algumas ve-
mente (850x). (David Ellis, Mycology Unit, Womens and Childrens
zes so ramificados e curvados nos pontos de formao dos
Hospital, Adelaide, Austrlia).
condios. Os porocondios, que se desenvolvem atravs de

Um grande nmero de isolados de quadros clnicos que fo-

ram classificados como Drechslera ou Helminthosporium, na
verdade pertencem aos gneros Bipolaris ou Exserohilum137,
como exemplo Bipolaris spicifera (ex-Drechslera spicifera).
Um exemplo do gnero a Drechslera septata.
Exserohilum sp
Colnias de crescimento rpido. Colorao cinza a mar-
rom-escura. Textura do tipo acamurada at flocosa. Rever-
so apresenta uma cor verde-oliva escura.
As hifas so septadas e escuras. Os conidiforos so
marrons, septados ou, raramente, ramificados, encurvados,
produzindo condios atravs de pequenos poros nos cantos,
conferindo a eles uma aparncia de zigue-zague (simpo- FIGURA 2.43 Micromorfologia de Exophiala jeanselmei/spinifera. Condios dem-
dial) (Figura 2.42). Os condios, que tm formato elipsoidal
ceos com formato redondo, subgloboso, ovide ou elipsoidal (central
at fusiforme, possuem um hilo protuberante e truncado. O
Lactofenol azul de algodo, 930x; quadros esquerdo-1800x e direi-
hilo definido como uma cicatriz no condio no ponto de
to-1400x). (David Ellis, Mycology Unit, Womens and Childrens Hos-
ligao ao conidiforo. O septo acima do hilo usualmente
pital, Adelaide, Austrlia).
espesso e escuro.35,64
Dentre as mais de 20 espcies de Exserohilum, algumas j
foram descritas como agentes de feo-hifomicoses, notadamen- A espcie Exophiala dermatitidis (Wangiella dermatiti-
te E. rostratum (E. halodes), E. mcginnisii e E. longirostratum.137 dis) reconhecida como agente de micetomas e feo-hifomi-
coses, e pode ser cultivada sob temperatura de at 42C.
Recentemente, estudos moleculares redefiniram Exo-
phiala jeanselmei e trs espcies adicionais: E. oligosperma,
E. nishimurae e E. xenobiotica, que podem ser cultivadas a
37C, mas no a 40C. E. jeanselmei considerada como
agente de micetomas e feo-hifomicoses.39,46,64
Outra espcie importante foi recentemente redefinida em
duas espcies morfologicamente muito similares, as quais s
podem ser distinguidas atravs de anlise gentica: Exophiala
spinifera e E. attenuata. E. spinifera considerada como agente
de micetomas e feo-hifomicoses. Tambm no crescem a 40C.
HISTOPATOLOGIA
O exame histopatolgico determinante para o correto
diagnstico da feo-hifomicose. Em alguns casos, coloraes
FIGURA 2.42. Micromorfologia de Exserohilum sp. Condios demceos com formato de rotina como HE, so suficientes para confirmar a suspei-
elipsoidal a fusiforme, possuem um hilo saliente e truncado. O septo ta. recomendvel o emprego de coloraes histolgicas
acima do hilo usualmente espesso e escurecido (Lactofenol azul de que evidenciam a melanina, como GMS ou PAS (Figura
algodo, 900x). (David Ellis, Mycology Unit, Womens and Childrens 2.44). Entretanto, em muitos casos, devido fraca impreg-
Hospital, Adelaide, Austrlia). nao in vivo do pigmento na parede celular de alguns isola-
dos, o mesmo s pode ser demonstrado por algumas colora-
Exophiala sp es especiais como Fontana-Masson. A presena de
As espcies desse gnero tm recebido especial ateno piogranuloma est associada a um infiltrado inflamatrio
no que concerne a taxonomia pois um grupo bastante he- composto por macrfagos epitelioides, clulas gigantes mul-
64
terogneo. Normalmente apresentam um crescimento len- tinucleadas, linfcitos e neutrfilos. Hifas pigmentadas e
to, aspecto leveduriforme e cor que varia de verde-cinza at septadas, as quais podem estar associadas a outros elemen-
negra e, posteriormente, desenvolvem tufos de miclio areo tos fngicos tambm pigmentados, so caractersticas desse
que ficam elevados no centro. A textura frequentemente va- tipo de leso e, geralmente, esto presentes no interior de
ria de acamurada at aveludada. Dependendo da espcie, os macrfagos. Como normalmente as estruturas de reprodu-
condios apresentam um formato redondo, subgloboso, o, que so a base da identificao, no esto presentes,
ovoide ou elipsoidal (Figura 2.43). O reverso tem cor verde- necessrio o isolamento do feo-hifomiceto para especifica-
55,64,199
-oliva escura. o da etiologia.41,72,81,172,213

Deve-se incubar a 30C e considerar as culturas como nega-

tivas somente depois de seis semanas. Os agentes da cromo-
micose no so sensveis ciclo-heximida. Em contraste
com as espcies saprbicas do solo, a maioria dos agentes
isolados da cromomicose e desenvolve-se lentamente. A
identificao das espcies bastante laboriosa e dificultada
pela grande variedade morfolgica. O diagnstico depende
do tipo de condio, porcentual de diferentes condios e modo
de formao (ontogenia) dos condios.115,118,159
Macroscopicamente apresentam morfologia colonial se-
melhantes e a diferenciao feita pelo estudo microscpico
FIGURA 2.44. Feohifomicose. Hifas septadas demceas e estrututuras vesiculosas
da conidiognese dos agentes.35
com reao granulomatosa (PAS, Obj. 40). (Martine Mialot, Labora-
1) Tipo Phialophora: apresenta uma filide terminal-
toire IDEXX Maisons Alfort, Frana).
mente ou ao longo da hifa. A estrutura geralmente
em forma de vaso e tem uma base alongada, arredon-
11. CROMOBLASTOMICOSE dada ou oval, um colo estreito, e uma abertura que
A cromoblastomicose (cromomicose) uma doena loca- poder ter um colarinho ou um bordo alongado.
lizada crnica da pele e tecido subcutneo causada por im- 2) Tipo Rhinocladiella: os conidiforos so simples e al-
plantao traumtica do agente, sendo raramente descrita em gumas vezes no so diferenciados da hifa vegetati-
medicina veterinria. As leses so verrucosas, ulceradas e va. Condios ovais so produzidos ao longo e na late-
crostosas, podendo ainda ser planas ou elevadas. Leses sat- ral desses conidiforos.
lites podem se desenvolver depois de autoinoculaes e por 3) Tipo Cladosporium: o conidiforo normalmente se
disseminao linftica s reas adjacentes. A micose usual- alarga na parte distal. Dois ou mais condios so for-
mente se mantm localizada, com extensa formao de que- mados no topo deste conidiforo. A conidiognese
loides. As leses muito crnicas apresentam um aspecto pa- produz longas cadeias. Os condios destacam-se dei-
tognomnico chamado tipo couve-flor.118,172,205,215 xando uma cicatriz e os que apresentam trs cicatri-
Os fungos mais implicados so: Cladophialophora carrio- zes, pela sua forma, so chamados de clulas-escudo.
nii (Cladosporium carrionii), Fonsecaea pedrosoi, Fonsecaea A conidiognese serve para distinguir os gneros Fonse-
compacta, Phialophora verrucosa e Rhinocladiella aquaspersa. caea (pode ter os trs tipos de conidiognese, mas maioria
do tipo Cladosporium), Phialophora (tipo Phialophora), Rhi-
EXAME DIRETO nocladiella (tipo Rhinocladiella) e Cladosporium (exclusiva-
O material deve ser obtido a partir das escamas e cros- mente tipo Cladosporium).35,55,,118,199
tas (dos pontos enegrecidos da leso) com auxlio de bistu-
ri e agulhas estreis, pus e tecidos obtidos por curetagem, Cladophialophora carrionii
alm de biopsias da epiderme e tecido subcutneo tambm Essa espcie (ex-Cladosporium carrionii) tem crescimen-
podem ser obtidas. As crostas, montadas em KOH10% ou to lento, atingindo a maturidade em 21 dias, e cresce somen-
20%, contm elementos muriformes (elementos com septa- te em temperaturas de at 37C. A colnia compacta, al-
o em dois planos), chamados de corpos esclerticos ou canando 3 a 4 cm em quatro semanas. A textura pode ser
clulas fumagoides, que so estruturas demceas de pare- do tipo acamurada, aveludada ou penugenta, com superfce
de grossa, de 5 a 13 m de dimetro, tpicas da cromoblas- plana e suavemente elevada no centro, coberta por miclio
tomicose. Raspados superficiais contm, tambm, hifas areo olivceo-escuro a negro. O reverso escuro.
demceas ramificadas e septadas de 2 a 5 m de dimetro. Normalmente se observa apenas a conidiao do tipo
Todos os agentes tm a mesma morfologia nos tecidos. O Cladosporium. Longas cadeias flexuosas e ramificadas de
corpo muriforme no levedura e no se reproduz por condios so produzidas em conidiforos bem definidos ou
brotamento.159,205,215 na extremidade da hifa vegetativa. Os condios so escuros,
ovais ou com forma de limo (Figura 2.45). Alguns condios,
CULTIVO tanto em posio intercalar quanto terminal, transformam-
Deve-se inocular os espcimens clnicos em agares SC e -se em filides, pela dissoluo da parede em sua parte supe-
SCC (ou BHI-CC) pois, normalmente, os mesmos esto den- rior, formando um colarinho. Os condios passam, ento, a
35,55,64
samente contaminados com fungos saprotrficos e bactrias. ser produzidos dentro das filides.

Phialophora verrucosa
O crescimento lento e a colnia atinge a maturidade
em 14 dias. A textura varia de acamurada at aveludada e a
cor da superfcie varia de verde-oliva escura at negra, ini-
cialmente convexa, tornando-se achatada, com o tempo. Al-
gumas amostras so lisas a radialmente dobradas. Um mic-
lio areo cinza, eventualmente, cobre a colnia, que
35,64
compacta e endurecida.
As hifas so marrons, septadas e ramificadas. Os fialo-
condios so produzidos por clulas conidiognicas em for-
ma de vaso (filides) e liberados atravs de um colarinho que
tem a forma de taa. As filides so formadas lateralmente
ou na extremidade da hifa vegetativa. A conidiao ocorre
na base do colarinho. Os fialocondios so elpticos, peque-
FIGURA 2.45. Micromorfologia de Cladophialophora carrionii. Longas cadeias flexuo-
nos, de paredes finas, produzidos em sucesso, mas no em
sas e ramificadas Condios demceos, ovais ou com forma de limo
cadeia (Figura 2.47). Eles so envolvidos por uma espcie de
so produzidos em conidiforos bem definidos ou na extremidade da
substncia aderente e acumulam-se em torno do colari-
hifa vegetativa (Lactofenol azul de algodo, 800x; quadro-macro- 35,55,64,159
nho.
morfologia). (David Ellis, Mycology Unit, Womens and Childrens
Essa espcie reconhecida como agente de cromoblasto-
Hospital, Adelaide, Austrlia).
micose e de micetoma.
Essa espcie reconhecida como agente de cromoblasto-

micose e, eventualmente, de infeces oportunsticas.
Fonsecaea pedrosoi
O crescimento lento e a colnia atinge a maturidade
em 14 dias. A colnia produz uma colorao negra, amar-
ronzada, acinzentada ou verde-oliva. A textura aveludada
ou penugenta e a superfcie varia de plana at elevada, po-
dendo apresentar sulcos radiados e um centro elevado cni-
co ou convexo. O reverso negro.
As hifas so marrons, septadas e ramificadas. Os condios
so tambm escuros e de formato variado (Figura 2.46). Os
trs tipos de conidiao existem nessa espcie. Todavia, a pro-
poro deles vai depender do isolado e do meio de cultivo.35,55,64
FIGURA 2.47. Micromorfologia de Phialophora verrucosa. Fialocondios demceos

elpticos, so liberados atravs de um colarete com forma de taa,
onde ficam envolvidos por uma espcie de substncia aderente (Lac-
tofenol azul de algodo, 900x).
Rhinocladiella aquaspersa
Crescimento moderado a rpido. A colnia compacta e
a cor da superfcie varia de cinza a olivcea-escura. A textu-
ra aveludada a penugenta. O reverso olivceo-escuro a
negro.
As hifas so demceas, septadas e ramificadas. Os conidi-
foros tm paredes espessas e so usualmente ramificados,
sub-hialinos, plidos a marrons escuros, eretos e com coni-
diao somente em sua poro superior. Os condios so
FIGURA 2.46. Micromorfologia de Fonsecaea pedrosoi/monophora complexo. Con-
elpticos a claviformes, hialinos a sub-hialinos unicelulares
dios demceos com formato variado, mas com predominncia do tipo 64
e de parede lisa.
Cladosporium. As hifas so marrons, septadas e ramificadas (Lactofe-
No gnero Rhinocladiella as espcies (seis a oito) mais
nol azul de algodo, 800x).
importantes so R. aquaspersa e R. atrovirens.

HISTOPATOLOGIA EXAME DIRETO

Presena de reao piogranulomatosa. As leses de pele Pus, exsudato ou tecidos devem ser examinados macros-
mostram uma hiperplasia pseudoepiteliomatosa hiperque- copicamente para a observao da presena de gros (ou
rattica e microabscessos na epiderme. Hifas demceas e grnulos). Os gros so montados em salina estril, compri-
corpos esclerticos (clulas muriformes) so encontradas midos entre lmina e lamnula e visualizados ao microsc-
nas reas de inflamao na derme e no estrato crneo. Os pio ptico convencional. Os gros so formados por hifas e
corpos esclerticos so redondos, de parede espessa, colora- clulas intercaladamente dilatadas.
o acastanhada e podem ser asseptados, unisseptados e Exemplos de colorao dos gros: brancos (Acremonium
septados em dois planos com 5 a 11 m dimetro (Figura falciforme, Acremonium recifei, Aspergillus nidulans) e pre-
2.48). Os abscessos cerebrais, quando ocorrem, so bem de- tos (Exophiala jeanselmei, Madurela grisea (Figura 2.49),
Madurela mycetomatis, Pyrenochaeta romeroi), Pseudoalles-
marcados, e hifas demceas irregulares podem ser observa-
41,172,174 cheria boydii, Curvularia geniculata, Curvularia lunata 63 ,
das.
Helminthosporium speciferum, com um exemplo de exame
direto de cada tipo de gro.118,215
FIGURA 2.48. Diagnstico histopatolgico de cromoblastomicose. Corpos esclerti-

cos (setas) nas reas de inflamao granulomatosa em ndulo subcu-
tneo de gato (PAS, Obj. 100). (Laboratory of Microbiology, VMTH-
-UCDavis, EUA).
FIGURA 2.49. Gros pretos de Madurella grisea. Formao de microcolonias nos te-
cidos (180x). (David Ellis, Mycology Unit, Womens and Childrens
12. MICETOMAS EUMICTICOS Hospital, Adelaide, Austrlia).
O micetoma um quadro clnico caracterizado por tu-
mefao, fistulizao e formao de gros (agregados de J os actinomicetomas, que so produzidos por bactrias
colnias) e pode ser causado por fungo (micetoma eumic- filamentosas, tm gros compostos por filamentos de 0,5 a
tico) ou por bactria filamentosa (micetoma actinomictico 1,0mm de dimetro e elementos bacilares e cocoides. Se o
ou actinomicetoma; termos consagrados, porm inadequa- exame direto mostrar evidncias de actinomicetoma, o meio
dos). Os micetomas desenvolvem-se a partir de infeces de cultura no pode conter antimicrobianos.199
localizadas que envolvem o tecido cutneo e subcutneo,
fscias e ossos.90,205,215 As leses consistem de abscessos, gra- Macro e micromorfologia
nulomas e fstulas (tratos sinuosos drenantes). Aps a im- Acremonium sp
plantao do agente etiolgico, cujo habitat natural o solo Os gros so brancos a amarelo claro, macios e de tama-
nho varivel, em torno de 1,5 mm. Eles so compostos de
e vegetais, por traumatismos, a leso torna-se localmente
densa massa de hifas hialinas septadas com vesculas ou hi-
invasiva e surge como um inchao subcutneo, indolor e
fas dilatadas. Os gros, em alguns casos, podem ser seme-
pequeno que se torna flegmonoso. A ruptura da leso resul-
lhantes aos gros de Fusarium sp. ou de Pseudoallescheria
ta em fstula, inchao e deformao da parte do corpo afeta-
boydii. Os gros de P. boydii, contudo, tendem a conter nu-
da.118 Os gros presentes no pus podem ser visveis vista merosas vesculas.41,55,64
desarmada. Quando difcil a obteno da amostra, reco-
menda-se colocar gaze por sobre a superfcie lesada por 18 a Exophiala jeanselmei
24 horas o que permitir recuperar os gros para o estudo Os gros so negros ou marrons escuros, de consistncia
micolgico completo.115 macia e tamanho em torno de 1 mm. As hifas da parte externa

dos gros so marrons e tm paredes espessas e clulas dila- Madurella grisea

tadas. A parte interna do gro composta por hifas menores Crescimento lento, atingindo, em trs semanas, 3 a 5
e degeneradas, fragmentos hiflicos, alm de leuccitos e cm de dimetro, na temperatura de 30C. Pode ser diferen-
clulas gigantes.41 ciada de M. mycetomatis pela inabilidade de crescer a 37C e
de assimilar lactose. A colnia elevada, com dobras radiais
CULTIVO no centro. A cor varia de marrom-clara a acinzentada. Cul-
Os gros, de modo geral, devem ser lavados muitas vezes turas velhas podem se tornar marrons-avermelhadas. A tex-
em salina e em solues antimicrobianas, esmagados com tura do tipo acamurada. O reverso marrom-escu-
basto de vidro estril e, ento, para se obter colnias isola- ro.55,64,113
das, devem ser semeados por esgotamento em gar SC e As hifas so demceas, septadas, ramificadas e de di-
incubados a 30C e, ocasionalmente, a 37C. As placas de- metro varivel. Nenhum condio tem sido reportado.
vem ser mantidas incubadas por no mnimo 4 semanas (em
algumas oportunidades por at 3 meses).199 Madurella mycetomatis
Crescimento moderado a lento, atingindo a maturida-
Acremonium sp de em 10 dias. Crescem lentamente a 30C e moderadamen-
Crescimento usualmente lento e as colnias so inicial- te a 37C. O aspecto macroscpico muito varivel. As col-
mente planas, compactas ou com dobras. A textura inicial nias inicialmente so planas e, posteriormente, com o enve-
vai desde aparncia acamurada, pulverulenta, flocosa e, lhecimento, tornam-se elevadas, com dobras de colorao
pelo abundante crescimento de hifas, adquirem at aspecto branca a amarela, verde-oliva ou marrom e cobertas com
algodonoso. A colorao muito varivel, podendo ser um miclio acinzentado. A textura acamurada, membra-
branca, cinza, rosa ou laranja. O reverso hialino, amarela- nosa ou pulverulenta. Em primocultivo a produo de pig-
do ou rosado.35,64,113 mento difusvel marrom no entorno da colnia caracters-
As hifas so hialinas, septadas e ramificadas. Clulas co- tico desta espcie. O reverso marrom-escuro.
35,55,64
nidiognicas afiladas e cnicas, eretas e no ramificadas As hifas so demceas, septadas e, apesar de a maioria
formam-se diretamente sobre as delicadas hifas vegetativas. dos isolados ser estril, j foram observados condios globo-
Os condios hialinos ou levemente pigmentados so unice- sos a piriformes com bases truncadas (Figura 2.51).
lulares (raramente bicelulares), globosos, ovoides, cilndri-
cos ou levemente curvos, e dispostos em aglomerados globo-
sos, ou, raramente, em frgeis cadeias na extremidade das
filides (Figura 2.50).35,55
FIGURA 2.51. Macromorfologia (quadro-pigmento marron difuso) e micromorfolo-

gia (filides e fialocondios globosos a piriformes com bases trunca-
das) de Madurella mycetomatis (Lactofenol azul de algodo, 900x).
(David Ellis, Mycology Unit, Womens and Childrens Hospital, Adelai-
de, Austrlia).
FIGURA 2.50. Micromorfologia de Acremonium sp. Condios hialinos unicelulares,
levemente curvos ou cilndricos, agregados por aparente substncia viscosa em aglome- HISTOPATOLOGIA
rados globosos na extremidade das filides (Lactofenol azul de algodo, Obj. 40). Presena de lceras e formaes sinuosas abertas envol-
vidas por bordas planas ou elevadas. Tambm podem ser
Dentre quase uma centena de espcies, A. falciforme, A. observados abscessos preenchidos com material piognico e
kiliense, A. recifei, A. strictum, A. alabamensis e A. roseogri- grnulos que frequentemente so cobertos por um exsudato.
seum so reconhecidas como fungos oportunistas causado- A parede do abscesso formada por reao granulomatosa,
res de micetomas, ceratomicoses e onicomicoses.64 inflamao crnica e tecido de granulao.
41,81,172,213

13. HIALO-HIFOMICOSES
Hialo-hifomicose uma denominao genrica de um
grupo de infeces micticas causadas por uma gama muito
variada de fungos filamentosos septados hialinos (hyalo), os
quais normalmente fazem parte da microbiota normal do
meio ambiente (ar, solo e vegetais). Os hialo-hifomicetos
pertencem classe Hyphomycetes e famlia Moniliaceae
(fungos hialinos) que tm os condios e/ou conidiforos hia-
35,101,113,199
linos ou levemente coloridos, mas nunca escuros.
As formas clnicas so muito variadas, desde cutnea,
subcutnea, ocular, nasal, ungueal, pulmonar e at septic-
mica com disseminao para vrios rgos. No existem for-
mas clnicas especficas de hialo-hifomicoses como descritas
anteriormente para as feo-hifomicoses. As micoses engloba-
das pela designao hialo-hifomicoses so extremamente
heterogneas e tm, em comum, apenas a presena de hifas FIGURA 2.52. Micromorfologia de Penicillium sp. Hifas septdas e estruturas fngicas
94,205,215
hialinas e septadas quando parasitam o hospedeiro. hialinas. Presena de condiforos ramificados com metulas, filides e
Alguns gneros podem ser citados como Penicillium, Fu- fialocondios (Lactofenol azul de algodo, Obj. 40).
sarium, Paecilomyces e Scopulariopsis. Outros hialo-hifomi-
cetos j adquiriram suficiente importncia na micologia
mdica e so estudados separadamente, como no caso do Fusarium sp
Crescimento rpido e a colnia, inicialmente, branca,
Aspergillus.
amarela, mas frequentemente desenvolve uma rea central
com tonalidades violeta, rosa, vermelha ou prpura com a
EXAME DIRETO periferia mais clara. Algumas espcies se mantm brancas
Materiais clnicos, tais como pus e tecidos, so prepara- (Figura 2.53) ou amarelo-amarronzadas. A textura flocosa
dos para exame com KOH 10%. A natureza hialina do ele- ou algodonosa, dependendo da quantidade de miclio areo
mento hiflico um aspecto importante para o diagnstico. produzido. O reverso tem cor clara.
35,64
45
A hifa pode apresentar uma forma regular ou varivel. As hifas so hialinas, septadas e ramificadas. Dois tipos
de condios so observados: macrocondios multisseptados,
CULTIVO fusiformes, em forma de canoa ou banana (Figura 2.54), os
Os espcimens suspeitos so inoculados em gares SC e quais so formados sobre clulas conidiognicas (filides)
SCC e incubados a 30C. Muitas espcies fngicas so sens- sustentadas por longos conidiforos, e microcondios uni ou
veis ciclo-heximida. As culturas so descartadas como ne- bicelulares, piriformes, fusiformes a ovoides, retos ou encur-
gativas somente aps quatro semanas. O fungo isolado deve vados, formados isoladamente ou em cachos (semelhante-
55,115
ser compatvel com a doena clnica e com a morfologia no mente ao Acremonium).
tecido (hifas septadas hialinas), para poder ser estabelecido
41,64
o diagnstico de hialo-hifomicose.
Muitas vezes necessrio o emprego da PCR para se
diagnosticar o agente da hialo-hifomicose.
Penicillium sp
Crescimento rpido e a identificao das centenas de
espcies de Penicillium, amplamente difundidas no meio
ambiente, requer a colaborao de micologistas especializa-
dos na identificao desse gnero (Figura 2.52). Essas esp-
cies ubiquitrias so isoladas frequentemente em laboratrio
e, s eventualmente, causam infeces micticas. O P. mar-
118
neffei a espcie mais importante.
As espcies de Penicillium apresentam hifas hialinas,
septadas e ramificadas nos tecidos. Essas estruturas so
FIGURA 2.53. Macromorfologia de Fusarium sp. Cor branca com textura algodonosa.
muito semelhantes quelas do Aspergillus spp.

As hifas so hialinas, septadas e ramificadas. Os conidi-

foros so simples e pequenos, e as clulas conidiognicas
podem ser cilndricas. Os condios (anelocondios) so
grandes e, frequentemente, tm uma forma arredondada ou
de limo. A parede espessa e, nos condios maduros, ru-
gosa e espiculada. Os condios podem ser produzidos em
cadeia sobre os conidiforos ou diretamente sobre a hifa ve-
getativa isoladamente ou em grupos.35,64,113,115
Nesse gnero, apenas a espcie S. brevicaulis tem sido
descrita como agente de hialo-hifomicoses e onicomicoses.
FIGURA 2.54. Micromorfologia de Fusarium sp. Fialocondios hialinos fusiformes

multisseptados com as extremidades encurvadas (Lactofenol azul de
algodo, Obj. 40).
A identificao das espcies frequentemente dificulta-

da pela grande variabilidade entre os isolados (cor das col-
nias e forma e tamanho dos condios) e, tambm, porque
FIGURA 2.55. Isolados de dermatomicoses caninas. Macromorfologia de Scopula-
muitas caractersticas importantes, como macrocondios,
64,113 riopsis brevicaulis (esquerda) e Microsporum canis (direita).
esto ausentes nas subculturas.
Dentre as mais de 20 espcies, F. moniliforme, F. dimerum,
F. solani e F. oxysporum tm sido isoladas, no raramente, de HISTOPATOLOGIA
casos de hialo-hifomicoses, ceratomicoses e onicomicoses.
64 Presena de focos granulomatosos ou piogranulomato-
sos contendo elementos fngicos compostos por parede ce-
Paecilomyces sp lular hialina e no pigmentada. Nas hialo-hifomicoses as
Crescimento tambm rpido e a superfcie plana e a estruturas fngicas so melhor visibilizadas com o emprego
colorao muito variada, desde amarelo-ouro, amarelo- de coloraes especiais, como PAS (Figura 2.56) e GMS.41,81,87
-marrom, verde-ouro, lils ou bege, mas nunca verde ou
verde-azul como nas espcies de Penicillium. A textura
pulverulenta ou, as vezes, acamurada a aveludada. O rever-
55,64
so esbranquiado a amarronzado.
As hifas so hialinas, septadas e muito ramificadas. As
clulas conidiognicas so mais alongadas, afiladas e cni-
cas do que as do Penicillium. Essas clulas so formadas so-
bre conidiforos bem desenvolvidos ou diretamente sobre a
hifa vegetativa. Os condios so elpticos, cilndricos, oblon-
gos ou em forma de limo e ocorrem em cadeias longas no
46,64
ramificadas.
Dentre mais de uma dezena de espcies, Paecilomyces
lilacinus e P. variotii so agentes, emergentes, de hialo-hifo-
70
micoses e de ceratomicoses.
Scopulariopsis sp
Crescimento rpido e a colnia inicialmente branca, FIGURA 2.56. Diagnstico histopatolgico de hialohifomicose. Presena de hifas
creme, cinza, marrom-clara ou marrom-escura. A textura hialinas septadas. Algumas (seta) esto contidas em clulas gigantes
inicialmente membranosa, glabrosa e, posteriormente, tor- em meio a inflamao granulomatosa. O cultivo da amostra obtida de
na-se pulverulenta (Figura 2.55). O reverso amarelo-amar- um co permitiu o isolamento de Paecilomyces sp. (PAS, Obj. 40).
113,199 (Laboratory of Microbiology, VMTH-UCDavis, EUA).
ronzado com centro marcadamente marrom.

14. HISTOPLASMOSE
O gnero Histoplasma agrega trs variedades dimrficas
(fases filamentosa e leveduriforme): Histoplasma capsula-
tum var. capsulatum, Histoplasma capsulatum var. duboisii e
45
Histoplasma capsulatum var. farciminosum.
A histoplasmose clssica uma doena granulomatosa,
de distribuio mundial, e causada pelo Histoplasma capsu-
latum var. capsulatum (Hcc). O crescimento saprbico desse
fungo est relacionado com reas ricas em dejetos de morce-
gos e aves, que contm altos ndices de nitrognio e estimu-
104
lam o seu crescimento.
A histoplasmose africana, causada pelo Histoplasma
capsulatum var. duboisii, uma forma distinta da histoplas-
FIGURA 2.57. Diagnstico citolgico de histoplasmose. Fase leveduriforme de Histo-
mose clssica, e tem maior prevalncia na frica, mas casos
plasma capsulatum var. capsulatum observada na derme de gato (May
fora do continente africano tm sido reportados. Consiste de
Grunmwald-Giemsa, Obj. 100). (Rubens A. Carneiro, EV-UFMG).
leses supurativas e granulomatosas, primariamente dos te-
cidos cutneos, subcutneos e ossos. A histopatologia apre-
senta leveduras grandes dentro de clulas gigantes, diferen- CULTIVO
temente das formas leveduriformes do Hcc que so pequenas O material deve ser processado imediatamente, pois o Hcc
e encontradas no interior de histicitos.
137,205 no sobrevive muito tempo no espcimen clnico. Recomen-
A linfangite epizotica dos equinos causada pelo His- da-se cultivar em caldo de infuso de crebro e corao
toplasma capsulatum var. farciminosum e acomete basica- (BHIB) e, tambm, em meio slidos como os gares BHIA,
mente o sistema linftico de equinos.
45,106 SC+BHI (SABHI), SC e SCC. A adio de antimicrobianos
A nfase ser dada para o diagnstico laboratorial do H. essencial para o isolamento de Hcc de material purulento e a
capsulatum var. capsulatum (Hcc) que ocasionalmente aco- ciclo-heximida presente no gar SCC fundamental para o
mete o tecido cutneo de ces e gatos.
36 cultivo de Hcc de material contaminado por fungos anemfi-
los. Espcimens de bipsia devem ser cortados em pequenos
fragmentos e inoculados sobre o meio. Todas as amostras de-
EXAME DIRETO
vem ser incubadas a 30C e mantidas por at seis semanas (as
necessria muita prtica para se visibilizar os blastoco-
placas ou tubos devem ser embaladas com filme elstico sela-
ndios do Hcc com KOH 10%, PAS ou calcoflor. Para ob-
dor), antes de serem consideradas negativas. Para se estabele-
servao das leveduras de Hcc em KOH 10%, o material
cer diagnstico definitivo, fundamental a obteno da fase
colocado em contato com uma gota do reagente e deixado
leveduriforme, para diferenciar Hcc de outros fungos conta-
clarificar por pelo menos uma hora. A sensibilidade desse
minantes que apresentam micromorfologia filamentosa seme-
exame muito baixa e a visibilizao de leveduras no espci- 45,113,118
lhante, tais como os gneros Chrysosporium e Renispora.
men clnico no define o diagnstico, sendo obrigatria a
realizao do cultivo. Para a colorao pelo PAS o material Macro e micromorfologia
distribudo sobre a lmina, fixado (10 minutos, em lcool Fase Filamentosa
metlico) e corado. Os blastocondios ficam mais evidentes O Hcc desenvolve-se lentamente, atingindo a maturida-
com o emprego mais prolongado do corante. Os organis- de entre 15 a 20 dias e at 12 semanas. As colnias, inicial-
mos, dentro dos macrfagos, so ovoides e pode ocorrer a mente, apresentam uma superfcie cerosa e colorao branca
formao de um halo de material no corado em torno da a bege ou marrom. Com a maturidade, as colnias produ-
parede celular. Os brotamentos so ligados clula-me por zem um miclio areo que adquire aspecto algodonoso ou
uma insero estreita (Figura 2.57). Existe uma predomi- pulverulento. As colnias brancas (ou beges) algodonosas
nncia dos blastocondios dentro dos fagcitos (macrfagos so chamadas de A (albinas) e as marrons pulverulentas,
e moncitos), porm eles podem aparecer externamente pela de B (brown). Ambos os tipos podem ser isolados do mes-
ruptura dessas clulas. Leveduras pertencentes a outros g- mo espcimen clnico.
neros, protozorios (Leishmania, por exemplo), corpos es- As hifas so hialinas, septadas, ramificadas e do origem a
tranhos e artefatos podem ser confundidas com clulas de pequenos e estreitos conidiforos que se projetam em ngulos
36,110,113,115,118,159
Hcc. retos. Dois tipos de condios so produzidos: macrocondios

(8-15 m), esfricos, oblongos ou piriformes e com paredes de extrato de levedura a 1% ao tubo ou placa com gar BHIA,
espessas revestidas externamente por projees digitiformes ajuda a prevenir a desidratao e facilita a converso. A fase
120,147,159,205,215
(macrocondio tuberculado) e microcondios (2-4 m), ovais leveduriforme do Hcc sensvel ciclo-heximida.
e com paredes lisas ou finamente rugosas (Figura 2.58). Am- A converso fase leveduriforme requer no mnimo duas
bos os tipos so, em geral, formados isoladamente, mas po- a trs semanas de incubao e, muitas vezes, necessrio mais
dem, algumas vezes, ser produzidos em pequenas cadeias de de um repique. As colnias so lisas a rugosas, membranosas,
2-3 condios. O grau de conidiao varia grandemente entre mas nunca mucoides. Inicialmente, apresentam cor creme ou
os isolados. Colnias do tipo B so mais delgadas e produ- bege, tornando-se com o tempo, cinza-clara.64,174
zem mais macrocondios e as hifas areas so mais esparsas. As clulas leveduriformes gemulantes so ovais ou de ta-
Contudo, as colnias do tipo A, tendem a ser mais espessas manho irregular, medem entre 2 a 5 m de dimetro e tm
110,113,115,118,120
e a produzir maior nmero de microcondios. uma base de unio estreita (0,2 a 0,3 m) entre a clula-me
e a clula-filha.64
HISTOPATOLOGIA
A diferenciao entre clulas leveduriformes de Hcc e
aquelas de outros fungos dimrficos, alm dos blastocon-
dios de verdadeiras leveduras, tarefa difcil. Assim, cultu-
ras so necessrias para definir a espcie envolvida. Vrios
outros organismos assemelham-se, primeira vista, quando
nos tecidos, s clulas leveduriformes do Hcc, tais como
Leishmania spp. e Toxoplasma gondii no interior de histici-
tos. A forma cstica do Pneumocystis spp. corada pelo GMS
pode, tambm, confundir-se com clulas de Hcc.41,87
Presena de granulomas compostos por clulas epitelio-
ides e clulas gigantes multinucleadas, que podem conter
micro-organismos demonstrveis, com ou sem rea central
caseosa. Com o progresso das leses pode ocorrer a forma-
o de ndulos fibrocalcreos. Estruturas leveduriformes
ovoides, irregulares e com 2 a 4 m de dimetro so mais
facilmente observadas em coloraes especiais, tais como
41,81,104,172,213
PAS, GMS, Bauer e Gridley.
SOROLOGIA
Evidncias sorolgicas so os indicadores primrios de
infeco por micro-organismos. Testes para deteco de an-
ticorpos sricos tm sido amplamente utilizados no auxlio
FIGURA 2.58. Fase filamentosa do Histoplasma capsulatum var. capsulatum. Macro- do diagnstico da histoplasmose. At o presente, a imunodi-
condios esfricos com paredes espessas revestidas por projees digi- fuso dupla de Ouchterlony (ID) e a reao de fixao de
tiformes (macrocondio tuberculado) e microcondios com paredes li- complemento (RFC) tm sido os mtodos de rotina utiliza-
57,110
sas (Lactofenol azul de algodo, 900x; macromorfologia: quadros dos em laboratrios de anlises clnicas. Entretanto, a
direito-anverso e esquerdo-reverso da colnia). (David Ellis, Mycology imunodifuso (ID), tcnica altamente especfica, apresenta
Unit, Womens and Childrens Hospital, Adelaide, Austrlia).) baixa sensibilidade, pois os anticorpos especficos podem
no ser detectveis at quatro a seis semanas aps o apareci-
Fase Leveduriforme mento dos sintomas, fornecendo, assim, resultados falso-
169
Ela pode ser obtida com um fragmento marginal retirado -negativos. A reao de fixao de complemento (RFC),
da cultura filamentosa primria, que deve ser inoculado em embora mais sensvel que a ID, pode apresentar reatividade
meios de converso e incubado a 37C. Os meios utilizados cruzada com soro de pacientes infectados, por exemplo, com
para a converso podem ser os gares de Pine, L-gema, san- Coccidioides immitis e Paracoccidioides brasiliensis.110 A tc-
gue-glicose-cistena (BGCA), BHIA e BHIB em tubos ou pla- nica de Western-blot (WB) pode ser usada como mtodo
cas (menos recomendveis). A adio de uma gota de caldo capaz de detectar anticorpos contra antgenos H e M do

Hcc, nas diferentes formas clnicas da histoplasmose huma- Recentemente, foi reconhecida a existncia de duas esp-
169
na , mas geralmente so falso-negativos nos animais que cies: Coccidioides immitis e C. posadasii (complexo C. immi-
contraram a doena naturalmente. Por outro lado, tambm tis C. Posadasii) que possuem um dimorfismo especial,
podem ocorrer resultados falso-positivos em animais j re- pois apresentam forma filamentosa com hifas que se frag-
cuperados de infeco anterior.
212
mentam formando artrocondios e forma tecidual caracteri-
A deteco de antgenos tem-se mostrado muito til zada por esfrulas repletas de endsporos.64
para o diagnstico e para o monitoramento do tratamento
211
da histoplasmose em humanos. Dentre as tcnicas empre- EXAME DIRETO
gadas, cita-se o radioimunoensaio e o ELISA em amostras Espcimens clnicos como secrees, exsudatos e tecidos
de soro e urina, para deteco dos antgenos polissacardi- so preparados com KOH 10%. Esfrulas com paredes es-
61
cos do fungo. No h relatos na literatura do uso deles no pessas (at 2 m) de 10 a 80 m de dimetro e endsporos de
diagnstico da histoplasmose canina ou felina. O sucesso 2 a 5 m de dimetro so caractersticas de C. immitis/C.
obtido na deteco de antgenos em amostras de soro de ces posadasii. Os endsporos so liberados quando se rompe a
com blastomicose sugere que esses testes tambm podem ser parede da esfrula.174
aplicados no diagnstico da histoplasmose em pequenos
198
animais. CULTIVO
As duas espcies so morfologicamente idnticas e s
DETECO DE DNA/RNA podem ser distinguidas por anlise gentica e diferentes ta-
Tcnicas moleculares j comeam a ser utilizadas no diag- xas de crescimento em presena de altas concentraes de
nstico em medicina veterinria. No Japo, DNA extrado de sais (C. posadasii cresce mais lentamente). A confirmao
tecido, de leso de um co, emblocado em parafina foi subme- laboratorial dessas duas espcies necessria porque outros
tido tcnica de Nested PCR e um fragmento da regio ITS fungos, tais como os gneros Malbranchea e Gymnoascus,
do rDNA de Ajellomyces capsulatus (a forma teleomrfica de so macro e microscopicamente muito semelhantes, embora
H. capsulatum) foi amplificada, confirmando a identidade normalmente apatognicos.64
das leveduras observadas nos cortes histolgicos.
207 Deve-se inocular o material clnico nos gares SC e SCC e
Alm da regio ITS do rDNA, outras regies do genoma incubar a 30C. As culturas devem ser mantidas por at qua-
tro semanas antes de serem descartadas como negativas.113
de Hcc com potencial para serem utilizadas no diagnstico
especfico da histoplasmose incluem aquelas que codificam Macro e micromorfologia (P.3)
30 89
os antgenos H e M . Crescimento normalmente rpido e a colorao , ini-
cialmente, branco-acinzentada, creme a marrom. A textura
METABLITOS FNGICOS muito varivel, mas inicialmente adquire aspecto acamur-
Recentemente, novas tcnicas de diagnstico tm sido ado a penugento. O reverso varia de acrmico, bronzeado a
78
empregadas na tentativa de deteco de (1-3)--D-glucana. castanho-marrom. importante salientar que existe consi-
dervel variao na taxa de crescimento e na morfologia co-
INTRADERMORREAO lonial (Figura 2.59).64,118,120
A intradermorreao com o emprego de antgeno polis-
sacardico j foi utilizada, como tcnica de triagem, para ca-
sos de histoplasmose canina naturalmente adquirida.143
Precaues recomendadas: nvel de biossegurana 1 no
manuseio de espcimens clnicos e no trabalho com te-
cidos animais e nvel 3 na manipulao de culturas fila-
mentosas identificadas como H. capsulatum e no pro-
cessamento de solo que contenham condios.171
15. COCCIDIOIDOMICOSE
A coccidioidomicose, que acomete humanos e diversas
espcies animais, pode constituir uma infeco respiratria
benigna que pode regredir espontaneamente ou evoluir para
doena sistmica grave, envolvendo meninges, ossos, articu-
FIGURA 2.59. Macromorfologia de Coccidioides immitis/posadasii complexo. Cor
laes ou tecidos cutneo e subcutneo. Os quadros clnicos
creme a marrom e textura penugenta a algodonosa. (Laboratory of
so descritos como formas primria (pulmonar e cutnea) e
18,53 Microbiology, VMTH-UCDavis, EUA).
secundria (pulmonar e disseminada).

Observa-se a presena de hifas hialinas e ramificadas Precaues recomendadas: nvel de biossegurana 1 nas
com formao alternada de artrocondios com paredes es- instalaes laboratoriais e no trabalho com espcimens
pessas, retangulares ou em forma de barril, com salientes clnicos; identificao de isolados; processamento de te-
escaras terminais e uma clula disjuntora (sem contedo ci- cidos animais e no manuseio de dejetos de animais, pois
64
toplasmtico) intercalada (Figura 2.60). a urina pode conter o fungo. Nvel de biossegurana 3
no trabalho com a fase filamentosa ou processamento de
171
solo com suspeita de conter artrocondios.
16. ZIGOMICOSES
So micoses decorrentes do desenvolvimento dos zigomi-
cetos em diversos stios anatmicos do homem e de diversas
espcies animais. um termo bastante abrangente, pois en-
globa todas as micoses causadas pelos fungos do filo
Zygomycota, que congrega fungos filamentosos asseptados
45,83
que produzem zigsporos na fase de reproduo sexuada.
A seguir sero apresentadas dois grupos de micoses cujo
nome genrico est relacionado tambm com a taxonomia.
Existe uma variada nominata de fungos causadores das cha-
madas mucormicoses, assim denominadas pelo fato de os
FIGURA 2.60. Micromorfologia de Coccidioides immitis/posadasii complexo. Presen- agentes etiolgicos pertencerem ordem Mucorales. Por ou-
a caracterstica de artrocondios hialinos de paredes espessas, em tro lado, as entomoftoramicoses, so causadas por fungos da
forma de barril, intercalados com uma clula disjuntora (sem con- ordem Entomophthorales que tem apenas dois gneros de
tedo citoplasmtico), Lactofenol azul de algodo, Obj. 100). (Labo- importncia mdica.
ratory of Microbiology, VMTH-UCDavis, EUA).
MUCORMICOSES
HISTOPATOLOGIA As micoses causadas por membros da ordem Mucorales
A resposta tecidual inicial na doena disseminada su- so geralmente agudas e desenvolvem-se rapidamente em
purativa, contudo, quando se trata de doena progressiva e indivduo debilitado, principalmente em processos preexis-
crnica, ela se caracteriza por uma reao granulomatosa tentes que levem neutropenia ou disfuno dos neutrfi-
com algumas reas apresentando resposta celular mista. A los, raramente gerando doena em pacientes imunocompe-
supurao aguda est usualmente presente no entorno dos tentes. A doena apresenta diversas formas clnicas:
artrocondios e depois da ruptura das esfrulas. Inflamao rinocerebral ou centrofacial (vias areas superiores e envol-
granulomatosa normalmente ocorre ao redor da esfrula em vimento do SNC), pulmonar, trato gastrintestinal (TGI),
desenvolvimento. Coloraes com PAS e GMS permitem a subcutnea e, mais raramente, outros sistemas. Em huma-
81,87,172,213
diferenciao da parede fngica e dos endsporos. nos, depois da aspergilose e candidose, a mucormicose a
terceira infeco fngica oportunstica mais comum em pa-
115,118,199,205,215
SOROLOGIA cientes hematopatas.
Fixao de complemento (FC) tem sido o mtodo pa- Algumas das principais espcies envolvidas, tanto na ca-
dro-ouro para o diagnstico sorolgico da coccidioidomi- sustica humana quanto animal, so Rhizopus oryzae (Rhi-
162
cose , muito embora a reao de precipitao in vitro possa, zopus arrhizus), Rhizopus microsporus (var. microsporus,
tambm, ser utilizada. var. oligosporus e var. rhizopodifirmis), Mucor circinelloides,
O teste de ELISA (ensaio de imunoadsoro enzimtica) Rhizomucor pusillus (Mucor pusillus), Absidia corymbifera,
permite um diagnstico mais sensvel e especfico e com re- Syncephalastrum racemosum e Mortierella wolfii.45,64
sultados mais rpidos, e constitui uma importante ferra-
menta para avaliao dos anticorpos desenvolvidos na res- EXAME DIRETO
posta imunolgica que ocorre na coccidioidomicose necessrio que se estabelea o diagnstico com rapidez.
75
canina. Os elementos fngicos so normalmente pouco numerosos
Por outro lado, atravs de teste imunoenzimtico (EIA), em aspirado dos tratos fistulizados; escarro, nas doenas
os antgenos podem ser detectados precocemente no curso pulmonares e nas amostras de bipsias. O material prepara-
da coccidioidomicose. Entretanto, ainda necessrio uma do com KOH 10% adicionado de tinta Parker ou branco de
padronizao do teste para que seja utilizado como ferra- calcoflor, contm hifas largas, asseptadas, parede espessas
menta nos laboratrios clnicos.
161,162
refratrias, irregulares com 6 a 15 m de dimetro.115,199,205

CULTIVO
O isolamento dos zigomicetos a partir de fragmentos
de tecidos pode ser problemtico. Inmeros relatos de cul-
tivos negativos, tanto em bipsia como em necropsia, so
atribudos macerao do espcimen clnico, pois como as
hifas no apresentam septo, se houver compresso, o cito-
plasma ser expulso e no se obter o crescimento fngi-
co.45,104,113
Os zigomicetos crescem em meios padres de laborat-
rio de 12 a 18 horas aps a semeadura da amostra, com ma-
turao das colnias, muitas vezes, em at quatro dias, for-
mando colnias de colorao cinza a marrom. Textura
geralmente algodonosa devido ao desenvolvimento de
abundante miclio areo. Estabelecer o diagnstico ba-
seado apenas no crescimento em cultivo questionvel,
pois esses fungos esto normalmente presentes na micro-
biota ambiental e crescem em quase todos os substratos
orgnicos.64,113,199
Raspados, secrees e material de bipsia podem ser ino-
culados em gar extrato de malte, gar batata ou gar SC e
incubados a 25 ou 30C. O meio deve conter antimicrobia-
nos, mas no indicado o uso de ciclo-heximida, pois os zi-
gomicetos so sensveis a esse impediente. O isolamento FIGURA 2.61. Macro e micromorfologia de Rhizopus oryzae. Presena de esporn-
pode ser facilitado atravs da inoculao de fragmentos do gio, esporangiosporos e rizides nodais (Lactofenol azul de algodo,
espcimen clnico em uma fatia de po umedecido e esterili- 240x; quadro direito-anverso da colnia e esquerdo-detalhe do espo-
zado, devido acentuada habilidade sacaroltica que os zigo- rngio rompido, 650x). (David Ellis, Mycology Unit, Womens and
micetos possuem.115,113,199 Childrens Hospital, Adelaide, Austrlia).
Absidia sp
Rhizopus sp
A superfce tem cor cinza, algodonosa e spera. O miclio
Crescimento rpido e as espcies patognicas crescem
areo cobre rapidamente o meio de cultivo e apresenta uma
bem a 37C. A colorao inicialmente branca, passando 200
textura semelhante ao algodo doce. O reverso branco.
para cinza ou marrom-amarelada, recoberta de pontos ne-
As hifas so hialinas, largas (6 a 15 m), asseptadas (ou
gros. A superficie coberta com um denso miclio areo que
raramente septadas). A estrutura semelhante quela do Rhi-
tem aspecto semelhante ao algodo doce. O reverso
zopus, exceto pelo fato de os esporangiforos da Absidia de-
branco.64
senvolverem-se entre os rizoides nos estoles e no em oposi-
As hifas so hialinas asseptadas (cenocticas), largas (6
o a esses. Alm disso, os esporangiforos so ramificados e
a 15 m), ou muito raramente septadas. Numerosos esto-
maiores e formam apfises logo abaixo da columela. A colu-
les esto presentes entre as hifas do miclio, conectando
mela semicircular com uma pequena projeo no topo. Os
grupos de longos esporangiforos usualmente no ramifi- 55,64,215
esporangisporos so levemente piriformes ou esfricos.
cados. No ponto onde os estoles e os esporangiforos se
encontram, so produzidas hifas semelhantes a razes, de- Mucor sp
nominadas de rizoides (Figura 2.61). Os esporangiforos Rapidamente ocorre formao de miclio areo exube-
so longos e terminam em uma estrutura arredondada e rante, inicialmente branco e que depois se torna cinza. A
escurecida, denominada de esporngio, que contm uma textura da colnia tem aspecto semelhante ao algodo
estrutura curva chamada de columela. O esporngio con- doce. O reverso branco.
tm muitos esporos hialinos ou marrons, ovais, conheci- As hifas so hialinas, largas (6 a 15 m) e praticamente
dos como esporangisporos. Para a liberao desses espo- no septadas. Os esporangiforos so longos, frequentemen-
ros endgenos necessrio a desintegrao da parede do te ramificados, e do origem a um esporngio globoso ter-
esporngio.45,61,75,159,199 minal. A parede dele dissolve-se, liberando os esporangis-

poros arredondados ou levemente oblongos e revelando a 17. ENTOMOFTORAMICOSES

columela que algumas vezes produz um colarinho na base So micoses causadas por espcies dos gneros Basidio-
de insero do esporangiforo. No h formao de rizoides bolus e Conidiobolus, pertencentes ordem Entomophthora-
55,64,159,200
(Figura 2.62). les do filo Zycomycota. O raspado de mucosa nasal, material
de biopsia dos plipos ou dos tecidos cutneos podem ser
cultivados meios sem ciclo-heximida.45
18. BASIDIOBOLOMICOSE
uma doena inflamatria crnica ou granulomatosa,
tambm conhecida como entomoftoramicose subcutnea,
caracterizada por uma grande quantidade de massas subcu-
tneas no ulceradas, endurecidas e palpveis. A micose co-
mea como um ndulo subcutneo, e o agente etiolgico o
Basidiobolus ranarum (B. haptosporus).82,83,101
EXAME DIRETO
Na basidiobolomicose, o material de bipsia preparado
com KOH 10% pode revelar hifas refringentes largas (4 a 10
FIGURA 2.62. Micromorfologia de Mucor sp. Presena de esporngio, esporangios-
m at 40m), septadas ou esparsamente septadas, dupla-
poros e ausncia de rizides (Lactofenol azul de algodo, Obj. 40).
mente refratrias, raramente ramificadas (ramificaes em
ngulo reto em relao hifa principal) e com incluses gra-
Rhizomucor sp nulares. Os espcimens biopsiados devem ser cultivados
Alguns membros do gnero so termfilos (50 a 58C). sem demora, pois o B. ranarum perde viabilidade quando
Inicialmente a colorao cinza, tornando-se marrom-es- armazenado sob refrigerao.55,64,215
cura, com o tempo. A textura da colnia tem aspecto seme-
lhante ao algodo doce. O reverso branco. CULTIVO
Esse gnero tem caractersticas intermedirias entre o Inocular o material clnico em gar SC e no usar meio
Rhizopus e o Mucor. As hifas so hialinas largas e assepta- contendo ciclo-heximida. Incubando a 30C, o crescimento
das (ou raramente septadas). Os esporangiforos so mar- do B. ranarum que relativamente rpido, pode ser visibili-
rons, ramificados que se elevam de estoles que esto fixa- zado em 48 horas, e atingir pleno desenvolvimento em at
dos ao meio por rizoides pouco desenvolvidos. Poucos 10 dias.
64
rizoides so encontrados nos estoles. Os esporngios so

globosos e escuros. Os esporangiforos so pequenos, Macro e micromorfologia
55,64,159,200
subglobosos a globosos. A superfcie delgada, plana e posteriormente elevada.
A textura membranosa com desenvolvimento de dobras e
HISTOPATOLOGIA sulcos radiais, ficando coberta com fino miclio areo. A co-
A importncia do exame histopatolgico indiscutvel, lorao pode variar entre creme, bege, amarela, cinza, cinza-
uma vez que os zigomicetos podem contaminar amostras -esverdeada ou marrom-acinzentado. Colnias satlites so
clnicas. Diferentes coloraes podem ser utilizadas tais formadas frequentemente pela germinao de propgulos
como hematoxilina-eosina (HE) e a tcnica de Grocott, que fngicos ejetados da colnia primria.55,64,199,215
a melhor para demonstrao das hifas no tecido, devido ao As hifas so grandes (8 a 20 m), ocasionalmente septa-
alto contraste e mnima impregnao de fundo. O exame re- das, e, aps 7 a 10 dias, a colnia j apresenta miclio abun-
vela alteraes teciduais, tais como presena de inflamao dante com formao de zigsporos, esporforos e esporos
piogranulomatosa difusa associada a macrfagos, clulas assexuados. Os zigsporos so globosos (20 a 50 m) e tm
gigantes multinucleadas e neutrfilos. Os zigomicetos so uma espessa parede lisa a ondulada, com um formato de
altamente invasivos, particularmente em paredes de vasos bico proeminente em um de seus lados, que uma das carac-
sanguneos, causando vasculite trombtica necrosante tersticas do gnero (Figura 2.63). Os esporforos apresen-
aguda. As hifas que variam de 6 a 50 m de dimetro, so tam uma dilatao cnica ou vescula em sua extremidade
esparsamente septadas ou asseptadas e irregularmente ra- que serve para que os esporos sejam projetados violenta-
41,104,172,213 55,64,72
mificadas. mente para o exterior.

55
rom-escuro. A tampa da placa de Petri rapidamente fica
55.64
repleta de condios que so expelidos pelos conidiforos.
As hifas tm poucos septos e os conidiforos do origem,
em suas extremidades, a condios unicelulares esfricos a pi-
riformes, que apresentam uma proeminente papila basal
com bordas arredondadas, caracterstica do Conidiobolus
coronatus (Figura 2.64). O condio liberado pode germinar e
originar um condio secundrio (replicativo), ou pode for-
mar diversos condios secundrios que cobrem toda a sua
superfcie, que fica com um aspecto de coroa (hair-li-
55,64,72
ke).
FIGURA 2.63. Micromorfologia de Basidiobolus ranarum. Lado esquerdo: presena de

hifas largas, esporforos e esporos (800x); lado direito: zigosporos lisos
e com paredes grossas (Lactofenol azul de algodo, 750x). (David Ellis,
HISTOPATOLOGIA
Presena de hifas largas (20 m de dimetro) e assepta-
das, circundadas por reao do tipo Splendori-Hoeppli e as-
sociadas a infiltrado inflamatrio composto por eosinfilos,
neutrfilos, linfcitos, plasmcitos, clulas epitelioides e c-
41,87,172,213 FIGURA 2.64. Micromorfologia de Conidiobolus coronatus. Lado esquerdo: condio
lulas gigantes multinucleadas.
esfrico com apndices vilosidades na parede (Lactofenol azul de al-
godo, 1300x); lado direito: papilas proeminentes caractersticas da
19. CONIDIOBOLOMICOSE espcie (1200x). (David Ellis, Mycology Unit, Womens and Childrens
Tambm denominada de rinoentomoftoramicose, cau- Hospital, Adelaide, Austrlia).
sada por Conidiobolus coronatus (Entomophthora coronata).
um processo inflamatrio crnico ou granulomatoso, res-
trito mucosa nasal e ao tecido adjacente, caracterizado por HISTOPATOLOGIA
presena de plipos ou massas subcutneas, limitados e pal- Presena de granulomas multifocais, com uma rea cen-
83
pveis. Tambm, dentre as 27 espcies j descritas, C. in- tral necrtica, contendo hifas septadas com 7 a 10 m de
congruus e C. lamprauges tm sido associadas a casos de mi- dimetro. As hifas esto rodeadas por um halo eosinoflico
coses humanas e animais.
95,101 (fenmeno de Splendori-Hoeppli) associado a infiltrado in-
flamatrio composto por eosinfilos, neutrfilos, linfcitos,
plasmcitos, clulas epitelioides e clulas gigantes multinu-
EXAME DIRETO
cleadas. No ocorre invaso vascular e a reao celular pode
O exame do material biopsiado, macerado e clarificado 41,87,104,172,213
ser aguda ou crnica.
com KOH 20% revela hifas refringentes curtas, largas (4 a
215
10m podendo chegar at 22 m) e com poucos septos.
20. DOENAS NO FNGICAS
CULTIVO PITIOSE
Conidiobolus coronatus cresce rapidamente em gar SC A pitiose uma doena granulomatosa causada pelo oo-
entre 30 a 37C, normalmente em 48 a 72 horas, alcanando miceto Pythium insidiosum pertencente ao Reino Strameno-
5
a maturidade em cinco dias. pila. Acomete equinos (Figura 2.65), provocando quadro
infeccioso na pele e tecido subcutneo; em caninos tm
69 121
Macro e micromorfologia apresentao gastrintestinal e cutnea ; nos bovinos ma-
185
A colnia plana e a textura glabrosa, cerosa, tornan- nifesta-se como doena cutnea (Figuras 2.66 e 2.67) , en-
do-se finamente pulverulenta e coberta por pequenas hifas quanto os felinos e os humanos apresentam quadro clnico
areas brancas. Colorao creme a bege e, com o envelheci- de arterite, ceratite e celulite periorbital. mais prevalente
mento da colnia, adquire tons marrom-amarelado ou mar- em reas tropicais, subtropicais ou temperadas.
83,139,186

CULTIVO
O sucesso no isolamento de Pythium insidiosum alto
quando amostras de bipsias, acondicionadas em lquido
com antimicrobianos, forem mantidas sob temperatura am-
biente, entre um e trs dias antes de seu processamento no
laboratrio. Quando o meio de transporte no for suplemen-
tado com antimicrobianos, recomenda-se transportar o ma-
86
terial biopsiado a 4C. Alguns autores tambm sugerem o
144
uso, como rotina para isolamento do agente, de gar V8 ,
acrescido de estreptomicina (200g/mL) e ampicilina
(100g/mL). Pequenos fragmentos no macerados de tecido
fresco devem ser distribudos diretamente na superfcie do
gar e incubados a 37C. Aps 12 a 24 horas possvel se
83
observar o desenvolvimento inicial do miclio areo.
FIGURA 2.65. lcera em regio torcica ventral de equino, tecido subcutneo expos- Macro e micromorfologia
to, frivel e com sangramento abundante em caso de Pitiose. Acervo A identificao presuntiva feita observando-se o aspec-
C.E.Larsson. to da colnia e as caractersticas das hifas (Figura 2.68). As
colnias, nos gares V8, fub (CMA) ou SC, apresentam co-
54
lorao branca ou hialina. Os zosporos podem ser produ-
zidos em folhas estreis de grama distribudas em gar gua
a 2% (Figura 2.69) e incubadas a 37C entre 18 e 24 horas.
Em seguida, as folhas infectadas pelo P. insidiosum so colo-
cadas em soluo de sais minerais diluda a 1%. Os zospo-
83,186
ros crescem a partir de hifas terminais.
FIGURA 2.66. lcera terebrante em face lateral de membro plvico de co da raa

poodle em caso de Pitiose. Notar reas recobertas por crostas necrti-
cas. Acervo C.E.Larsson.
FIGURA 2.68. Micromorfologia de Pythium insidiosum. Hifas asseptadas e ramifica-

das em ngulo reto, em agar farinha de milho (Lactofenol de Amann,
Obj. 40). (LAPEMI-UFSM, RS).
FIGURA 2.67. lcera terebrante em lombo sacra de co da raa Pastor Alemo em FIGURA 2.69. Cultivo de Pythium insidiosum em meio com folhas de Paspalum nota-
caso de Pitiose. Notar extensas reas recobertas por crostas necrti- tum para a induo de zoosporognese. Crescimento em 24 horas
cas e aulcera com mais de 2 cm de profundidade. Acervo R. Lucas. (esquerda) e 56 horas (direita). (LAPEMI-UFSM, RS).

HISTOPATOLOGIA descrita a padronizao do teste ELISA para deteco de IgG

Presena de infiltrado inflamatrio piogranulomatoso em coelhos imunizados com antgenos de P. insidiosum.187
composto por eosinfilos e associado a clulas gigantes mul- Testes de ELISA para diagnstico sorolgico precoce de pi-
tinucleadas. Tambm podem ser observadas reas necrti- tiose em caninos e humanos tambm foram desenvolvidos.86
cas, acantolticas e ulcerao da epiderme. A colorao de
GMS permite uma melhor vizibilizao das hifas, que apre- 21. DETECO DE RNA/DNA
sentam paredes pouco espessas, raras septaes e ramifica-
O sequenciamento gnico com amplificao do RNA ri-
es em ngulo reto (Figura 2.70).41,72,87
bossomal, regio ITS 1, atravs de PCR, uma ferramenta
poderosa para identificao de Pythium insidiosum.85,178
LAGENIDIOSE
O agente etiolgico o oomiceto Lagenidium gigan-
teum, considerado como um patgeno emergente e, at o
momento, somente isolado de casos clnicos no sudeste dos
Estados Unidos da Amrica. Tem evoluo progressiva e
provoca leses cutneas multifocais, leses subcutneas, ou
ambas, associadas com linfadenopatia regional. As leses
podem ser ulceradas, exsudativas (frequentemente com ne-
crose e formao de trato fistuloso) ou apresentarem mlti-
plos ndulos firmes, consistentes, de localizao drmica
ou subcutnea.83
FIGURA 2.70. Presena de infiltrado inflamatrio, hifas, que apresentam paredes
pouco espessas, raras septaes e ramificaes em ngulo. Colorao CULTIVO
HE. Acervo C.E.Larsson Colnia de crescimento rpido em meios especiais,
como o caldo PYG incubado entre 25 e 27C. O miclio no
SOROLOGIA apresenta cor caracterstica.
Foram desenvolvidas tcnicas de imunodifuso em gel Macro e micromorfologia (P.3)
de gar (ID), fixao do complemento (FC) e um teste de As hifas so largas, septadas, ocasionalmente ramifica-
hipersensibilidade intradrmica (TI), para diagnosticar e das e, em meio lquido, ocorre formao de zosporos bifla-
avaliar a respostas imune humoral e celular. Os testes reali- gelados.
zados em equinos que apresentavam comprovada pitiose
clnica diagnosticaram positivamente 100% (ID), 82% (FC)
HISTOPATOLOGIA
e 64% (TI) dos casos. Esses dados comprovaram que o teste
As caractersticas da reao tecidual so muito seme-
de ID apresenta alta sensibilidade e especificidade para a de-
lhantes quelas encontradas na pitiose e zigomicose, isto ,
teco de anticorpos anti-Pythium insidiosum.139,145
intensa inflamao eosinoflica granulomatosa, frequente-
A eficcia da ID para o sorodiagnstico das zigomicoses
mente, com clulas gigantes multinucleadas e presena de
causadas por Basidiobolus ranarum e Conidiobolus corona- 84
hifas asseptadas.
tus em humanos e animais, assim como para pitiose j foi
demonstrada, o que torna o teste muito til para o estabele-
cimento do diagnstico diferencial dessas trs micoses em SOROLOGIA
humanos e animais.111 A resposta sorolgica detectada atravs do emprego do
84
Mendoza et al.140 desenvolveram um teste de ELISA para Western-blot.
o sorodiagnstico de pitiose utilizando antgeno solvel de
hifas sonicadas. Amostras obtidas de humanos e animais 22. NOCARDIOSE
saudveis e de animais com pitiose clnica foram testadas e os A nocardiose uma enfermidade contagiosa espordica
resultados comparados com os do teste de ID. Os resultados em ces e gatos, de curso agudo a crnico e cujos processos
indicam que o teste de ELISA eficaz para o diagnstico da inflamatrios supurativogranulomatosos circunscritos, s
pitiose e possui especificidade semelhante ID, porm com vezes, afetam somente a pele e tecido subcutneo, ainda que,
melhor sensibilidade. No Brasil, o desenvolvimento de um na maior parte dos casos, se apresente como uma enfermi-
teste de ELISA para diagnstico de pitiose equina181 e de uma dade sistmica.196 A nocardiose canina frequentemente
tcnica de ELISA-conta para deteco da soropositividade ocorre pela inalao de organismos presentes no solo ou, se-
de equinos7 apresentaram bons resultados. Tambm j foi cundariamente, a uma soluo de continuidade.175,176,196

Nocardia spp. so actinomicetos aerbicos pertencentes Colorao de Gram

Famlia Mycobacteriaceae. So bactrias estritamente aerbi- As espcies de Nocardia produzem finos filamentos de
cas, Gram-positivas, lcool-cido resistente parciais, que for- aproximadamente 1 m de largura. medida que cresce, o
mam filamentos segmentados que do origem a elementos bacilo divide-se por fisso binria, mas as clulas indivi-
cocoides pleomrficos. As espcies de Nocardia, amplamentes duais permanecem ligadas umas s outras e formam fila-
distribudas na natureza, so essencialmente saprotrficas e mentos, longos e ramificados, de at 50 m de comprimento.
188
envolvidas na decomposio de matria orgnica. Ao exame, apresentam-se como segmentos Gram-positivos
Alguns autores demonstraram a existncia de 20 a 30 es- entremeados com segmentos Gram-negativos. Os filamen-
pcies vlidas de Nocardia, sendo a N. asteroides a espcie tos Gram-positivos podem se apresentar irregularmente
que mais acomete seres humanos e animais.31,68,87 Outras es- corados. Eventualmente, esses filamentos fragmentam-se e
pcies patognicas importantes so N. brasiliensis, N. pseu- assumem forma de cocos ou bacilos. Apesar de se apresen-
dobrasiliensis, N. otitidiscaviarum (N. caviae), N. farcinica e tarna coloraocomo filamentos Gram-positivos, o gne-
N. transvaalensis.68 ro Nocardia melhor caracterizado pela sua alcool-acido-
O diagnstico tem sido realizado por mtodos laborato- -resistncia parcial (colorao de Kinyoun modificado).
riais de identificao fenotpica e quimotaxonmica. A iden- (Figura 2.72).68
tificao preliminar de Nocardia rpida, pois se baseia ini-
cialmente na observao de bacilos filamentosos
parcialmente cido-resistentes. Entretanto, a identificao
definitiva frequentemente demorada, devido ao complexo
N. asteroides, grupo composto de espcies mais comumente
isoladas, no reagir com a maioria dos testes diferenciais
utilizados na classificao bioqumica.152
Devido ao ambiente em que muitos animais so manti-
dos, a contaminao de exsudatos e de espcimens submeti-
dos ao laboratrio de diagnstico veterinrio comumente
um problema. Pelo fato de a Nocardia estar presente no solo,
a maioria dos isolados laboratoriais pode significar apenas
uma contaminao banal.106
FIGURA 2.72. Citologia aspirativa. Microorganismos filamentosos, pleomrficos

EXAME DIRETO
Gram-positivos sugestivos do gnero Nocadia (Gram, Obj. 100).
Pode ser realizado a partir de pus, proveniente das leses
(Mrcio G. Ribeiro, FMVZ-UNESP/Botucatu, SP).
cutneas, (Figura 2.71) ou dos gros que devem ser procura-
dos cuidadosamente na secreo piogranulomatosa, que
drena das fstulas no quadro clnico de nocardiose chamado Avaliao da Alcool-acido-resistncia
de micetoma actinomictico (terminologia incorreta). Esses A maioria dos espcimens clnicos de Nocardia spp.
gros tm colorao esbranquiada e possuem tamanho que lcool-cido-resistente quando um cido fraco (cido sulf-
varia de 15 a 200 m.72,215 rico 0,5 a 1%) for utilizado na descolorao de mtodos
como Kinyoun modificado, Ziehl-Neelsen ou Fite-Faraco,
que so fundamentados na carbol-fuccsina. Usualmente,
Actinomyces e Streptomyces so Gram-positivos, mas no
so acido-resistentes. Nocardia spp. geralmente se impreg-
nam por coloraes de prata, no sendo alcool-resistentes
em cortes histolgicos.68,188
CULTIVO
Os meios de eleio para isolamento so o gar-sangue
Nocardia (Figura 2.73), o gar chocolate e o gar Sabouraud
Nocardia (Figura 2.74). As espcies de Nocardia podem cres-
cer bem em meios que contenham ciclo-heximida, no entan-
to, alguns isolados podem ser inibidos pela presena da gen-
tamicina. Algumas vezes, devido grande contaminao,
FIGURA 2.71. Nocardiose. Puno aspirativa de ndulo subcutneo submandibular poder ser necessria a utilizao de meios como o gar ex-
causado por Nocardia asteroides. (Mrcio G. Ribeiro, FMVZ-UNESP/ trato de levedura carvo tamponado (BCYE).152,188 Os mi-
Botucatu, SP). crorganismos do gnero Nocardia ocasionalmente crescem

em meios de cultivo utilizados para o isolamento de mico- MTODOS BIOQUMICOS

bactrias e fungos, entretanto, sempre mais confivel a uti- A resistncia lisozima diferencia espcies de Nocardia
lizao de meios bacterianos especficos.118,152 de Streptomyces. Inicialmente, a identificao de Nocardia
baseada na hidrlise de casena, tirosina, xantina e hipoxan-
tina. Alm dos testes acima citados, rotina incluir-se a hi-
drlise do amido, hidrlise da gelatina, testes de urease e
catalase para identificao da maior parte das espcies de
Nocardia.188
HISTOPATOLOGIA
O mtodo de colorao GMS alm de ser til na demons-
trao da presena de micro-organismos fngicos em cortes
histolgicos, tambm serve para detectar a presena de bac-
trias, como por exemplo, Nocardia sp., Mycobacterium sp. e
Actinomyces sp.68 Atravs da colorao de HE pode-se ob-
servar a presena de infiltrado piogranulomatoso associado
a macrfagos e neutrfilos.41,87
FIGURA 2.73. Macromorfologia de Nocardia asteroides em agar sangue aps 72
horas. (Mrcio G. Ribeiro, FMVZ-UNESP/Botucatu, SP). SOROLOGIA
A maioria dos testes sorolgicos para actinomicetos tem
sido prejudicada pela falta de especificidade e sensibilidade
devido falta de homogeneidade antignica ou a inabilidade
de Nocardia spp. em secretar o antgeno em questo. Um
considervel nmero de antgenos tem sido proposto para
testes sorolgicos, incluindo protenas de 24, 26, 36, 55 e 62
kDa, filtrados de culturas, extratos citoplasmticos, fator
corda (dimicolato de trealose) e antgenos celulares totais.
Os testes empregados so ensaios de imunoadsoro enzi-
mtica (ELISA), Western-blot, imunodifuso em gel de gar
(ID) e imunofluorescncia indireta (IFI).31,62
A maior parte dos testes de sorodiagnstico j desenvol-
vidos para Nocardia spp. tem sucesso limitado devido rea-
o cruzada dos antgenos e falta de sensibilidade. Antge-
nos de Nocardia spp. foram separados por focalizao
isoeltrica para a produo de diversos anticorpos monoclo-
FIGURA 2.74. Macromorfologia de Nocardia asteroides em Agar Sabouraud. Col- 62
nais, dos quais somente dois evidenciaram ausncia de rea-
nias com aspecto filamentoso e colorao amarelo-laranja aps uma o cruzada com antgenos micobacterianos, o que poderia
semana. implicar utilizao deles como sondas para deteco de an-
tgenos de N. asteroides isolados de casos clnicos. Outros
As espcies de Nocardia apresentam crescimento mais autores relatam a produo e caracterizao de anticorpos
lento do que outras bactrias, e as colnias geralmente levam monoclonais para o antgeno de 54 kDa, o que poder ser
de 2 a 14 dias para se desenvolver, sob temperaturas de incu- um primeiro passo para a padronizao de reagentes para
22,32,103
bao situadas na faixa de 25 a 37C, entretanto, a morfolo- imunodiagnstico de nocardiose.
gia caracterstica da colnia pode ser evidente somente aps
quatro semanas.31,68 DETECO DE RNA/DNA
Os mtodos moleculares foram desenvolvidos nos anos
Macro e micromorfologia 90, incluindo um mtodo de PCR para sequenciamento da
As colnias de Nocardia spp. tm aparncia varivel, mas regio 16S rRNA capaz de distinguir o gnero Nocardia en-
a maioria das espcies aparenta ter filamentos areos quando tre os actinomicetos aerbicos. A anlise por meio de enzi-
visibilizadas em microscpio de disseco, particularmente mas de restrio de um fragmento 441-bp do gene da pro-
quando se desenvolvem em meios nutricionalmente limitan- tena 65-kDa (hsp65) foi desenvolvido para identificar
tes.68 A micromorfologia j foi descrita anteriormente. espcies individuais de Nocardia. As enzimas de restrio

reconhecem sequncias especficas de nucleotdeos nas mo- esporos cocoides ou discoides. Na diviso longitudinal
lculas de DNA. O uso sequencial das duas tcnicas promo- ocorre a formao de conjuntos de duas a oito fileiras de
ve uma identificao simples e rpida de Nocardia spp, com clulas cocoides paralelas. Aps essa diviso, os filamentos
base na amplificao e no nmero e tamanho dos fragmen- podem ter um dimetro de 3,5 m. Essas colunas paralelas
tos gerados pelas enzimas de restrio.31,179,188 de corpos cocoides so extremamente sugestivas de Derma-
tophilus congolensis (Figura 2.75).106,42
23. DERMATOFILOSE
A dermatofilose uma dermatite exsudativa cosmopoli-
ta provocada pelo actinomiceto Gram-positivo, aerbico e
anaerbico facultativo, Dermatophilus congolensis. Acomete
diversas espcies de mamferos, caracterizando-se por erup-
es cutneas escamocrostosas circunscritas.106 A doena
raramente tem sido observada em ces e gatos. Em felinos,
essa bactria pode causar leses piogranulomatosas profun-
das, com a presena de fstulas, principalmente na regio
dos linfonodos poplteos. Leses da cavidade oral e de ln-
gua tambm j foram descritas nessa espcie.42,105,112
EXAME DIRETO
Espcimens como crostas epidrmicas, exsudatos, pus e
raspados de leses, devem ser oriundos de leses ativas. Pelo
fato de os organismos estarem dispersos nas leses, geral-
mente difcil vizibiliz-los atravs dos mtodos tradicio-
nais de colorao, principalmente, quando a amostra pro-
FIGURA 2.75. Exame direto (imprint) de crostas umedecidas. Estruturas tpicas de
veniente de leses crnicas ou em fase de cicatrizao. Os Dermatophilus congolensis: filamentos gram-positivos com divises
procedimentos para isolamento em cultivo tambm so cr- transversais e longitudinais conferindo aspecto semelhante a trilho
ticos, pois se trata de um micro-organismo fastidioso.106 de trem (Pantico, Obj. 100).
Tcnica de Haalstra
Consiste na macerao das crostas em gua destilada es- CULTIVO
tril seguida de exposio ao CO2 durante trs horas. A na- O material biolgico pode ser diretamente semeado em
tureza capnoflica desse microrganismo explica a razo de meio de cultura slido, ou ser, previamente, diludo em solu-
os zosporos do D. congolensis concentrarem-se na superf- o salina. O organismo requer meios de cultura ricos, como
cie da suspenso. A partir desse sobrenadante so prepara- gar-sangue e gar BHI (BHI). Normalmente no apresenta
dos esfregaos para coloraes, bem como inculos para os crescimento em gar SC.42,93
cultivos. A Tcnica de Haalstra tem indicao especfica O isolamento poder ser dificultado pela presena de
para diagnstico de dermatofilose.93 contaminao bacteriana, que pode ser reduzida atravs da
adio de 1000 UI de Polimixina B/mL ao gar-sangue, ou
Coloraes de Gram, Wright e Giemsa pelo uso de gar-sangue azida no isolamento primrio. A
Podem ser realizadas em materiais como crostas corta- desvantagem desses meios que as colnias de Dermatophi-
das e umedecidas com algumas gotas de gua esterilizada. lus congolensis no aparecem por at quatro dias aps inocu-
So visibilizadas fileiras de cocos pareados com aspecto se- lao. Os meios semeados devero ser incubados sob atmos-
melhante ao trilho de trem. fera de CO2 a 37C.31,93
Alguns autores recomendam a colorao pelo Giemsa,
por 30 a 60 minutos, seguida por descolorao lcool-ci- Macromorfologia
da.168 Esse procedimento remove o excesso de corantes do Entre 24 e 36 horas de incubao, ocorre o aparecimento
esfregao e facilita a observao das estruturas que tm forte de colnias branco-acinzentadas, rugosas, com dimetro
afinidade pelo corante.106 em torno de 0,5 a 1 mm, na superfcie do gar. Colnias en-
O esfregao corado deve ser examinado para se procu- velhecidas atingem at 4 mm, adquirem colorao amarelo-
rar filamentos finos, intactos ou fragmentados. Os filamen- -alaranjada e, geralmente, se desenvolvem bem aderidas
tos intactos tm, aproximadamente, 1 m de dimetro. A superfcie do gar.31,106 So fracamente beta-hemolticas em
fragmentao ocorre primeiro transversalmente, formando gar-sangue.31,42,106

Micromorfologia SOROLOGIA
Os esfregaos realizados a partir das culturas podem ser Em testes sorolgicos importante que os antgenos uti-
corados pelo Gram, mas a colorao pelo Giemsa geralmen- lizados sejam aqueles contra os quais os animais infectados
te proporciona melhor visibilizao dos elementos. Filamen- geram anticorpos. Alm de imunodominantes, devem ser
tos Gram-positivos finos (Figura 2.76) so evidenciados em especficos ao agente, sem apresentar reatividade cruzada.
colnias novas, que com o tempo se dividem transversal- Os antgenos de D. congolensis so considerados complexos,
mente e, ento, longitudinalmente, formando estruturas de baseado na caracterizao de antgenos obtida com SDS-
at oito clulas cocoides de largura. Em condies propcias -PAGE e Western Blot de produtos extracelulares de fila-
para o crescimento, h liberao de zosporos cocoides m- mentos, cocos, zosporos, clulas ntegras, parede celular e
veis a partir dessas estruturas.31,106 preparaes citoplasmticas.8
A tcnica de imunofluorescncia direta tambm j foi
empregada, com sucesso, na pesquisa de D. congolensis em
material clnico.168 A tcnica de imuno-histoqumica permi-
te a identificao de diversos organismos bacterianos e fn-
gicos em tecidos, dentre eles o D. congolensis.27
DETECO DE DNA
A extrao de DNA de D. congolensis nem sempre bem
sucedida por causa da complexidade do seu ciclo de vida,
que apresenta at mesmo um estgio encapsulado. A pro-
poro de cada um desses estgios na cultura provavelmente
influencia na qualidade e quantidade de DNA obtido e nos
nveis de impurezas.119
Alguns autores desenvolveram a PCR-RAPD (Random
Amplified Polymorphic DNA) que pode ser usada na geno-
tipagem de diferentes isolados de D. congolensis, os quais
FIGURA 2.76. Micromorfologia de Dermatophilus congolensis isolado em agar-san- possuem conhecidas diferenas genticas.119
gue. Filamentos finos gram-positivos observados em culturas novas.
(Gram, Obj. 100). (Laboratory of Microbiology, VMTH-UCDavis, EUA). INOCULAO EM ANIMAIS
O isolamento de Dermatophilus congolensis a partir de
TESTES BIOQUMICOS material biolgico altamente contaminado pode requerer
O D. congolensis Gram-positivo e no lcool-acidore- passagem em animais, atravs da aplicao do espcimen
sistente. Produz cido a partir da dextrose e frutose em 48 diretamente por sobre a pele escarificada de coelhos. O de-
horas. Uma menor produo de cidos ocorre em uma ou senvolvimento de leses cutneas no animal ocorre entre
duas semanas utilizando-se maltose, e no h produo de dois e sete dias, a partir das quais se pode, ento, isolar o
cidos a partir do dulcitol, lactose, manitol, salicina, sorbitol micro-organismo.135
e xilose.31,106 No observada a produo de gs quando da
utilizao de carbo-hidratos. O organismo hidrolisa ureia 24. PROTOTECOSE
em 24 horas e produz catalase em cinco dias.106 Atualmente so reconhecidas entre cinco a sete espcies
do gnero Prototheca, mas apenas P. wickerhamii e P. zopfii
HISTOPATOLOGIA causam infeces em humanos e animais. Esto em desenvol-
A caracterstica histopatolgica mais observada na vimento estudos de genotipagem que propem subespcies e
dermatofilose uma infeco cutnea superficial. Col- at uma nova espcie. So micro-organismos unicelulares,
nias deste actinomiceto podem ser encontradas nas clulas aclorofilados, imveis e saprotrficos, pois obtm nutrio a
epiteliais queratinizadas e nos folculos. Filamentos septa- partir de materiais mortos ou em decomposio, principal-
dos e fragmentados so geralmente abundantes na superf- mente em ambientes midos.102 A formao de esporngios
cie dos exsudatos compostos de clulas epiteliais querati- com endsporos assexuados caracterstica deste gnero.64
nizadas, leuccitos e soro. A presena de infiltrado A prototecose, em pequenos animais, manifesta-se sob
inflamatrio neutroflico, resulta na formao de microa- as formas cutnea e disseminada. Em gatos, aparentemente,
bscessos na epiderme e exsudato seroso que leva ao desen- essa infeco s acomete o tecido cutneo, enquanto em
volvimento de crostas elevadas contendo numerosos fila- ces, embora tambm ocorra esta apresentao, a forma dis-
mentos ramificados.41,87,106 seminada tem sido mais registrada.58,98,99,201

Para o diagnstico preciso de prototecose essencial a A micromorfologia da Prototheca a mesma in vitro ou in

visibilizao in situ e o cultivo da alga.40,41 vivo. O emprego de coloraes especficas possibilita a ob-
servao de esporos esfricos a ovalados (medindo de 6 a 9
CULTIVO m de dimetro) e esporos maiores (15 a 20 m de dimetro)
Quando a amostra provm de material contaminado, contendo endsporos e formando uma imagem tpica de
102
muito comum que o crescimento rpido de bactrias e fun- mrula. Essas estruturas podem estar dentro ou fora do
77
gos dificulte, ou mesmo impea, o diagnstico de Protothe- citoplasma de macrfagos presentes nas reas afetadas. A
ca. Por essa razo foi desenvolvido um meio especial (pro- parede celular de Prototheca spp. fracamente corada pela
posto por Pore) para isolamento de algas.170 Essas algas HE, mas intensamente pigmentada quando se empregam as
41,87,104
podem tambm crescer em gar SC na temperatura de 27C. tcnicas de PAS, GMS, Bauer e Gridley.
Macro e micromorfologia SOROLOGIA

Em 24 a 48 horas possvel a observao de colnias es- Foram desenvolvidos reagentes para a deteco de anti-
branquiadas, planas e de aspecto cremoso, muitas vezes corpos fluorescentes para identificar espcies de Prototheca
parecidas com leveduras.
(P. filamenta, P. moriformis, P. stagnora, P. wickerhamii e P.
So micro-organismos unicelulares, arredondados e de ta-
zopfii) e, tambm, para diferenci-las em tecidos formoliza-
manho varivel que se dividem por septao interna. As clu-
dos, de espcies fngicas morfologicamente similares. A
las maiores (clulas-mes), com at 30 m de dimetro, con-
tcnica mostrou excelente sensibilidade e especificidade,
tm entre 4 a 20 endsporos (estruturas no brotantes esfricas
sendo considerada rpida e confivel para a identificao de
a ovaladas) com 5 a 15 m de dimetro. Ao exame com coran- 202,203
Prototheca sp.
tes (azul de Aman), essas estruturas, devido septao inter-
na, apresentam um aspecto tpico de mrula (Figura 2.77).167
O diagnstico diferencial entre as duas espcies mais im- 25. SUSCETIBILIDADE ANTIFNGICA
portantes pode ser feito por testes de assimilao de acares. Aps um longo perodo que sucedeu a liberao dos pri-
meiros antifngicos triazlicos (itraconazol e fluconazol, no
incio dos anos 1990) e das formulaes lipdicas de anfote-
ricina B, novos agentes antifngicos tornaram-se dispon-
veis. Estes incluem os membros de uma nova classe de anti-
fngicos, chamadas equinocandinas, e de uma nova gerao
de frmacos, nomeada segunda gerao de azlicos, uma
classe j existente.
A maioria dos agentes antifngicos interfere na biossn-
tese do ergosterol, o principal esterol da membrana celular
fngica. Outras causam a ruptura da parede celular fngica
ou interferem na sntese de DNA dos fungos. Com base no
seu mecanismo de ao, os principais agentes podem ser
agrupados em cinco categorias: polinicos; azlicos; alila-
minas; equinocandinas; e outros agentes, incluindo deriva-
dos do grisano (griseofulvina) e flucitosina.
O principal mecanismo de ao dos azlicos a inibio
da biossntese do ergosterol, decorrente da inibio da enzi-
FIGURA 2.77. Micromorfologia de Prototheca sp. (Lactofenol azul de algodo, Obj.
ma 14-alfa-desmetilase, a qual responsvel pela converso
100). (Setor de Patologia Veterinria-UFRGS, RS). 76
do precursor lanosterol em ergosterol. Consequentemente,
os derivados azlicos comprometem a biossntese do ergos-
TESTES FISIOLGICOS terol na membrana citoplasmtica e levam ao acmulo de
Os testes de assimilao e fermentao podem ser reali- esteris, os quais podem desagregar o arranjo compacto das
zados com o auxlio de sistema rpidos de identificao cadeias acclicas dos fosfolipdios, inibindo assim, o cresci-
como API 20C.9,160 mento dos fungos. O ergosterol um componente essencial
da membrana plasmtica fngica, onde regula a permeabili-
HISTOPATOLOGIA dade da membrana e tem um papel importante na respira-
29
Presena de reao tecidual varivel, ocorrendo mais co- o mitocondrial e fosforilao oxidativa. A inibio da
mumente uma reao piogranulomatosa difusa composta sntese de ergosterol afeta o citocromo C oxidase nas mito-
por clulas epitelioides e clulas gigantes multinucleadas.58,99 cndrias e aumenta a sntese de quitina, resultando em uma

29
distribuio irregular da mesma. Portanto, esperado que mas a sua utilizao clnica comumente limitada pela
mudanas nos nveis de ergosterol e nas estruturas de este- ocorrncia de resistncia primria, bem como, adquirida,
ris influenciem a atividade de vrias rotas metablicas. em especial quando usada isoladamente. Habitualmente, al-
Os frmacos pertencentes ao grupo das alilaminas, como tas doses de flucitosina podem suprimir a hematopoiese. O
a terbinafina, atuam especificamente numa etapa precoce da seu papel tem sido limitado utilizao em combinao com
76
biossntese do ergosterol , inibindo a enzima esqualeno- uma formulao de anfotericina B para tratar meningite
-epoxidase, resultando em deficincia de esterol na membra- criptoccica. Est disponvel em formulaes oral e intrave-
na celular fngica e acmulo intracelular txico de esquale- nosa, com mais de 90% de absoro via oral. Efeitos gastrin-
154
no , resultando em morte celular. A terbinafina tambm testinais so incomuns, mas podem ocorrer hepatotoxicida-
43
metabolizada no fgado pelo sistema citocromo P450 e os de e toxicidade da medula ssea.
154
metablitos so excretados na urina. altamente efetiva Frmacos mais recentes, como equinocandinas, pneumo-
54,76
contra dermatfitos in vitro e in vivo , bem como contra candinas, sordarinas, novos azlicos e nistatina lipossomal
fungos filamentosos hialinos e demceos, dimrficos e algu- (com menos efeitos txicos que a frmula original) esto em
15 43
mas espcies de leveduras. Estudos recentes indicaram uma fase de desenvolvimento e ampla avaliao clnica. A prepa-
atividade elevada de terbinafina in vitro contra uma grande rao lipossmica de anfotericina B, complexos lipdicos ou
variedade de fungos invasores, tais como diversas espcies disperso coloidal foram produzidos para reduzir a toxicida-
148,182
de Candida, de Aspergillus ou Penicillium marneffei. de, permitindo a adoo de esquema teraputico mais benfi-
Os polinicos, como anfotericina B e a nistatina, tam- co. Pelo menos alguns deles estaro, em breve, disponveis no
bm atuam na membrana celular fngica, atravs da ligao arsenal teraputico, mas evidente que a combinao da bai-
irreversvel ao ergosterol, levando formao de poros ou xa toxicidade, largo espectro, baixo custo, escolha das vias de
canais, permitindo a sada de ons e comprometendo o me- administrao e boa penetrao tecidual permanece ilusria.
tabolismo celular. Esses medicamentos podem causar nefro- Outras facetas, que precisam ser abordadas, incluem pesqui-
toxicidade, incluindo diminuio da perfuso renal, leso sas que busquem responder se a adio de citocinas a novos
tubular, acidose tubular renal, dependendo das doses admi- agentes promoveria melhora de resultados, e qual a melhor
nistradas e tempo de uso. forma de estudar e traduzir, para uso clnico, combinaes
Os antifngicos que tm o alvo de ao situado na pare- antifngicas. As respostas, a estas e outras questes, iro aju-
56
de celular dos fungos atuam inibindo a sntese das glucanas. dar a definir o futuro da terapia antifngica. Alm disso, a
Os inibidores da (1,3)-D-glucana sintetase incluem os ci- administrao de antifngicos sistmicos deve sempre ser
dos terpenoides, as papulacandinas e as equinocandinas. A feita com base no diagnstico e fatores de risco individual.
caspofungina (Cancidas) faz parte do grupo das equino- O lanamento de novos agentes antifngicos com maior
candinas. O seu mecanismo de ao consiste no bloqueio da eficcia e segurana sempre uma boa notcia para os pa-
sntese de (1,3)-D-glucana da parede celular fngica por cientes, sejam eles acometidos de infeces fngicas superfi-
inibio no competitiva da enzima (1,3)-D-glucana sinte- ciais ou daquelas invasoras. Tanto as equinocandinas como
tase, a qual indispensvel para sntese da parede fngi- os novos triazlicos representam avanos significativos.43
52,136
ca. As cadeias de (1,3)-D-glucana formam uma slida Tendo em vista a quantidade de agentes antifngicos sis-
matriz tridimensional, constituindo-se no maior compo- tmicos disponveis, uma opo para o tratamento a tera-
nente da parede fngica que promove integridade estrutural pia combinada. A combinao ideal de frmacos aquela em
e estabilidade osmtica na maioria dos fungos patogni- que se observa interao sinrgica entre ambas. No entanto,
cos.80,125 A inibio da sntese de (1,3)-D-glucana produz mesmo na ausncia de sinergismo, pode haver outros poss-
um duplo efeito, fungisttico e fungicida. O efeito fungist- veis benefcios de combinaes teraputicas. Por exemplo, a
tico resulta do bloqueio da sntese da parede celular, redu- combinao de duas drogas pode aumentar a taxa de morte
zindo assim o crescimento fngico. J o efeito fungicida re- microbiana e encurtar a durao do tratamento.216 Da mes-
sulta de uma mudana na integridade da parede celular, a ma forma, a combinao de dois medicamentos diferentes,
qual perde sua resistncia mecnica tornando-se incapaz de que exercem seus efeitos por mecanismos distintos, poderia
resistir presso osmtica interna, o que ocasiona a destrui- evitar o aparecimento de resistncia medicamentosa e am-
o da clula fngica.125 Como esta enzima no existe nas pliar o espectro da atividade da associao. Alm disso, com
clulas dos mamferos, este modo de ao nico e especfi- as combinaes antifngicas, que permitem o uso de doses
co na clula fngica, eliminando-se, assim, a toxicidade mais baixas de cada composto, pode-se reduzir o risco de
216
para os animais e humanos. efeitos txicos das drogas.
A flucitosina, um anlogo do antineoplsico 5-fluorou- A indicao para uso dos diferentes antifngicos deve
racil, inibe a sntese proteica da maior parte das espcies de ser baseada nos resultados obtidos com os estudos de susce-
Candida e de Cryptococcus neoformans. H boa difuso para tibilidade disponveis, os quais podem oferecer informaes
50
os fluidos corporais, incluindo o lquido cefalorraquidiano, para escolha do tratamento mais adequado.

A avaliao da atividade antifngica in vitro utiliza tes- de cor no meio, dependente do metabolismo do micro-orga-
tes derivados dos mtodos empregados na avaliao de anti- nismo utilizado como inculo, auxiliando na identificao
49
bacterianos. As tcnicas disponveis para essa finalidade so do ponto de leitura do ensaio. Os mtodos utilizam deriva-
conhecidas como diluio em caldo ou em gar, e difuso dos tetrazlicos, como o MTT (Figura 2.78) ou XTT, que
em gar. O princpio desses mtodos expor um inculo de- tm a propriedade de ser capturados pelas clulas fngicas
finido do micro-organismo diante de concentraes conhe- vivas e, posteriormente, reduzidos pelas desidrogenases mi-
cidas da droga a ser testada e observar o eventual crescimen- tocondriais dos fungos a compostos coloridos, como forma-
138,204
to fngico. A leitura final dos testes de diluio permite zan. Esse tipo de reao cromognica facilita a leitura
identificar a menor concentrao da droga que inibe o cres- visual dos ensaios. Inicialmente, utilizou-se o MTT e o XTT
cimento do microrganismo. No caso da difuso em gar, o para esses testes, posteriormente empregou-se o azul de ala-
mtodo clssico utiliza disco contendo concentrao nica mar onde os resultados foram bastante equivalentes aos ge-
49
do antifngico a ser avaliado.
174 rados pelo mtodo de referncia.
O grande interesse das comunidades mdica e cientfica
pela padronizao de testes de sensibilidade levou, em 1982,
a entidade responsvel pela normalizao de tcnicas de la-
boratrio clnico nos Estados Unidos, o National Commit-
tee for Clinical Laboratory Standarts (NCCLS), designar um
subcomit para padronizar testes de suscetibilidade de fun-
gos e drogas antifngicas. Tendo em vista o predomnio das
leveduras como causa de infeces fngicas, bem como me-
nor complexidade morfolgica, o NCCLS priorizou, numa
49
primeira etapa, as pesquisas envolvendo leveduras. Em
1992, foi padronizado o mtodo da macrodiluio em caldo
para leveduras, realizado seguindo os seguintes parmetros:
meio RPMI 1640 (Roswell Park Memorial Institute) com L-
-glutamina, sem bicarbonato e tamponado com MOPS
(morpholinepropanesulfonic acid) para pH 7,0; densidade
do inculo final de 0,5 a 2,5 x 10 clulas/mL, corrigido atra- FIGURA 2.78. Mtodo MTT: tcnica de microdiluio com indicadores de xido-redu-
vs da espectrofotometria; temperatura de incubao de o para facilitar a interpretao dos resultados. Isolado de Candida
35C durante 48 horas para Candida spp. e 72 horas para albicans. (LAPEMI-UFSM, RS).
Cryptococcus neoformans. A definio do critrio de leitura
de ensaios depende do mtodo utilizado: na tcnica da ma- Os padres do CLSI48 (Clinical and Laboratory Standards
crodiluio em caldo com azlicos e flucitosina aquela ca- Institute, antigo National Committee for Clinical Laboratory
paz de inibir 80% da turbidez presente no tubo, em relao Standards-NCCLS) constituem os mtodos de referncia mais
ao controle positivo. Para os polinicos, a concentrao ini- difundidos e mais utilizados para realizar estudos de correla-
bitria mnima (CIM) foi definida como a menor concentra- 50
o com a clnica. O documento M38-A um dos mtodos
o capaz de inibir qualquer crescimento visvel no ensaio de referncia do CLSI criado com a finalidade de determinar
(NCCLS, 1992). Candida parapsilosis (ATCC 22019) e Can- a suscetibilidade in vitro de fungos filamentosos terapia an-
dida krusei (ATCC 6258) foram selecionados para controle 158
tifngica. M38-A uma norma global desenvolvida, me-
de qualidade para o mtodo padronizado. diante processo consensual do CLSI, para testes de diluio
Apesar da macrodiluio em tubo ter reprodutibilidade, em caldo. Esse documento apresenta a seleo de agentes an-
trata-se de um mtodo laborioso e de difcil execuo em tifngicos, preparao de solues antifngicas padro e di-
laboratrios de rotina. Por essa razo, foram desenvolvidos luies para a realizao de testes e os requisitos de controle
mtodos alternativos macrodiluio em caldo: microdilui- de qualidade para testes de sensibilidade de fungos filamento-
158
o em caldo (CLSI, 202), sistemas colorimtricos e, mais sos que causam infeces fngicas invasivas.
recentemente, o Etest. Diversos trabalhos foram realizados As tcnicas de macro e microdiluio incluem: mtodo
avaliando a equivalncia de resultados obtidos com a macro espectrofotomtrico para a preparao do inculo, RPMI
e microdiluio e permitiram ao CLSI a confeco do docu- com pH 7,0 como meio de cultivo, utilizao de antifngicos
mento M27-A(1997), M27-A2(2002) e M27A3(2008), descre- em forma de p, leitura visual dos tubos ou placas, clculo
157
vendo estas metodologias para fungos leveduriformes. das CIMs por porcentagens de inibio e recomendaes para
50
Aps a padronizao da tcnica de microdiluio, fo- controlar a qualidade dos resultados. O documento focaliza
ram desenvolvidos mtodos colorimtricos nos quais a lei- ainda as condies de teste, incluindo a preparao e o tama-
tura visual facilitada pela utilizao de indicadores de nho do inculo, o tempo e a temperatura de incubao, a for-
oxidorreduo. Esses indicadores promovem uma mudana mulao do meio e os critrios para a determinao da CIM.

Uma das limitaes das tcnicas recomendadas no M

38-A que elas foram estabelecidas utilizando um nmero
limitado de espcies fngicas, portanto, questionvel a sua
aplicabilidade para outros fungos.88 Do mesmo modo, pai-
ram dvidas sobre a confiabilidade e adequao de se em-
pregar um mtodo espectrofotomtrico para preparao do
inculo.65 Por essa razo, tem sido proposto o emprego de
tcnicas de contagem microscpica de condios, que permi-
tam preparar um inculo reproduzvel.10,163,165 Contudo,
sempre recomendvel para realizao de estudos de susce-
tibilidade seguir uma metodologia padronizada (NCCLS,
2002), em instituies sanitrias que os faam rotineira-
mente, utilizando um controle de qualidade estrito.50
Como alternativa aos mtodos de diluio em caldo no
CLSI, tm-se utilizado os mtodos baseados em gar difu-
so. Esses incluem os ensaios tradicionais de disco-difuso
em gar (CLSI, 2004)48 e o Etest.142 O Etest consiste em uma
fita plstica contendo droga em diferentes concentraes ex-
pressas no reverso da fita.49 Uma vez colocada na superfcie
do meio solidificado, a droga contida na fita difunde-se ra- FIGURA 2.80. Mtodo ETEST: tcnica de difuso com informao quantitativa. Isola-
pidamente para o meio, mantendo por longos perodos um do de Microsporum gypseum (LAPEMI-UFSM, RS).
gradiente fixo de concentrao em torno da fita. A difuso
da droga a partir da fita para o gar causa inibio do fungo A microdiluio em caldo (CLSI, M27-A3) ainda o tes-
em caso de suscetibilidade, gerando rea de inibio do cres-
te de maior aceitao internacional, devido ao menor custo e
cimento em formato de elipse. A concentrao inibitria m-
praticidade na execuo. At o momento os nicos sistemas
nima lida como a concentrao da droga expressa na fita
comerciais que apresentam aceitvel equivalncia com esses
exatamente no ponto onde a tira intercepta a elipse de inibi-
mtodos de diluio so o Etest e alguns sistemas colorim-
o de crescimento. O Etest rene a simplicidade dos mto- 49
tricos de microdiluio em caldo.
dos de difuso com informaes quantitativas, como nos
A verdadeira resistncia de dermatfitos aos antimicti-
mtodos de diluio49, podendo ser utilizado para leveduras 97
cos s foi demonstrada em poucas situaes , portanto, esta
(Figura 2.79) e fungos filamentosos (Figura 2.80).
hiptese no deve ser considerada como a mais provvel em
caso de insucesso teraputico. Todas as espcies de dermat-
fitos tm apresentado suscetibilidade similar aos frmacos
atualmente disponveis para uso seguro em animais. A iden-
tificao do dermatfito, embora no seja decisiva para a
escolha do antifngico, essencial para um melhor conheci-
mento da epidemiologia das micoses e adoo de medidas
47
preventivas para evitar novas infeces.
AGRADECIMENTOS
Os autores agradecem a inestimvel colaborao dos se-
guintes profissionais da rea mdica e veterinria, tanto na
elaborao e correo do texto, quanto na cedncia de ilus-
traes.
Selene Dal l Acqua Coutinho (Faculdade de Medicina
Veterinria, UNIP/So Paulo, SP).
David Driemeier (Setor de Patologia Veterinria, FaVet-
-UFRGS, RS).
Flvio Mattos de Oliveira (IPD-Complexo Hospitalar
Santa Casa, Porto Alegre, RS).
FIGURA 2.79. Mtodo ETEST: tcnica de difuso com informao quantitativa. Isola-
Mrcia dos Santos Lazra (Servio de Micologia, Institu-
do de Malassezia pachydermatis. (LAPEMI-UFSM, RS).
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diomicose, de distribuio geogrfica mais restrita e causado-

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ETAPAS DO DIAGNSTICO DOS FUNGOS FILAMENTOSOS

Hifas asseptadas ou com pouco Hifas septadas com dimetro

Crescimento rpido ou lento, textura penugenta,

Estruturas fngicas com Estruturas fngicas

FIGURA 2.1. Etapas do diagnstico dos fungos filamentosos.

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ETAPAS DO DIAGNSTICO DAS LEVEDURAS E FUNGOS LEVEDURIFORMES

Branco Creme/ Rosa Coral Creme/Irregilar

Blastocondios hifas Blastocondios Blastocondios

FIGURA 2.2. Etapas do diagnstico das leveduras e fungos leveduriformes.

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obteno de materiais de origem cutnea e subcutnea. O vo-

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CULTIVO do crescimento de uma variedade de fungos saprbicos devido

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gares Trichophyton amostras humanas demonstrou excelente especificidade e

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Assimilao de fontes de carbono

Assimilao de fontes de nitrognio

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FIGURA 2.18. Malassezia pachydermatis. Presena de blastocondios no exame cito-

Apesar de serem micro-organismos epissaprbios na

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Utilizando a tcnica de amplificao aleatria do poli- CULTIVO

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muito importante o conhecimento da espcie de Can-

FIGURA 2.24. CHROMagar Candida com isolados de C. albicans (verde), C. tropicalis

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SOROLOGIA A maior parte dessas tcnicas ainda est em fase investi-

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Para preparar a montagem microscpica, uma gota do

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Riscos laboratoriais SOROLOGIA

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Um imunoensaio enzimtico tambm pode ser utilizado Macro e micromorfologia

produzveis, todas espcies patognicas eram classificadas

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HISTOPATOLOGIA A citopatologia do exsudato proveniente de leses cut-

EXAME DIRETO CULTIVO

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podem ser repicados em meio gar batata dextrose a 25C. O Hemocultivo

O cultivo do cogulo sanguneo um mtodo alternati-

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FEO-HIFOMICOSES CUTNEAS E SUBCUTNEAS cinza-escura, amarronzada, verde-oliva com bordos claros

As hifas so septadas, ramificadas e escuras. Os conidi-

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Bipolaris sp poros na parede dos conidiforos, so grandes (at 35 mm),

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Um grande nmero de isolados de quadros clnicos que fo-

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Deve-se incubar a 30C e considerar as culturas como nega-