Resumo 1 Prova

1) Introdução a bacteriologia
A. MICROSCOPIA:
COMO É FEITA A COLORAÇÃO DE RECOMENDAÇÕES:

GRAM?
• Depositar o material a ser analisado sob a • Identificação nas placas: sempre na região
lâmina; externa da placa de Petrique contém o ágar;
• Fixar o esfregaço pelo calor; • Lavar as mãos antes e após a aula;
• Cobrir a lâmina com cristal violeta; • Cuidar com as mãos em mucosas durante a
• Lavar com H2O; aula;
• Aplicar o lugol; • Usar o papel toalha com economia.
• Lavar com H20;
• Aplicar o álcool-cetona;
• Lavar com H2O;
• Cobrir com fuscina fanicada ou Safranina;
• Lavar com H2O;
• Examinar ao microscópio.
B. MICROBIOTA HUMANA
Importância da microbiota
Definição: Comunidade total de microbioma (ou microbiota) e biomoléculas associadas.
Disbiose Fatores que desencadeia
• Intestino: dieta, medicamentos ingeridos,
mucosa intestinal, sistema imunológico e a própria
microbiota → consequências: doenças
Alteração geral na composição da microbiota
inflamatórias, distúrbios metabólicos, doenças
autoimunes, distúrbios neurológicos, etc.
• Vaginal: vaginose, candidíase etc.
Microbiota
DISTRIBUIÇÃO E OCORRÊNCIA – AMBIENTES ESTÉREIS
sangue; líquidos cavitários e tecidos profundos
DISTRIBUIÇÃO E OCORRÊNCIA – AMBIENTES NÃO ESTÉREIS
Pele Olhos
• Staphylococcus spp. → S. epidermidis (90%) ➔ LÁGRIMA: contém lisozima destrói parede
e S. aureus (10a40%) bacteriana
• Propionibacteriumacnes ➔ CONJUNTIVA:
• Corynebacteriumspp. • Staphylococcus spp., S. epidermidis
• Cândida spp. • Corynebacterium spp.
• Pityrosporum spp. (Malassezia) • Outros: Moraxella spp., Haemophilus
• Streptococcus spp. parainfluenzae Neisseria não patogênicas
Orelha interna Orelha externa Trato respiratório Trato respiratório
superior interior
Predominam:
Staphylococcusspp.e
Corynebacteriumspp.
S. epidermidis, S.
Staphylococcus spp., BAIXA quantidade de
aureus, S. pneumoniae e
Normalmente livre de Corynebacterium spp. microrganismos
outros alfa-hemolíticos,
bactérias. Propionibacterium
Corynebacterium spp.,
spp.
Moraxella spp.,
Neisseria spp.,
Haemophilus spp. e
Micrococcus spp.
Microbiota
DISTRIBUIÇÃO E OCORRÊNCIA – AMBIENTES NÃO ESTÉREIS
TRATO GASTROINTESTINAL – INTESTINO TRATO GASTROINTESTINAL – INTESTINO GROSSO
DELGADO
DUODENO JEJUNO ÍLEO • Altamente colonizado 1011 MO/g de peso úmido;
aproximadamente Enterococcus Anaeróbios • > 1000 espécies diferentes;
• 300x mais anaeróbios que aeróbios;
1.000 bactérias spp.; Bacteroides
• Anaeróbios:
mL Cocos e lactobacilos, spp.) - BGN (bacteroides (fragilis, melaninogenicus, oralis) e
BGP). corinebactérias anaeróbios fusobacterium.
e C. albicans facultativos - BGP: bifidobacterium, eubacterium, lactobacillus,
(Escherichia clostridium perfringens.
coli) em • Anaeróbios facultativos: BGN Enterobacterales;
• Um adulto excreta aproximadamente 3x1013 (30
grande
trilhões) de células bacterianas diariamente pela defecação.
quantidade
SISTEMA URINÁRIO BOCA
RINS E URETERES BEXIGA • Saliva contém: 10 bactérias/mL;
8
• Normalmente livres - Lactobacillus • Placa dentária: 1011 bactérias/mg;

- Gardnerella • ANTES DOS DENTES: micro-organismos
de microrganismos, anaeróbios facultativos ou aeróbios;
• URETRA - Parte - Streptococcus • APÓS A ERUPÇÃO DOS DENTES: ambiente
Inferior: Staphylococcus - Atopobium favorável aos anaeróbios;
epidermidis e outros • De modo geral: Staphylococcus spp., Streptococcus
Estafilococos coagulase Entre outros spp. Neisseria spp., Bacteroides spp., Actinomyces
spp., Treponema spp., Mycoplasma spp. etc.
Negativa (ECN);
Enterococcus spp. (CGP);
Corynebacterium spp. e
Lactobacillus spp. (BGP);
Neisseria spp. (exceto N.
gonorrhoeae e N.
meningitidis) e BGN
inclusive enterobactérias
como Escherichia coli.
•
SISTEMA GENITAL FEMININO SISTEMA GENITAL MASCULINO
TG SUPERIOR VAGINA • Microbiota variável entre diferentes sujeitos
Baixa quantidade e alta Infância e menopausa • URETRA:
- ECN;
diversidade de micro- - microrganismos - Corynebacteriumspp;
organismos normais da pele e do - Streptococcus alfa e não hemolíticos;
intestino - Neisserias não patogênicas;
ADULTA - Anaeróbios.
Lactobacillus spp.
(Cerca de 80 espécies
diferentes) -
Convertem glicogênio
em ácido láctico (pH =
3,8 a 4,6)
2) Identificação de Cocos Gram Positivos – Estafilococos
➔ Aqui estudamos os Staphylococcus e gêneros relacionados
➔ Hans Christian Gram nasceu em 13-09-1853 em Copenhagen, Dinamarca. Ele era um bacteriologista
dinamarquês conhecido por sua participação no campo do desenvolvimento da coloração de Gram.
➔ Os CGP são identificados por meio de coloração de Gram, na objetiva de 100x, utilizando óleo de
imersão.
➔ Amplamente distribuídos na natureza;
➔ Segundo micro-organismo mais frequentemente isolado de amostras clínicas;
➔ Microbiota de pele e mucosas em seres humanos e animais;
➔ Causadores de variados tipos de infecções;
➔ Streptococcus e a catalase negativa será abordado no próximo conteúdo.
CATALASE POSITIVA CATALASE NEGATIVA ANAERÓBIOS

FAMILIA MICRORGANISMO MICRORGANISMO FAMILIA
Staphylococcaceae Staphylococcus
Rothia Streptococcus
(stomatococcus) Peptpstreptococ
Streptococca
Micrococcus cus
Micrococcaceae ceae
Kocuria
Kytococcus
Planococcus Enterococcus
1. EM QUAIS MEIOS DE CULTURA OS CGPS CRESCEM?
a) AS, AC, MC, CLED e Chapman

b) AS, AC, CLED e Chapman
c) AS, AC, MC, CLED e Manitol
d) Só no AS e AC
e) Só no AS, AC e CLED
2. CRESCIMENTO DE CGP EM MEIO DE CULTURA:
➔ Ágar sangue, ágar chocolate, CLED, Chapman/manitol salgado (estafilococos) e meios cromogênicos.
3. IDENTIFICAÇÃO DE ESTAFILOCOCOS EM MEIOS DE CULTURA:
3.1. Coloração de gram:
➔ A realidade é bem diferente

3.2. CGP – catalase:
✓ Utiliza-se o Peróxido de hidrogênio 3%

POSITIVA NEGATIVA
Para os Staphylococcus a catalase é a POSITIVA e para os Streptococcus a catalase é a NEGATIVA
3.2.1. Provas bioquímicas para CATALASE POSITIVA (+) - STAPHYLOCOCCUS
A. Prova da Bacitracina:
➔ Esta prova se baseia, na inibição do crescimento do micro-organismo frente a uma pequena quantidade
de bacitracina.
➔ O crescimento é feito em meio MHA: Mueller-Hinton ágar, onde é adicionado um disco de infusão de
0,04 U de bacitracina.
RESISTENCIES A BACITRACINA 0,04 U SENSÍVEIS A BACITRACINA 0,04 U
Staphylococcus spp. É sensível quando o halo
Rothia (Stomatococcus)
Micrococcus de inibição ≥ 10 mm →
É resistente quando não há nenhuma zona ou halo não precisa fazer prova
Kocuria
de inibição ≤ 9 mm da coagulase
Kytococcus
precisa fazer prova da coagulase
Planococcus
➔ Padronização de McFarland (tubo 0,5): A escala de McFarland é um

teste de turbidez, feito de
- Tocar em 3-5 colônias e colocar na salina; suspensão de Sulfato de Bário,
- Homogeneizar; que tem por finalidade
- Comparar com o tubo 0,5 (ajustar a turbidez); padronizar a concentração
bacteriana do inóculo a ser
- Colocar o swab no tubo e semear no ágar em várias direções;
utilizado durante o processo
- Colocar o disco com a pinça flambada e fria;
(ex.: realização do
- Dar um toque no disco. antibiograma).
- Incubar.
B. Prova da Coagulase – quando a bactéria é resistente a bacitracina
➔ Finalidade prova da coagulase? Determinar a capacidade de um micro-

organismo em coagular o plasma pela ação da enzima coagulase.
➔ É feita uma mistura da bactéria junto a um Plasma de coelho liofilizado
+ 3mL de salina e alíquota, incuba e espera o resultado para ver se ocorreu ou
não a coagulação do plasma.
➔ Como é feito o processo: Coagulase (em tubo) → coagulase secretada
→ reage → CRF (fator de reação da coagulase) plasma → fibrinogênio → fibrina
→ leitura deve ser feita em 4h ou de 18-24 horas.
Classificação de interesse médico

Estafilococos coagulase Estafilococos coagulase negativa Estafilococos coagulase negativa
positiva novobiocina sensível (ECNS) novobiocina resistente (ECNR)
- S. aureus – S. epidermidis – S. saprophyticus
- S. aureus subsp. – S. capitis – S. cohnii
anaerobius – S. warneri – S. xylosus
- S. intermedius – S. haemolyticus – S. simulans
- S. hyicus – S. hominis
- S. delphini – S. lugdunensis
- S. chromogenes – S. auricularis
- S. schleiferi subsp. – S. sciuri
Coagulans.
PROVA DA COAGULASE
POSITIVA NEGATIVA
S. aureus, S. lutrae, S. intermedius, S. hyicus, S.
Staphylococcus coagulase negativa
delphini e S. schleiferi.
CALDO VOGES – PROSKAUER (VP – 48h) NOVOBIOCINA (5 µg)
Positiva Negativa Sensível Resistente
S. aureus ou S. S. lutrae, S. intermedius, Halo > 16 mm Halo ≤ 16 mm e média
schleiferi S. hyicus e S. delphini de 6 a 12 mm
Maltose / manitol Polimixina B Estafilococos coagulase Estafilococos
(aerobicamente - fermentação) (300U) negativa coagulase negativa
novobiocina sensível novobiocina resistente
Positiva Negativa Resistente Sensível
(ECNS) (ECNR)
Realizar provas do esquema S. saprophyticus
S.
S. aureus S. schleiferi S. hyicus de fermentação de açucares e outros estafilococos
intermedius
(esquema da apostila)
Alguns conceitos:
1) Prova com caldo Voges – proskauer (VP):
➔ Determina a habilidade de um micro-organismo em produzir acetoína a partir da

fermentação da glicose.
➔ Processo: dispersar uma colônia da bactéria no tubo e incubar de 48-72h, a 35ºC, para
que ocorra a fermentação glicose, se transformando em ácido pirúvico, depois em acetoína
→ adicionar algumas gotas de diacetila (KOH 40% + o2 + α-naftol) → se VP der positivo →
forma um complexo de cor vermelha no topo do caldo.
2) Prova da maltose e manitol:

Maltose Manitol
➔ Ágar maltose: tocar em uma colônia, fazer ➔ Ágar maltose: tocar na colônia (inóculo
um risco (com alça) no centro do ágar e incubar. pesado) com agulha e fazer uma picada central no
➔ Determina a habilidade de um micro- tubo.
organismo em utilizar a maltose. ➔ Determina a habilidade de um micro-
➔ POSITIVO = Halo amarelo ao redor do organismo em degradar o manitol
crescimento bacteriano. ➔ POSITIVO = Halo amarelo na parte
superior do tubo
4. GENERALIDADES DO STAPHYLOCOCCUS:
➔ Microbiota da pele e mucosas de mamíferos e pássaros

➔ Agentes de várias infecções cutâneas, sistêmicas, oportunistas e urinárias
➔ Produzem várias toxinas
➔ Staphylococcus aureus (mais virulento)
➔ Problema hospitalar resistência a antimicrobianos - M.R.S.A.
➔ Crescem bem em meios com 7,5% NaCl (até 10%) → Pesquisa de portador de M.R.S.A. meio: ágar
manitol salgado.
➔ Apresentam 45 espécies (Manual of Clinical Microbiology, 2015) → 17 espécies importantes em
humanos.
4.1. FATORES DE VIRULÊNCIA
4.2. FATORES PREDISPÔNENTES A DOENÇAS

4.3. QUADROS CLÍNICOS:
4.4. ALGUMAS DOENÇAS CAUSADA PELO Staphylococcus aureus:
➔ Foliculite;
➔ Furúnculo: nódulos elevados e dolorosos de tecido morto.
➔ Abscesso;
➔ Síndrome da pele escaldada: causado por bactérias produtoras da toxina esfoliativas (A e B),
atividade proteolítica na epiderme (dissolvem a matriz mucopolissacarídica da epiderme), abrupto surgimento
de eritema perioral local, estende para todo o corpo (em 2 dias), formação bolhosa (sem bactérias) e
descamação do epitélio, aparecimento de Acs protetores, recuperação do epitélio em 7 a 10 dias, sem
cicatrizes;
➔ Impetigo bolhoso: forma localizada da Síndrome da pele escaldada, altamente transmissível entre as
crianças, atinge principalmente lactentes e crianças de pouca idade, as vesículas contém bactérias.
➔ Impetigo pustular: acomete face e membros, causa mancha avermelhada e achatada, pústulas e
crostas.
➔ Síndrome do choque tóxico: infecção fatal com envolvimento cutâneo e tecidos moles, causada por
Estafilococos produtores de TSST-1, pode surgir após complicação de abscessos estafilocócicos, osteomielite,
infecções de ferida cirúrgica, etc., pode surgir após uso de absorventes interno, pode gerar febre, hipotensão,
rash eritematoso difuso, vertigem ortostática, vômito, diarréia, insuficiência renal, cefaléia, conjuntivite,
faringite, envolvimento de múltiplos órgãos e mortalidade alta.
➔ Intoxicação alimentar: alimento contaminado com a toxina (carnes processadas, presunto, porco
salgado, salada de batatas, sorvetes), transmitida pelo manipulador de alimentos, aquecimento posterior do
alimento irá eliminar a bactéria, mas não a toxina, início abrupto (4 horas) e desaparecem dentro de 24 h
(tratamento de suporte).
4.5. Família Micrococcaceae

➔ Exemplos: Rothia spp., R. (Stomatococcus) mucilaginosa, R. aeria, R. nasimurium e R. amarae;
➔ Características: cocobacilos, comensal da orofaringe e TRS, anaeróbio facultativo, catalase
fracamente +, reportado como agente infeccioso em imunocomprometidos.
➔ Manifestações clínicas: endocardite, septicemia, infecções relacionadas a cateteres.
Micrococcus spp. Planococcus spp.
➔ Aeróbio estrito; ➔ Encontrados em ambientes marinhos;
➔ Colônias amarelas ou vermelhas; ➔ Tolerante ao NaCl;
➔ Não crescem em alta concentração de sal; ➔ Não relacionados a infecções humanas.
➔ Encontrados no meio ambiente e como
microbiota de humanos e outros mamíferos;
➔ Infecções oportunistas;
➔ Cuidado na interpretação de seu isolamento
em meios de cultivo (avaliação clínica, repetir
cultura, rever procedimento de coleta, etc.)
5. GENERALIDADES DO Estafilococos coagulase-negativa (ECN):
➔ Antigamente considerados como contaminantes;

➔ Geralmente infecções nosocomiais;
➔ Pacientes imunocomprometidos;
➔ Procedimentos invasivos, dispositivos (biofilme em catéteres, próteses, válvulas, derivações de
hemodiálise, etc.);
➔ Exemplos: S. epidermidis, S. warneri, S. haemolyticus, S. hominis, S. lugdunensis, S. auricularis, S.
sciuri, S. cohnii, S. xylosus, S. saprophyticus.
3) Identificação de CGP – Estreptococos e enterococos
➔ Tanto os Streptococcus spp. quanto os Enterococcus spp. possuem catalase NEGATIVA!!
1. CARACTERISTICAS DO STREPTOCOCCUS SPP.
➔ CGP – catalase negativa;

➔ São anaeróbios facultativos;
➔ Alguns requerem 5 % de CO2 para crescer;
➔ A maioria exige meios de cultura enriquecidos com sangue e soro para crescer;
➔ Habitat natural: Geralmente encontrado na microbiota normal em humanos e animais. São
colonizadores transitórios da pele e residentes de mucosas. Mesmo as espécies mais virulentas fazem parte da
microbiota.
➔ Nome da doença: estreptocócica.
2. GRUPOS PERTENCENTES AOS ENTEROCOCOS E ESTREPTOCOCOS
α-hemolítico
Grupo Mits Grupo Viridans
➔ Principal representante: Streptococcus ➔ Variedade de infecções: cárie dental,
pneumoniae. endocardite e infecções intra-abdominais
➔ CGP encapsulado; ➔ Microbiota normal de: orofaringe, trato
➔ Possui cerca de 92 sorotipos (classificados de gastrointestinal e trato genitourinário.
acordo com o antígeno capsular); ➔ Principais representantes: S. anginosus
➔ Crescem em meios enriquecidos com sangue (Trato urogenital e TGI), S. constellatus (Trato
➔ Necessitam de CO 2 para crescer. respiratório) e S. intermedius (abscessos de
➔ Atingem órgãos como cérebro, ouvido e cérebro e fígado).
principalmente pulmão.
β-hemolítico
ESTREPTOCOCOS DO GRUPO A ESTREPTOCOCOS DO GRUPO B
➔ Principal representante: Streptococcus ➔ Principal representante: Streptococcus
pyogenes agalactiae – também faz parte do grupo γ.
➔ Doenças: faringite; escarlatina (paciente pode ➔ Coloniza o trato gastrintestinal (TGI) e
avançar para um quadro de língua em “framboesa” e trato gênitourinário.
descamação cutânea); Piodermite (impetigo); ➔ Doença neonatal: causa sepse,
Erisipela; Faciite necrosante; pneumonia, meningite
➔ Sequelas: febre reumática (sequela mais grave ➔ Faz parte do grupo β-hemolítico e γ-
estreptocócica, pois frequentemente resulta em lesões hemolítico.
do miocárdio e válvulas cardíacas) e Glomerulonefrite.
γ-hemolítico
ENTEROCOCCUS
➔ Principais representantes: E. faecalis (parece um “terço) e E. faecium.
➔ Enterococos: “cocos entéricos” (TGI)
➔ Previamente classificados como estreptococos do grupo D.
➔ São encontrados no solo, fezes, alimentos, água, e no ambiente em geral
➔ Microbiota do TGI - Espécies mais comuns: E. faecalis e E. faecium
3. PROVAS BIOQUÍMICAS PARA OS GRUPOS α, β e γ – HEMOLÍTICO PARA CATALASE (-):
α-HEMOLÍTICO
OPTOQUINA BILE SOLUBILIDADE

Determinar a sensibilidade de um micro Capacidade da bactéria em produzir
organismo a Optoquina lise em presença de sais biliares
AMBOS OS TESTES PODEM DAR RESULTADO

RESISTENTE SENSÍVEL
Se for resistente, deve-se realizar mais um teste: Significa que a bactéria que se trata a amostra é:
Bile Esculina – 24 - 48 h S. pneumoniae
β-HEMOLÍTICO
BACITRACINA
Prova empregada para diferenciar o gênero Staphylococcus dos gêneros Micrococcus e Stomatococcus,
além de diferenciar estreptococos do grupo A de outros β-hemolíticos
RESISTENTE SENSÍVEL
Se for resistente, deve-se realizar seguintes testes: Se for sensível, deve-se realizar o teste com:
➔ Camp-Teste: a atividade hemolítica da beta ➔ Sulfazotrim (SUT): separar presuntivamente
lisina estafilocócica sobre os eritrócitos é os estreptococos dos grupos A e B, dos estreptococos
intensificada por um fator extracelular, produzido β-hemolíticos pertencentes aos outros grupos.
por estreptococos do grupo B, denominado fator
CAMP. Se positivo: hemólise em ponta de seta.
➔ Hipurato: Capacidade de hidrolisar o
Hipurato de sódio Revelar com 200 µL de
Ninhidrina. Se positivo: anel roxo.
NEGATIVO POSITIVO SENSÍVEL RESISTENTE

Realizar o teste do: Camp teste
Positivo Negativo
Realizar o teste da Estreptococo Realizar
Estreptococos Grupo B Realizar teste
Bile Esculina (24 - Grupo teste
(S.agalactiae) Hipurato
48h) C ou G PYR (+)
S. Estreptococos Grupo B
pyogenes (S. agalactiae)
Obs: tem que ter VP (+)
γ-HEMOLÍTICO
BILE ESCULINA
Habilidade de hidrolisar a esculina em esculetina e glicose, em presença de bile.
Se positivo: coloração negra
POSITIVO NEGATIVO
Realizar o teste MTS
Crescimento em presença de alta concentração de sal. Realizar o teste CAMP-TESTE e Hipurato
Se positivo: Turvação com ou sem viragem de pH
POSITIVO NEGATIVO NEGATIVO POSITIVO
α-hemólise:
Estreptococos Grupo
Viridans
β-hemólise:
Estreptococos Grupo Estreptococos β-
Viridans e Estreptococos hemolítico não Grupo A, Estreptococos
Enterococcus spp. Grupo D B ou D. Grupo B
Tem que ter PYR (+).
(S.bovis confirmar c/ γ-hemólise: (S. agalactiae)
provas específicas) Estreptococos γ
hemolítico não Grupo D
Abiotrophia;
Globicatella;
Leuconostoc
γ-HEMOLÍTICO
OUTRAS PROVAS BIOQUÍMICAS
MOTILIDADE MBE (6 AÇUCARES) ARGININA TELURINO
Habilidade de fermentar
o carboidrato e acidificar Enterococcus faecalis
Hidrólise da arginina
o meio se positivo fica cresce formando
amarelo. colônias pretas
Deve-se colocar óleo
Verificar se as bactérias
mineral para manter
são móveis • Açucares: sorbitol, Se positivo:
ambiente sem O2
sacarose, adonitol, colônias pretas
arabinose, rafinose,
Se positivo: roxo
manitol.
4. SEMEADURA PARA A AULA

➢ Optoquina, Bacitracina E Sulfazotrim: ➢ CAMP-TESTE (alça)
➔ Semear um S aureus no centro do AS;
➔ Tocar em 3 5 colônias e colocar na salina e ➔ Semear o estreptococo β-hemolítico
semear (com a alça no ágar sangue em várias perpendicular ao S. aureus.
direções;
➔ Colocar o disco com a pinça flambada e fria;
➔ Dar um toque no disco
➔ Incubar 24 h
➢ Hipurato: dispersar colônias da bactéria no tubo (incubar 2 h);

➢ Bile esculina: tocar em uma colônia, fazer estrias;
➢ MTS: dispersar colônias da bactéria no tubo;
➢ Motilidade: tocar na colônia com agulha e fazer uma picada central no tubo;
➢ MBE: dispersar uma colônia da bactéria no tubo e colocar os açúcares em cada tubo;
➢ Arginina: dispersar colônias da bactéria no tubo e no tubo controle, pingar 6 gotas de óleo mineral;
➢ Telurito: tocar na colônia com alça e fazer uma picada central no tubo;
➢ Pigmento: Passar swab em um ágar (MHA) com enterococos após 24h de incubação e observar a cor;
5. CONCEITOS DAS PROVAS BIOQUÍMICAS PARA AULA
PROVA BIOQUÍMICA DEFINIÇÃO IMAGEM E RESULTADO
Determinar a sensibilidade de um
OPTOQUINA
micro-organismo a Optoquina
Capacidade da bactéria em produzir

BILE SOLUBILIDADE
lise em presença de sais biliares
Habilidade de hidrolisar a esculina

em esculetina e glicose, em presença
BILE ESCULINA
de bile.
Se positivo: coloração negra
Prova empregada para diferenciar o
gênero Staphylococcus dos gêneros
BACITRACINA Micrococcus e Stomatococcus, além
de diferenciar estreptococos do
grupo A de outros β-hemolíticos
A atividade hemolítica da beta lisina

estafilocócica sobre os eritrócitos é
intensificada por um fator
extracelular, produzido por
CAMP-TESTE estreptococos do grupo B,
denominado fator CAMP.
Se positivo: hemólise em
ponta de seta.
separar presuntivamente os
estreptococos dos grupos A e B, dos
SULFAZOTRIM
estreptococos β-hemolíticos
pertencentes aos outros grupos.
Capacidade de hidrolisar o Hipurato

de sódio Revelar com 200 µL de
HIPURATO
Ninhidrina.
Se positivo: anel roxo.
Determina a presença de enzima

PYRase.
PYP Desenvolvimento de uma coloração
vermelha S. pyogenes e Enterococos
possuem a enzima.
Crescimento em presença de alta

concentração de sal.
MTS
Se positivo: Turvação com ou sem
viragem de pH.
MOTILIDADE Verifica se a bactéria é móvel
Hidrólise da arginina
Deve-se colocar óleo mineral para
ARGININA
evitar o contato com O2.
Se positivo: roxo
Enterococcus faecalis cresce

TELURINO formando colônias pretas
Se positivo: colônias pretas
PIGMENTO Passar swab em um ágar ( com enterococos após 24 h de incubação e observar a cor)
Habilidade de fermentar o
carboidrato e acidificar o meio.
Prova dos 6 açucares: sorbitol,

MTS
sacarose, adonitol, arabinose,
rafinose e manitol
Se positivo: amarelo
6. COMO REPORTAR:
➔ Streptococcus pneumoniae
➔ Estreptococos do grupo Viridans
➔ Streptococcus agalactiae
➔ Streptococcus pyogenes
➔ Enterococcus faecalis
➔ Enterococcus faecium
➔ Enterococcus gallinarum
7. PARTE DA APOSTILA QUE CORRESPONDE AO CONTEÚDO DE CGP:
UNIDADE 6 - IDENTIFICAÇÃO DE COCOS GRAM POSITIVOS
Os cocos Gram positivos (CGP) estão disseminados na natureza e podem ser isolados do ambiente ou
como habitantes comensais da pele, das mucosas e de outras partes do corpo dos seres humanos e animais. A
ubiquidade dessas bactérias na natureza dificulta, em certas ocasiões, a interpretação de seu isolamento de
amostras de pacientes, a não ser que existam manifestações clínicas aparentes de processo infeccioso. O
isolamento desses microrganismos a partir de amostras deve ser sempre correlacionado com o quadro clínico
do paciente antes que se possa estabelecer o seu papel no processo infeccioso.
A maioria dos cocos Gram positivos, recuperados de culturas aeróbias podem ser diferenciados com
as provas bioquímicas apresentadas nos fluxogramas 01 e 02. Desta forma, para facilitar a identificação dos
principais cocos Gram positivos aeróbios envolvidos em infecções humanas, podemos didaticamente dividi-
los em: catalase positiva, representados principalmente pelos Staphylococcus spp. e, em catalase negativa,
representados principalmente pelos Streptococcus spp. e Enterococcus spp.
PROVA DA CATALASE
Teste rápido em lâmina a temperatura ambiente.
PRINCÍPIO: Verificar a presença da enzima catalase.
BIOQUÍMICA ENVOLVIDA:
A enzima catalase está presente na grande maioria das bactérias aeróbias ou anaeróbias facultativas,
que contém o complexo citocromo. Usualmente, os microrganismos que não contém citocromos também não
possuem catalase. Grande parte das bactérias anaeróbias possuem peroxidase em vez de catalase. Na
decomposição da molécula de água oxigenada “in vitro”, uma molécula atua como substrato reduzido e a outra
como um doador. O substrato reduzido pelos átomos de hidrogênio cedidos pelo doador dá como resultado
um substrato reduzido (H20) e um doador oxidado (gás).
H2O2 + H2O2 → 2 H2O + O2
REATIVO EMPREGADO:
Peróxido de hidrogênio 3%
Conservar em geladeira a 4ºC.
TÉCNICA:
Com a alça ou agulha de semeadura bacteriológica depositar uma porção de um cultivo bacteriano
puro no centro de uma lâmina limpa e desengordurada. Adicionar uma gota de água oxigenada a 3%. “Não
inverter a ordem e não agitar”.
LEITURA:
POSITIVO: Formação imediata de bolhas de gás.

NEGATIVO: Ausência de bolhas de gás.
NOTA: Preferivelmente não utilizar cultivos provenientes de ágar sangue.
BACITRACINA (0,04 U)
PRINCÍPIO: Prova empregada para diferenciar o gênero Staphylococcus dos gêneros Micrococcus e
Stomatococcus, além de diferenciar estreptococos do grupo A de outros -hemolíticos.
Esta prova se baseia, na inibição do crescimento do microrganismo frente a uma pequena quantidade
de bacitracina. Observa-se ao redor do disco contendo bacitracina, uma zona de inibição de crescimento.
TÉCNICA DE SEMEADURA :
Para Estreptococo:
1) Com o auxílio de uma alça, colher três ou quatro colônias isoladas de estreptococos -hemolíticos
e semear numa placa de ágar sangue, de forma homogênea, a bactéria em identificação de maneira a formar
uma área retangular (2cm de largura e 4cm de comprimento aproximadamente).
2) Com o auxílio de uma pinça estéril colocar um disco de bacitracina no centro da semeadura.
Comprimir o disco suavemente. Incubar a 35ºC por 18 - 24 horas.
Para Estafilococo:
1) Preparar uma suspensão do microrganismo a ser testado em salina, que deve ser equivalente a um
padrão de turvação 0,5 de McFarland;
2) Com um swab, espalhe a suspensão do microrganismo em uma placa de ágar sangue;
3) Coloque de forma asséptica um disco de bacitracina no centro da área de inoculada e dê uma leve
batida no disco para ele aderir à superfície do Agar;
4) Incube a placa em estufa a 35 ºC por 18 a 24 horas.
LEITURA:
SENSÍVEL: Considerar qualquer halo de inibição de crescimento como sensível.

RESISTENTE: Ausência de halo de inibição de crescimento.
COAGULASE
PRINCÍPIO: Determinar a capacidade de um microrganismo em coagular o plasma pela ação da enzima

coagulase.
REATIVOS:
Recomenda-se, de preferência, utilizar plasma de coelho com EDTA (disponível comercialmente em

forma liofilizada), podendo ser substituído por plasma de cavalo, carneiro, bovino ou humano.
TÉCNICA DE SEMEADURA:
1) Semear por dispersão 1 a 3 colônias (de uma cultura pura) em caldo BHI e incubar em estufa a 37ºC
por 4 a 6 horas;
2) Transferir 0,1 mL do cultivo em caldo BHI em um tubo de ensaio contendo 0,5 mL de plasma de
coleho reconstituído;
3) Homogeneizar (não agitar);
4) Incubar por estufa a 37ºC por 4 horas e verificar a formação de coágulo, inclinando levemente o
tubo de ensaio;
5) Se não houver formação de coágulo em 4 horas, incubar por 24 horas.
Coagulase
Plasma coágulo de fibrina
bacteriana
Alguns autores sugerem que a coagulase é uma substância semelhante a protrombina que reage com
os fatores plasmáticos normais para formar uma substância semelhante a trombina que por sua vez ativa o
fibrinogênio para formar a fibrina.
Obs.: Um método alternativo é a emulsificação dessa mesma colônia suspeita em 0,5mL de plasma e incubado
da mesma forma.
LEITURA:
POSITIVO: Forma um coágulo ou filamentos de fibrina definidos.

- Completa: o coágulo abrange todo o plasma no tubo.
- Parcial: o coágulo não se estende por todo o plasma no tubo.
Qualquer grau de coagulação se considera positivo.
NEGATIVO: Não há formação de coágulo. A suspensão se mantém homogênea
VP (Voges Proskauer)
PRINCÍPIO: Determinar a habilidade de um certo moicrorganismo em produzir um composto neutro, o

acetil-metil-carbinol (acetoína) a partir da fermentação da glicose.
FÓRMULA - VM/VP (Clark e Lubs)

Peptona......................7g
Glicose.......................5g
Fosfato dipotássico....5g
Água destilada............1000mL
pH final = 6,9
Preparo: Preparar o meio conforme as instruções do fabricante. Distribuir 5mL em tubos de 13x100mm.
Autoclavar a 121ºC por 15 minutos.
Reagentes Empregados (reativos de Barrit):
1. Solução alcoólica de alfa-naftol a 5%: dissolver 5g de alfa-naftol em 80 mL de álcool etílico

absoluto, transferir para um balão volumétriico e completar o volume para 100 mL com álcool etílico absoluto.
2. Solução de hidróxido de potássio a 40%: pesar 40g de hidróxido de potássio e dissolver em

aproximadamente 80mL de água destilada, aquecer se necessário. Passar para um balão volumétrico de 100mL
e completar o volume com água destilada. Manter os reagentes em geladeira (4ºC).
Leitura e Interpretação:
1) Semear por dispersão 1 a 3 colônias (de uma cultura pura) em um tubo de meio VP e incubar em
estufa a 35ºC por 24 horas;
2) Transferir uma alíquota de 1 mL deste meio em um tubo de ensaio estéril;
3) Adicionar 0,6 mL da solução alcoólica de -naftol;
4) Adicionar 0,2 mL da solução de hidróxido de potássio a 40% (É essencial que os meios sejam
adicionados nesta ordem);
5) Homogenizar e deixar o tubo destampado (para maior oxigenação do meio), à temperatura ambiente,
por 10 a 15 minutos;
O teste não deverá ser lido além de 1 hora após a revelação, já que mesmo em testes negativos poderá
aparecer uma cor acobreada que dificultará a interpretação. Se negativo nas primeiras 24 horas, reincubar o
restante do meio por mais 24 horas e repetir a revelação (principalmente em caso de CGP).
POSITIVO: desenvolvimento de uma coloração vermelha na superfície do meio (acetoína presente).
NEGATIVO: desenvolvimento de uma coloração amarela ou acobreada na superfície do meio (cor dos
reativos).
O teste de VP está baseado na detecção do acetil-metil-carbinol (acetoína), um produto neutro,

derivado do metabolismo da glicose.
O ácido pirúvico, o principal metabólito formado pela degradação da glicose é posteriormente
metabolizado por diversas vias metabólicas diferentes, dependendo do sistema enzimático das diferentes
bactérias. Uma destas vias resulta na produção de acetoína. Algumas enterobactérias e determinados cocos
Gram positivos produzem acetoína como principal produto do metabolismo da glicose e formam pequenas
quantidades de ácidos mistos. Na presença de oxigênio atmosférico e KOH 40% a acetoína é convertida em
diacetila. Este composto liga-se ao grupo guanidínico da arginina, presente no meio de cultura e através de
uma reação de condensação, catalisada pelo alfa-naftol, dá origem a um composto de cor vermelha.
MANITOL AERÓBIO E ANAERÓBIO
PRINCÍPIO: Determinar a habilidade de um microrganismo em degradar o manitol.
FÓRMULA
Extrato de carne 0,25g
Proteose peptona 2,50g
NaCl 1,25g
Água destilada 232,0mL
Púrpura de bromocresol 0,005g ou 7,8mL de solução a 0,2%
Ága-ágar 3,75g
TÉCNICA DE PREPARO:
Preparar o meio de acordo com as instruções do fabricante. Após autoclavado a 121ºC, durante 15
minutos e resfriado a uma temperatura de aproximadamente 50ºC adicionar assepticamente 10 mL de uma
solução de Manitol 25% previamente esterilizada por filtração. Envasar assepticamente em tubos 13 x 100
mm.
Semear por picada profunda, com auxílio de uma agulha de semeadura bacteriológica, dois tubos
contendo o meio. Após, adicionar de 10 - 15 gotas de vaselina líquida estéril em um dos tubos. Incubar a 35ºC,
por 48 - 72 horas.
LEITURA:
POSITIVO: Desenvolvimento de cor amarela no meio de cultivo.
NEGATIVO: Não alteração da cor do meio.
MALTOSE
PRINCÍPIO: Determinar a habilidade de um microrganismo em utilizar a maltose.
FÓRMULA
Extrato de carne 0,25g

Proteose peptona 2,25g
NaCl 1,25g
Água destilada 232,0mL
Púrpura de bromocresol 0,005g ou 7,8mL de solução a 0,2%
Ágar-ágar 3,75g
Preparar o meio de acordo com as instruções do fabricante. Após autoclavado a 121ºC, durante 15
minutos e resfriado a uma temperatura de aproximadamente 50ºC adicionar assepticamente 10 mL de uma
solução de Maltose 25% previamente esterilizada. Envasar assepticamente em placas.
Semear por estrias superficiais com auxílio de uma alça bacteriológica.

Incubar a 35ºC por 24 -72 horas.
LEITURA:
POSITIVO: Desenvolvimento de halo de coloração amarela ao redor do crescimento bacteriano.

VARIÁVEL: Não visualização de halo de coloração amarela na parte superior do ágar, mas ocorre o
aparecimento de halo amarelo na parte inferior do ágar.
NEGATIVO: Sem desenvolvimento de halo de coloração amarela ao redor do crescimento bacteriano.
RESISTÊNCIA À POLIMIXINA B(300U)
PRINCÍPIO: Teste utilizado para distinguir várias espécies de estafilococos de importância clínica.
Fazer uma suspensão bacteriana e padronizar a turbidez com a escala de Mc Farland (0,5). Semear
com cotonete em ágar sangue ou Mueller Hinton Agar, de forma bem homogênea. Colocar assepticamente
um disco de Polimixina B (300U). Incubar a 35ºC por 16 - 24 horas.
LEITURA:
RESISTENTE: zona de inibição de crescimento < 10mm

SENSÍVEL: zona de inibição de crescimento ≥ 10mm
RESISTÊNCIA A NOVOBIOCINA (5 µg)
PRINCÍPIO: Teste utilizado para distinguir cocos resistentes à novobiocina, como S. saprophyticus, S.
xylosus, S. cohnii, etc. de outros sensíveis como por ex. S epidermidis.
Fazer uma suspensão bacteriana e padronizar a turbidez com a escala de Mc Farland (0,5). Semear
com cotonete em ágar sangue ou Mueller Hinton Ágar de forma bem homogênea. Colocar assepticamente um
disco de Novobiocina 5 g. Incubar a 35ºC por 16 - 24 horas.
LEITURA:
RESISTENTE: Zona de inibição de crescimento ≤ 16 mm.

SENSÍVEL: Zona de inibição de crescimento > 16 mm.
PROVA DA HEMÓLISE EM ÁGAR SANGUE
Semear a colônia, que se quer pesquisar o comportamento quanto à capacidade de produzir lise das
hemácias, em meio de Ágar Sangue (5% de sangue de carneiro) com o auxílio de uma alça ou agulha
bacteriológica estéril. Incubar a 35 - 37º C por 18 - 24 horas.
Verificar a presença ou não de halo transparente ou esverdeado ao redor das colônias.
OBS: Fazer “STABS” com a alça bacteriológica
LEITURA:
Ausência de halo → γ-hemolítico

Presença de halo transparente → β-hemolítico
Presença de halo esverdeado → α-hemolítico
OPTOQUINA (5 µg)
PRINCÍPIO: Determinar a sensibilidade de um microrganismo a Optoquina.
Colônias suspeitas (com alfa-hemólise e centro em depressão) são estriadas em ágar sangue e um disco
de Optoquina 5µg é colocado assepticamente no centro da semeadura. A placa deve ser incubada por 18 - 24
horas a 35ºC em atmosfera de 5 - 10% de CO2.
Os pneumococos apresentam maior fragilidade de membrana celular. O cloridrato de etilhidrocupreina

produz lise nos pneumococos, ao passo que outros estreptococos são geralmente resistentes à uma
concentração maior que 1:500.000.
LEITURA:
SENSÍVEL: Presença de zona de inibição de crescimento ≥ 15 mm.

RESISTENTE: Se ocorrer zona de inibição ≤ 14 mm ou inexistência de inibição.
Obs.: A interpretação da zona de inibição pode variar com o fabricante.
BILE SOLUBILIDADE
PRINCÍPIO: Teste empregado para observar a capacidade das células bacterianas em produzir lise em
presença de sais biliares em um tempo e temperatura específicos. Útil na identificação presuntiva de
pneumococo, preferencialmente em associação com o teste da Optoquina.
PROCEDIMENTO (Com enriquecimento):
A partir de um crescimento em ágar sangue, semear 3 a 4 colônias em caldo Todd-Hewit ou caldo

tripticase-soja (TSB), incubando de um dia para o outro. Após crescimento, transferir 0,5 mL para 2 tubos
estéreis 13 x 100 mm, adicionando em seguida 1 a 2 gotas de vermelho de fenol (0,02%) e ajustando o pH na
faixa de 7 com NaOH 1N. Adicionar, em seguida, 0,5 mL de solução de desoxicolato de sódio a 10% em um
dos tubos e 0,5 mL de salina a 0,85% no outro tubo. Incubar a 35ºC e examinar de meia em meia hora no
período de 2 horas, pois este efeito pode ser quase imediato ou não. A maioria das reações positivas ocorre
dentro de 10 minutos.
O teste será considerado positivo quando houver lise ou solubilidade dos microrganismos no tubo
contendo desoxicolato de sódio. O tubo controle, com salina, permanecerá turvo.
PROCEDIMENTO (Direto da colônia bacteriana):
• Fazer uma suspensão da bactéria em 2 mL de solução fisiológica estéril na escala 1 de McFarland;

• Dividir a suspensão colocando 1 mL em outro tubo estéril;
• Em um dos tubos adicionar 1 mL da solução de desoxicolato de sódio a 10% e no outro tubo 1 mL
de solução fisiológica estéril;
• Incubar os 2 tubos a 35 ºC e examinar a cada 30 minutos durante 2 horas.
BIQUÍMICA ENVOLVIDA:
O Streptococcus pneumoniae produz uma enzima intracelular autolítica que faz com que o
microrganismo sofra uma rápida autólise quando é cultivado em meios artificiais. Alguns autores afirmam
que o papel dos sais biliares é acelerar o processo autolítico natural. Os ácidos biliares combinam com as
células pneumococicas e as alteram de maneira que a enzima autolítica é ativada.
INTERPRETAÇÃO:
Positivo: o tubo contendo a solução de desoxicolato aparece límpido e o tubo com a solução fisiológica
permanece turvo.
Negativo: os dois tubos permanecem turvos.
CAMP-TEST
PRINCÍPIO: Este teste é utilizado para identificar presuntivamente os estreptococos do Grupo B (S.
agalactiae).
A atividade hemolítica da beta lisina estafilocócica sobre os eritrócitos é intensificada por um fator
extracelular, produzido por estreptococos do grupo B, denominado fator CAMP. Sempre que os dois reagentes
se superpõem em uma placa de ágar sangue de carneiro, ocorre uma intensificação da reação beta-hemolítica.
Este teste é realizado semeando-se, em meio de ágar sangue de carneiro, a amostra de estreptococo a
ser testada, perpendicularmente a uma amostra de Staphylococcus aureus produtora de beta lisina. As duas
estrias de semeadura devem ficar bem próximas, porém sem se tocarem. As placas inoculadas devem ser
incubadas em atmosfera ambiente a 35ºC por 18 -24 horas.
LEITURA:
POSITIVA: Ocorre a formação de uma área de hemólise típica em forma de ponta de seta ou meia lua na
junção dos dois microrganismos.
NEGATIVA: Ausência da hemólise típica em forma de ponta de seta ou meia lua.
HIDRÓLISE DO HIPURATO DE SÓDIO
PRINCÍPIO: Este teste é utilizado para identificação presuntiva dos estreptococos do grupo B.
Os estreptococos pertencentes ao grupo B são capazes de hidrolisar o Hipurato de sódio enquanto as

amostras pertencentes aos grupos A,C,G e F não têm esta propriedade. Entretanto, algumas amostras de
estreptococos do grupo D também podem levar a uma reação positiva deste teste.
PROCEDIMENTO:
-Pipetar 0,5 mL da solução de Hipurato de sódio em um tubo 13x100mm com tampa de rosca.
-Semear uma alçada cheia de colônias no tubo contendo a solução de Hipurato de sódio.
-Incubar em estufa a 35 ºC por 2 horas.
-Após a incubação, adicionar 0,2 mL da solução de ninhidrina a 3,5 %, sem agitar, e incubar a 35 ºC
por 5 a 10 min.
INTERPRETAÇÃO:
Cor original da solução: incolor

Positivo: desenvolvimento de anel roxo-escuro na superfície da solução dentro de 5 a 10 minutos após a adição
da solução de ninhidrina.
Negativo: a solução permanece inalterada após a adição da solução de ninhidrina.
PYR
PRINCÍPIO: Determinar a presença de enzima PYRase. O Streptococcus pyogenes e Enterococcus spp.

apresentam esta enzima.
Baseia-se na ação da enzima PYRase (Pyrrolidonyl aminopeptidase) sobre o substrato L-pirrolidonil-

β-naftilamida com formação de β-naphthylamina livre. A reação é revelada pela adição do reagente N,N,
dimetil aminocinamaldeído que formará um produto de cor avermelhada.
Método rápido: Semear a bactéria, em “spot”, em um papel de filtro impregnado com o substrato da
enzima, previamente umedecido com água destilada (10 L). Incubar a temperatura ambiente por 2 minutos
e após, adicionar 1 gota do agente revelador.
LEITURA:
POSITIVO: Desenvolvimento de uma coloração vermelha na massa bacteriana.

NEGATIVO: Desenvolvimento de coloração amarela na massa bacteriana.
SULFAMETOXAZOL-TRIMETOPRIMA
PRINCÍPIO: Discos contendo 1,25 mg de trimetoprim e 23,75 mg de sulfametoxazol podem ser usados para
separar presuntivamente os estreptococos dos grupos A e B, dos estreptococos -hemolíticos pertencentes
aos outros grupos.
A bactéria em identificação é semeada em ágar sangue de carneiro, utilizando um cotonete estéril, de

forma a obter um crescimento confluente. Coloca-se sobre este inóculo, com uma pinça estéril, um disco de
Sulfazotrim (o mesmo utilizado em antibiograma) Incubar a 35ºC por 18 - 24 horas.
LEITURA:
SENSÍVEL: Formação de halo de inibição de crescimento bacteriano de qualquer tamanho.

RESISTENTE: Ausência de formação de halo de inibição de crescimento.
HIDRÓLISE DA ESCULINA EM PRESENÇA DE BILE (BE)
PRINCÍPIO: Determinar a habilidade de um microrganismo em hidrolisar a esculina em esculetina e glicose,

em presença de bile.
É baseada na capacidade de certas bactérias, particularmente Enterococos, hidrolizarem a esculina em

presença de sais biliares entre 1 a 4%.
As bactérias capazes de crescer em presença de bile e hidrolisar esculina produzem glicose e esculetina
(7,7 diidroxicumarina) em um meio apropriado. A esculetina reage com sais de ferro, formando um complexo
marrom-escuro ou negro que produz um enegrecimento difuso no meio.
FÓRMULA
Peptona 5,0 g
Extrato de carne 3,0 g
Bile de boi 40,0 g
Esculina 1,0 g
Citrato de ferro 0,5 g
Ágar-ágar 15,0 g
Água destilada 1000 mL
Preparar o meio de acordo com as instruções do fabricante. Distribuir 2,0 mL de meio para cada tubo
de 13 x 100 mm. Autoclavar a 121º C por 15 minutos. Deixar o meio na posição inclinada (superfície longa e
base curta).
Inocular por estrias superficiais, com auxílio de uma agulha bacteriológica, 2 a 3 colônias. Incubar a
35ºC por 24 - 48 horas.
LEITURA:
POSITIVA: Presença de coloração negra no ápice ou no meio todo.

NEGATIVA: Ausência de coloração negra no meio. Pode haver crescimento, mas não alteração da cor do
meio.
MTS ( 6,5 % de NaCl )
PRINCÍPIO: Este meio pode ser empregado para diferenciar os enterococos dos estreptococos que também
possuem o antígeno D, antigamente denominado de estreptococos não enterococos.
FÓRMULA:
Brain heart infusion 10,0 g

NaCl 24,0 g
Sol. púrpura de bromocresol 1,6% 0,4 mL
Glicose 0,4 g
Preparar o meio de acordo com as instruções do fabricante. Distribuir 2,5 mL de meio para cada tubo
13 x 100 mm. Autoclavar a 121º C durante 15 minutos.
Com auxílio de uma agulha de semeadura bacteriológica, semear por dispersão o microrganismo em
identificação. Incubar a 35ºC por 24 -72 horas.
Este teste evidencia o crescimento de um microrganismo em presença de uma alta concentração de sal (6,5
%). Uma reação positiva é evidenciada por crescimento, podendo estar acompanhado de viragem do indicador
de pH púrpura de bromocresol incorporado ao meio, que em pH ácido, pela fermentação da glicose, apresenta-
se com coloração amarelada.
LEITURA:
POSITIVO: Crescimento evidenciado pela turbidez do meio. A alteração de cor não é necessária.
NEGATIVO: Ausência de crescimento.
SUSCEPTIBILIDADE A VANCOMICINA (30 g)
PRINCÍPIO: Determinar a sensibilidade de um coco Gram positivo, catalase negativo frente a vancomicina.
TÉCNICA:
Pelo método de Facklam e Washington um inóculo “pesado” (5 a 10 colônias) é semeado, com auxílio
de um cotonete estéril, em mais da metade de uma placa de TSA com 5% de sangue de carneiro. Utilizando
uma pinça estéril, coloca-se um disco de vancomicina 30 g, no centro da área inoculada. Incubar a 35ºC por
18 - 24 horas em atmosfera enriquecida com CO2 (Jarra com vela).
LEITURA
POSITIVO: Presença de qualquer zona de inibição de crescimento.

NEGATIVO: Ausência de inibição de crescimento.
FERMENTAÇÃO DE CARBOIDRATOS (ARABINOSE, SACAROSE, MANITOL, etc)
MEIO BÁSICO PARA FERMENTAÇÃO DE CARBOIDRATOS (Enterococos)
PRINCÍPIO: Determinar a habilidade de um microrganismo em fermentar um determinado carboidrato, com

conseqüente acidificação do meio.
FÓRMULA: Facklam e Washington
Infusão de coração 22,5 g

Carboidrato 10,0 g
Púrpura de bromocresol 1,6 % 1,0 mL
Este meio pode ser preparado sem adicionar o carboidrato. Após a semeadura adiciona-se 3 gotas da
solução a 20% do carboidrato que se quer testar.
TÉCNICA DE PRODUÇÃO:
Preparar o meio básico com infusão de coração, Púrpura de bromocresol. Distribuir 2,5 mL por tubo
13 x 100 mm. Autoclavar a 121º C por 15 minutos.
Semear por dispersão, com auxílio de uma agulha de semeadura bacteriológica , o coco Gram positivo em
identificação. Adicionar assepticamente o carboidrato adequado (esterilizado por filtração), em cada tubo na
proporção indicada. Incubar a 35ºC por no mínimo 7 dias.
Com a utilização do carboidrato adicionado ao meio de cultura haverá formação de ácidos devido a
fermentação do carboidrato no metabolismo bacteriano, o qual é detectado pela viragem de cor do indicador
de pH presente no meio de cultivo.
LEITURA:
POSITIVO: Desenvolvimento de coloração amarela no meio de cultivo.

NEGATIVO: Não alteração da cor original do meio de cultivo (púrpura).
CRESCIMENTO A 10º E 45ºC
PRINCÍPIO: Determinar a habilidade de um determinado microrganismo crescer as temperaturas de 10 e

45ºC.
FÓRMULA: Facklam e Washington
Infusão de coração 25,0 g

Dextrose 1,0 g
Púrpura de bromocresol 1,6% 1,0 mL
TÉCNICA DE SEMEADURA
Semear por dispersão, com auxílio de uma agulha bacteriológica, uma colônia do coco Gram positivo
em identificação. Incubar a 10ºC e em Banho Maria a 45ºC, por no mínimo 7 dias.
LEITURA:
POSITIVO: Presença de turbidez com ou sem alteração da cor do meio de cultivo de púrpura para amarelo.
NEGATIVO: Ausência de crescimento bacteriano (não turbidez do meio, de cultivo).
GÁS DE GLICOSE
PRINCÍPIO: Determinar a habilidade de um determinado microrganismo crescer e produzir gás em um meio

contendo glicose.
FÓRMULA: Pode ser usada a mesma do crescimento a 10 C e 45 C, adicionar o tubinho de Durham em

cada tubo de meio.
LEITURA:
POSITIVO: Presença de bolhas de gás no tubo de Durham
NEGATIVO: Ausência de bolhas de gás no tubo de Durham
MEIO PARA UTILIZAÇÃO DE PIRUVATO:
Triptona 10 g
Extrato de Levedura 5,0 g
Fosfato Dipotássio (K2HPO4) 5,0 g
Cloreto Sódio 5,0 g
Piruvato Sódio 10 g
Azul de Bromotimol 104 mg
Água destilada 1L
Ajustar o pH p/ 7,1 a 7,4, se necessário. Dispensar 2 mL/tubo 13x100 rosca. Autoclavar/15 minutos.
Reação Positiva → Muda de verde para amarelo

Reação Negativa → verde ou verde amarelado
ÁGAR TELURITO DE POTÁSSIO
Heart Infusion ágar 20g

Acertar o pH para 6,0 com HCl – 1N (ajustar em pH-mêtro). Autoclavar 121ºC/15 minutos. Resfriar a
90ºC, adicionar 25 mL de sangue desfibrinado de coelho ou carneiro. Misturar bem. Resfriar a 50ºC, adicionar
solução de Telurito de Potássio (0,25g de telurito potássio em 10 mL de água destilada). Misture bem, envazar
em placas.
POSITIVO: Enterococcus faecalis cresce formando colônias pretas.

4) Identificação de BGN – Ordem Enterobacterales – Fermentadores de Glicose
FAMÍLIA MICRORGANISMOS
Enterobacter spp. Leclercia spp.
Escherichia spp. Pseudocitrobacterv spp.
Enterobacteriaceae Citrobacter spp. Raoultella spp.
Cronobacter spp. Salmonella spp.
Klebsiella spp. Shigella spp.
Proteus spp.
Morganellaceae Providencia
Morganella spp.
Yersinia spp.
Yersiniaceae
Serratia spp.
Pantoea spp.
Erwiniaceae Tatumella spp.
Erwinia spp.
Hafnia spp.
Hafniaceae
Edwarsiella spp.
Pectobacterium spp.
Pectobacteriaceae
Dickeya spp.
Budviciaceae Budvicia spp.
1. Ordem Enterobacterales:
➔ São amplamente distribuídos na natureza e são encontrados no: solo, água, vegetais e trato
gastrointestinal (TGI) de humanos e animais
➔ Colonizam o TGI humano, geralmente sem causar doença;
➔ Bactérias mais frequentemente isoladas de amostras clínicas;
➔ Tem a maior família de Gram-negativo causadora de infecção humana.
2. Importância clínica:
➔ Pode ser isolada de qualquer sítio anatômico;

➔ Alguns membros desta família estão sempre associados à infecção quando encontrada no ser humano
(Ex.: Salmonella, Shigella e Yersinia);
➔ Outros são membros da microbiota: Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis...
→ mas podem causar infecção;
3. BGN – Fermentadores de Glicose - Características comuns:
➔ São bacilos gram negativos;

➔ Anaeróbio facultativo;
➔ Fermentadores da glicose (com ou sem produção de gás);
➔ Não tem enzima citocromo oxidase (exceção Plesiomonas);
➔ Crescem bem em meio comum de cultura como ágar Mac Conkey;
➔ Alguns são móveis (flagelos);
➔ Bacilos curtos (2 a 3 μm) ou longos (6 a 7 μm);
➔ Possuem exigências nutricionais simples;
➔ Colônias são relativamente grandes em meios de cultura;
➔ Crescimento em 18-24 h de incubação;
➔ Doenças e síndromes clínicas: infecções do trato urinário, pulmonar, intestinal, feridas operatórias,
sanguíneas, cerebrais, oftálmicas, ouvido etc.
4. Fermentação da lactose:
➔ Não são todas que fermentam

➔ Requer 2 enzimas: b galactosidase e b-galactosídeo permease;
➔ Precisamos saber se a bactéria degrada a lactose para anotar no sistema de identificação bioquímica
(R/b);
➔ Ler na placa e anotar no tubo TSI;
5. Meios de cultura:
➔ Ágar MacConkey:
➔ Meio seletivo para isolamento de BGN e

diferencial para os bacilos que fermentam a glicose;
➔ Mecanismo: os sais biliares e cristais violetas
inibem a microbiota gram positiva. A lactose em
combinação com o indicador de pH, evidencia os LAC+ LAC -
microrganismos degradadores de lactose.
➔ Resultado:
▪ Colonias Lac+: colônias rosas, ex: E. coli e outros

coliformes;
▪ Colonias Lac-: colônias transparentes, ex:
Salmonella spp. e Shigella spp.
PROVAS DE IDENTIFICAÇÃO
PROVA DA OXIDASE
Reagente: Dicloridrato de tetrametil-p-fenilenodiamino → azul de indofenol
Citocromo oxidase + O2
NEGATIVA POSITIVA
Sem desenvolvimento de cor Desenvolvimento de cor púrpura
Significa que reduziu Significa que oxidou –
FERMENTADORES DA GLÍCOSE NÃO FERMENTADORES DA GLÍCOSE

ORDEM ENTEROBACTERALES BACILOS OU COCOBACILOS
SEGUIR PARA AS PROVAS DO SISTEMA R/B SEGUIR PARA AS PROVAS DO

FLUXOGRAMA I E II
Fazer leitura na base e fundo Fazer leitura no ápice e na superfície
PROVAS BIOQUÍMICAS MANUAIS – SISTEMA R/B - PARA ENTEROBACTERALES
PROVA DO TSI
ZXTrês açúcares e ferro
GLICOSE SACAROSE LACTOSE GÁS H2S
Fermentou SÓ Fermentou glicose Sulfato ferroso/
glicose e outros açucares Tiossulfato de ferro
como substrato fazem a
Ocorreu a
formação do H2S e
formação de
posteriormente do
bolhas, rasgos ou
Fica vermelho somente na O tubo fica sulfato ferroso (que
até espaçamento
parte de cima do tubo todo amarelo absorvemos).
no ágar
Se a bact. possui a enz
para isso, ela forma um
precipitado NEGRO
Para saber se usou SAC ou LAC deve fazer uma

semeadura em placa CLAD ou McConkay
Se a placa ficar AMARELA Se a Placa ficar AZUL
LACTOSE POSITIVA LACTOSE NEGATIVA
TODO H2S POSITIVO
É GLICOSE
POSITIVA TAMBEM
PROVA DO MIO
MOTILIDADE INDOL ORNITINA/ lisina e arginina
POSITIVO NEGATIVO POSITIVO NEGATIVO POSITIVO NEGATIVO
Ler o fundo do tubo
Ocorre a formação Ocorre a formação O tubo fica com
O MO fica imóvel O tubo fica todo
Tubo fica de um anel de um anel fundo amarelo
ao redor da picada roxo pois
todo turvo VERMELHO no amarelo pois não possui
da semeadura conseguiu usar os
tubo ou sem cor enz para usar o
açucares
açúcar
PROVA DO CITRATO DE SIMMONS
Determinar se um MO é capaz de utilizar o citrato COMO ÚNICA fonte de carbono para o seu crescimento
com consequente alcalinização, ou seja, quando a bactéria cresce, usam o citrato como fonte de carbono e
o sal de amônia, produzindo NH3 no meio e o alcalinizando.
Se a bactéria conseguir consumir o citrato ela cresce no meio
MEIO POSITIVO COM

MEIO ORIGINAL
CRESCIMENTO VISÍVEL
PROVA DO MEIO MBA - Rhamnose

Determinar a habilidade de uma bacteria em fermentar um carboidrato especifico incorporado num meio
basal com produção de ácido e gás.
POSITIVO NEGATIVO
A bacteria CONSEQUE usar Rhamnose A bacteria NÃO CONSEQUE usar Rhamnose

Ácido muda ph
MEIO FICA AMARELO MEIO FICA VERMELHO
Os dois ficam turvos → crescimento

PROVA DA FENILALANINA DESAMINASE
➔ Determinar a capacidade da bacteria desaminar a fenilalanina (aminoácido).
➔ A fenilalanina é um aminoacido com grupamento carboxila e amina que se, a bacteria conseguir tirar
ela, formará um grupamento ácido, formando o ácido fenilpirúvico.
➔ Precisa fazer revelação: utiliza-se cloreto férrico a 10% ou 12%.
Meio original transparente → crescimento → cloreto férrico

cor do ágar da bactéria
POSITIVO NEGATIVO
Forma um complexo verde Fica da cor do ágar ou do revelador (amarelo)
PROVA DA LISINA DESCARBOXILASE

➔ Observar se aconteceu uma turvação do meio com uma alcalinização maior ainda;
➔ A reação requer ocorrer em anaerobiose: precisa ocorrer em meio isento de oxigênio para isso,
necessita colocar óleo mineral ou vaselina para que não tenha contato do O2 com o meio.
➔ A bactéria tem a enzima lisina descarboxilase e conseque utilizar a lisina do meio, promovendo a
dexcarboxilação do aminoácido (remove a parte ácida da carboxila e deixa o grupamento amino), que é
liberado e é basico.
POSITIVO NEGATIVO
A bacteria deixa o meio turvo
O meio mantem-se amarelo
de coloração roxo ou acizentado
6. Leitura do sistema R/B:
➔ Deve-se preencher a tabela a seguir:
➔ Interpretação:
Prova positiva: colocar o número

correspondente
Prova negativa: colocar zero
Somar cada grupo: no final terá um

biotipo de 4 números
Com o resultado, você procura no catálogo qual bactéria

corresponde ao biotipo encontrado.
7. PARTE DA APOSTILA QUE CORRESPONDE AO CONTEÚDO DE BGN FERMENTADORES
UNIDADE 4
IDENTIFICAÇÃO DE BACILOS GRAM NEGATIVOS DA ORDEM Enterobacterales
INTRODUÇÃO
Os bacilos Gram negativos pertencentes à ordem Enterobacterales são microrganismos frequentemente

isolados de amostras clínicas enviadas aos laboratórios de microbiologia. Atualmente dispomos de vários
esquemas para a identificação das enterobactérias podendo estes ser fornecidos aos laboratórios clínicos em
kits comerciais. Anteriormente a identificação das espécies de Enterobacterales era realizada utilizando-se
fluxogramas. Atualmente, estes não estão sendo utilizados com frequência em vista do uso bastante difundido
de sistemas compactos numéricos de perfis e dados de referência computadorizados.
O emprego dos sistemas de identificação tornou possível definir “biotipos” no qual muitas espécies
bacterianas conhecidas podem ser sub agrupadas. Os números de biotipos estão baseados em dados obtidos a
partir da análise de milhares de reações bioquímicas. A biotipificação é uma valiosa ajuda para reconhecer
grupos bacterianos. Isto é necessário durante uma investigação epidemiológica ou quando se estuda a fonte
de infecções cruzadas nos hospitais. A análise dos biotipos de algumas espécies bacterianas pode levar a uma
melhor interpretação acerca de como a variação das características de identificação pode estar relacionada
com diferenças conhecidas quanto a virulência de diferentes cepas.
No comércio brasileiro, existem sistemas computadorizados de identificação baseada em combinações
de provas bioquímicas organizadas em kits compactos de utilização direta de substrato (BAC-TRAY, API-20,
BBL-CRYSTAL), como também, kits que empregam meios de cultura (LABORCLIN, BIOPROV, PROBAC,
NEWPROV). Existem ainda os sistemas automatizados (MICROSCAN, VITEK, PHOENIX). Em todos os
casos os parâmetros usados são muito semelhantes. Assim sendo, a escolha de um deles é uma questão de
preferência pessoal.
É importante lembrar que um bom diagnóstico microbiológico não depende somente de uma série de
características diferenciais e que o sistema de identificação não é um dispositivo infalível. O microbiologista
deve integrar os dados bioquímicos às características coloniais (cor, tamanho, textura, odor, reações
hemolíticas), à coloração de Gram, aos caracteres morfológicos e, se disponíveis, às reações sorológicas, para
então efetuar uma identificação final de forma confiável.
O microbiologista deve conhecer os princípios das provas bioquímicas empregadas no laboratório a fim
de que qualquer inconsistência bioquímica, problemas com culturas mistas ou técnicas errôneas possam ser
rapidamente conhecidas e corrigidas.
Nesta unidade estão apresentadas as provas bioquímicas básicas de um sistema de identificação conhecido
como R/b, utilizado pelo Laboratório de Bacteriologia Médica da UEM, para a identificação de bacilos Gram
negativos pertencentes à ordem Enterobacterales. O mecanismo bioquímico aqui apresentado será semelhante,
independente do sistema utilizado.
Características comuns da ordem Enterobacterales:
• São bacilos Gram negativos;

• Crescem bem em meios comuns de cultura, como ágar MacConkey;
• São oxidase negativa (Exceção: Plesiomonas shigelloides);
• Fermentam a glicose com ou sem produção de gás.
Principais gêneros desta ordem: Escherichia; Salmonella; Shigella; Citrobacter; Klebsiella; Proteus;
Providencia; Serratia; Enterobacter; Morganella; Yersinia.
IDENTIFICAÇÃO - Sistema R/b
A identificação de enterobactérias utilizada neste laboratório, utiliza um sistema de identificação

bioquímica (R/b) que é composto por 6 tubos. Estas provas quando positivas, devem ser consideradas
numericamente pelo valor a elas expresso, que, depois de somadas resultam em um número de 4 algarismos
que corresponde ao biotipo, que deve ser procurado num catálago para a determinação do provável
microrganismo isolado. Nem todos os biotipos sugerem uma identificação precisa e simples, alguns requerem
provas complementares.
Pode-se soltar um resultado (com confiança) quando a chance do microrganismo em questão for acima
de 95 %.
PROVA DA OXIDASE
1. Finalidade: Determinar a presença da enzima oxidase (citocromo oxidase).
2. Fórmula:
Dicloridrato de tetrametil-p-fenilenodiamino 1,0 g
3. Preparo do reagente: Dissolver o corante na água destilada aquecendo-se suavemente. Transferir
para um balão volumétrico de 100 mL e completar o volume com água destilada. Distribuir em alíquotas
pequenas (1 mL) e conservar em congelador em frasco escuro recoberto com papel alumínio. Descongelar na
hora do uso. O reagente é muito instável, oxidando-se rapidamente. Portanto, realizar sempre o controle de
qualidade do reagente toda vez que este for descongelado para uso. Desprezar a alíquota que apresentar cor
azul intensa.
4. Mecanismo: os citocromos são hemeproteínas que agem como o último elo na cadeia da respiração
aeróbia, por transferir elétrons (Hidrogênio) para o oxigênio, com a formação de água. O sistema citocromo
ocorre em organismos aeróbios, microaerofílicos e em anaeróbios facultativos, podendo estar associado nestes
casos à enzima oxidase. A prova da oxidase é empregada para investigar aqueles microrganismos que
apresentam ou não está enzima ou que são anaeróbios obrigatórios (sem enzima). O teste utiliza certos
reagentes (corantes) tais como o dicloridrato de tetrametil-fenilenodiamino, que substituindo o oxigênio atua
como aceptor artificial de elétrons. O corante no estado reduzido é incolor, contudo, na presença do citocromo
oxidase e do oxigênio atmosférico é oxidado tomando uma coloração escura.
5. Execução do teste: atritar em um pedaço de papel de filtro uma
porção da colônia bacteriana a ser testada. Adicionar uma gota do reativo
sobre o inóculo.
6. Leitura e Interpretação:
Positivo: desenvolvimento de uma coloração púrpura
imediatamente após a adição de reativo
Negativo: sem o desenvolvimento de cor.
OBS: Existem no mercado brasileiro fitas ou discos impregnados
com o reativo.
PROVAS DE IDENTIFICAÇÃO BIOQUÍMICA ENTEROBACTÉRIAS
TRÍPLICE AÇÚCAR FERRO (TSI)

1.Finalidade:
Determinar a habilidade de um microrganismo em utilizar, incorporados a um meio basal, glicose e ou

lactose e sacarose com ou sem a produção de gás; evidenciar ainda a produção de gás sulfídrico (H2S). O
meio de TSI é empregado comumente em bacteriologia para a identificação preliminar (triagem) das
enterobactérias.
2. Fórmula:

Extrato de levedura 3,0 g
Peptona 20,0 g
Lactose 10,0 g
Sacarose 10,0 g
Glicose 1,0 g
Sulfato ferroso 0,2 g
Tiossulfato de sódio 0,3 g
Cloreto de sódio 5,0 g
Vermelho de fenol 0,024 g
Ágar-ágar 12,0 g
3. Mecanismo:
A utilização dos açúcares presentes no meio de TSI pode ocorrer aerobicamente na superfície ou
anaerobicamente em profundidade, ou simultaneamente, dependendo do potencial enzimático do
microrganismo em questão. Basicamente encontramos no meio de TSI os 3 modelos de fermentação abaixo
apresentados:
* (1) Apenas a fermentação da glicose (K/A). A superfície alcalina (vermelha) indica a ocorrência da
degradação oxidativa da glicose. Após aproximadamente 18 horas de incubação, a glicose é totalmente
consumida devido a sua baixa concentração (0,1%) e o microrganismo começa então a utilizar as peptonas,
presentes no meio, para o seu crescimento. O catabolismo das peptonas resulta na liberação da amônia (NH3)
responsável pela alcalinização da superfície do meio de cultura. A profundidade do meio permanece amarela
devido a prévia fermentação da glicose com produção de ácidos relativamente estáveis. Portanto, o pH da base
se torna mais ácido que o da superfície do meio onde ocorreu a oxidação do açúcar.
* (2) Fermentação da lactose, sacarose e glicose (A/A). Alguns microrganismos têm a capacidade de
usar todos os açúcares presentes, resultando na acidificação da superfície e da base. Tanto a lactose como a
sacarose estão presentes em concentrações 10 vezes maiores do que a glicose; portanto, após 18 horas de
incubação a glicose é consumida, mas existem ainda grandes quantidades dos outros dois açúcares.
Dependendo do tempo de incubação, a superfície pode se apresentar alcalina devido a depleção da lactose e
sacarose com consequente utilização das peptonas presentes no meio.
* (3) Não fermentação da lactose, sacarose ou glicose (K/K) ou (K/NC). Certas bactérias,
principalmente bacilos Gram negativos não entéricos, são incapazes de fermentar os açúcares presentes no
TSI. O desenvolvimento destes microrganismos ocorre devido a degradação das peptonas. A reação K/K é
resultado da degradação tanto aeróbica quanto anaeróbica das peptonas, enquanto o modelo K/NC é devido
ao catabolismo somente aeróbico destas substâncias.
Os gases produzidos no meio de TSI são CO2 e H2 e as bactérias produtoras são chamadas aerogênicas.
No caso da não formação de gases, são ditas anaerogênicas.
O meio de TSI evidencia ainda a presença de bactérias produtoras de gás sulfídrico (H2S), resultante da
reação em duas etapas:
- A bactéria num ambiente ácido degrada o tiossulfato de sódio (substrato) com a produção de gás
sulfídrico que é um gás incolor e invisível.
- Numa segunda etapa, o H2S reage com o sulfato ferroso existente no meio (revelador) formando o sulfeto
ferroso que é um composto insolúvel, responsável pela coloração negra que aparece no meio de TSI. Observar
que a produção de H2S implica na produção de ácido mesmo que a coloração amarela não possa ser observada.
4. Técnica de semeadura: “picada profunda e estria superficial”
5. Técnica de preparo:
Meio encontrado comercialmente desidratado. Portanto, para o preparo do meio seguir as instruções do
fabricante.
Reação na superfície ou ápice / reação na profundidade ou base:
K: alcalino,
A: ácido
AG: ácido e gás
H2S: gás sulfídrico
NC: não crescimento
MIO (Motilidade/Indol/Ornitina)
O tubo MIO compreende 3 provas listadas a seguir:
MOTILIDADE (ágar semissólido pH 7,2)

1. Finalidade: Determinar se um microrganismo é móvel ou imóvel, ou seja, se tem ou não flagelo.
2. Fórmula:
Peptona 10,0 g
Ágar-ágar 4,0 g
A prova da motilidade pode ser realizada utilizando-se um meio específico para esta prova. Entretanto,
nos laboratórios de rotina de microbiologia clínica, geralmente, empregam-se meios que fornecem leitura de
outras provas bioquímicas além do indol, como por exemplo o MIO (motilidade, indol e ornitina).
Os meios são encontrados comercialmente desidratados. Portanto, para o preparo seguir as instruções
do fabricante.
4. Técnica de semeadura: “por picada profunda”.
- Positivo: o microrganismo móvel se difunde ao redor da linha da picada, apresentando o aspecto de uma
nuvem difusa.
- Negativo: o microrganismo imóvel cresce apenas ao longo da linha de semedura.
INDOL
1. Finalidade: Determinar a habilidade de um determinado microrganismo em produzir indol a partir da

molécula de triptofano.
2. Fórmula:
Triptona 10,0 g
Reativo de Kovacs:
Ácido clorídrico concentrado 50 mL

Álcool amílico, isoamílico ou butílico 150 mL
p-dimetil-amino-benzaldeído 10g
3. Mecanismo:
O triptofano é um aminoácido que quando degradado por certas bactérias levam à formação
principalmente dos seguintes produtos metabólicos intermediários: indol, escatol (metil indol) e ácido indol-
acético. As várias enzimas intracelulares envolvidas neste processo fisiológico são coletivamente
denominadas de “triptofanases”. Os produtos intermediários formados em maior quantidade na degradação
do triptofano são o ácido indol pirúvico, que produz indol por desaminação-deaminação, e o escatol formado
pela descarboxilação do ácido indol-acético. A presença do indol no meio de cultivo é revelada pela adição
do reativo de Kovacs, ocorrendo então a seguinte reação química:
O p-dimetil-amino-benzaldeído se liga à molécula do indol produzindo um composto quinoidal de
coloração vermelha, evidenciado pela formação de um anel na camada alcoólica superficial do meio. A reação
de cor é na realidade devido a reação dos grupos CH2 do anel pirrólico da molécula do indol com o aldeído,
que num meio “ácido” forma uma “quinona”.
A prova do indol pode ser realizada utilizando-se um meio específico para esta prova. Entretanto, nos
laboratórios de rotina de microbiologia clínica, geralmente, empregam-se meios que fornecem leitura de outras
provas bioquímicas além do indol, como por exemplo o MIO (motilidade, indol e ornitina).
Os meios são encontrados comercialmente desidratados. Portanto, para o preparo seguir as instruções do
fabricante.
Adicionar 5 gotas de Reativo de Kovacs na superfície do meio inoculado:
- Positivo: desenvolvimento de anel vermelho na superfície do meio de cultivo.
- Negativo: sem desenvolvimento de cor na camada alcoólica.
Obs.: Pode ocorrer o desenvolvimento de uma coloração laranja na superfície do meio devido a presença de
escatol, que pode ser um dos precursores para a formação do indol.
LISINA/ARGININA/ORNITINA DESCARBOXILASE
1. Finalidade: Determinar a habilidade enzimática de um determinado microrganismo em descarboxilar o

aminoácido lisina com a conseqüente alcalinização do meio de cultivo pela formação da amina
correspondente.
2. Fórmula:
Peptona 5,0 g
Dextrose 1,0 g
L-lisina 5,0 g
Púrpura de bromocresol 0,2 g
3. Mecanismo:
A descarboxilação é um processo no qual as bactérias que possuem enzimas “descarboxilases” específicas,
são capazes de atuar nos grupos carboxila-terminal (-COOH) dos aminoácidos produzindo uma amina ou
diamina e dióxido de carbono. As enzimas descaboxilases são numerosas, porém específicas para um
determinado substrato (aminoácido). Estas enzimas são adaptativas porque são formadas pelos
microrganismos somente quando estes são cultivados em ambiente ácido, na presença do substrato específico.
Os produtos de descarboxilação por sua vez,
determinam uma alcalinidade no pH do meio de cultura. A
descarboxilação é restrita àqueles aminoácidos que
possuem pelo menos um grupo quimicamente ativo além da
amina (-NH2) ou do grupo carboxílico (-COOH) e a quebra
do aminoácido ocorre anaerobicamente. A descarboxilação
é um processo irreversível não oxidativo e requer uma
coenzima comum. o piridoxal fosfato.
O aminoácido lisina, sob a ação da lisina descarboxilase forma uma diamina (cadaverina) e dióxido de
carbono.
4. Técnica de semeadura: por “dispersão”.

Meio encontrado comercialmente desidratado. Portanto, para o preparo do meio
seguir as instruções do fabricante.
- Positivo: desenvolvimento de uma coloração diferente de amarelo, normalmente
púpura.
- Negativo: desenvolvimento de uma coloração amarela.
OBSERVAÇÃO:
O princípio bioquímico da descarboxilação da ORNITINA E

ARGININA é semelhante ao descrito acima, mudando na fórmula
simplesmente o aminoácido a ser descarboxilado como também a
diamina formada pela ação do microrganismo no substrato (ornitina e
arginina), originando a putrescina.
CITRATO DE SIMMONS
1. Finalidade: Determinar se um microrganismo é capaz de utilizar o citrato como única fonte de carbono
para o seu crescimento com conseqüente alcalinização.
2. Fórmula:
Sulfato de magnésio 0,2 g
Fosfato dihidrogenado de amônia 1,0 g
Fosfato dipotássico 1,0 g
Citrato de sódio 2,0 g
Ágar-ágar 15,0 g
Solução alcoólica de azul de bromotimol a 1% 0,08 g
pH: 6,9
3. Mecanismo:
Normalmente, o metabolismo do citrato envolve a condensação de uma molécula acetil com a
coenzima A mais o oxalacetato para iniciar o ciclo de Krebs. A grande maioria das bactérias utilizam o citrato
pelo ciclo dos ácidos tri-carboxílicos ou através da via fermentativa. A clivagem do citrato envolve a
participação da “citratase”. O citrato é transformado em acetato e oxalacetato sendo este último transformado
em piruvato e CO2. O meio de cultivo utilizado para a fermentação do citrato também contém um sal
inorgânico de amônia. O microrganismo que usa o citrato como única fonte de carbono também utiliza o sal
de amônia como única fonte de nitrogênio. A degradação destes sais produz amônia (NH3) com a conseqüente
alcalinização.
4. Técnica de semeadura: “estria superficial (risco)”. Utilizar um inóculo pequeno.
Meio encontrado comercialmente desidratado. Portanto, para o preparo do meio seguir
as instruções do fabricante.
- Positivo: crescimento bacteriano com ou sem alteração da cor do meio para azul.
- Negativo: ausência de crescimento bacteriano. Não ocorre alteração da cor do meio.
FERMENTAÇÃO DE CARBOIDRATOS
Meio Básico para Açúcar – MBA (Ex.: Rhamnose)
1. Finalidade: Determinar a habilidade de um microrganismo em fermentar um carbohidrato específico

incorporado num meio basal com a produção de ácido ou ácido e gás.
Obs. Uma única base pode ser empregada para a observação da capacidade do microrganismo de
fermentar diferentes açúcares. O carboidrato deverá ser incorporado ao meio base na hora do uso.
Nos laboratórios de rotina de microbiologia clínica são utilizados meios que fornecem leitura de outras
provas bioquímicas além da fermentação de açúcares (glicose, lactose, sacarose), como por exemplo o TSI,
Rugai, KIA, etc...
2. Fórmula: Meio básico para fermentação de carboidratos

Peptona 10,0 g
Vermelho de fenol 0,018 g
3. Mecanismo:
A fermentação é um processo metabólico anaeróbico de óxido-redução no qual um substrato orgânico
serve como aceptor final de hidrogênio. Na fermentação de substratos orgânicos como os carboidratos ocorrem
a formação de produtos oxidados e reduzidos, que dependem de alguns fatores tais como:
(1) o tipo de microrganismo
(2) a natureza do substrato a ser fermentado
(3) as condições ambientais de cultivo como temperatura, acidez, etc...
Os produtos de fermentação dos carbohidratos e álcoois, genericamente denominados de “açúcares”, são
poucos: dois gases (H2 e CO2), poucos ácidos e álcoois e uma cetona.
Pesar os ingredientes segundo a fórmula acima descrita. Dissolver, distribuir em tubos e esterilizar a
121ºC durante 15 minutos. Na hora do uso, adicionar assepticamente a solução de açúcar previamente
esterilizada por filtração ou tindalização de modo a obter uma concentração final de 1g%.
5. Técnica de semeadura: por “dispersão”.

- Fermentação do açúcar: meio ácido - coloração amarela.
- Não fermentação do açúcar: meio alcalino - coloração vermelha.
FENILALANINA DESAMINASE
1. Finalidade: Determinar a habilidade de um microrganismo em desaminar a fenilalanina com a conseqüente
modificação de meio de cultivo pela formação de ácido fenilpirúvico.
2. Fórmula:
DL-fenilalanina 2,0 g
Fosfato dissódico 1,0 g
Ágar-ágar 12,0 g
Cloreto férrico a 12%
Cloreto férrico 12 g
Ácido clorídrico concentrado 2,5 mL
Água destilada q.s.p. 100 mL
3. Mecanismo:
O aminoácido aromático fenilalanina sofre desaminação oxidativa, catalisada por uma flavoproteína,
para produzir o ácido fenilpirúvico. A desaminação oxidativa resulta na liberação de um grupo amina (NH2)
do aminoácido para formar um alfa cetoácido de ligação dupla e amônia (NH3). Este processo ocorre em duas
etapas: inicialmente o hidrogênio é retirado do aminoácido formando um iminoácido. Este hidrogênio livre se
combina com o oxigênio para formar água e conseqüentemente o iminoácido é hidrolizado em um cetoácido.
A fenilalanina é desaminada em ácido fenilpirúvico e este durante a incubação é reduzido a ácido fenilacético.
O ácido fenilacético pode ser convertido em fenilalanina, com isso, iniciando novamente o ciclo. Uma pequena
quantidade de ácido fenilpirúvico é susceptível a ser descarboxilado a ácido fenil acético, o qual também pode
se reconvertido em fenilalanina. A evidenciação da desaminação da fenilalanina no meio de cultivo é revelada
pela adição do reativo cloreto férrico, ocorrendo a seguinte reação química: o cloreto férrico, que é um agente
oxidante, e os íons férricos (Fe+++), em solução ácida com hidrazina, formarão como produto final nitrogênio
e amoníaco. O cloreto férrico atua como agente quelante fazendo com que o ácido fenilpirúvico desenvolva
uma coloração verde.
4. Técnica de preparo: Meio encontrado comercialmente desidratado. Portanto, para o preparo do meio
seguir as instruções do fabricante.
5. Técnica de semeadura: estria superficial

6. Leitura e interpretação:
Após 18 24 horas de incubação adicionar 4 a 5 gotas da solução de cloreto férrico
diretamente no tubo inoculado.
- Positivo: desenvolvimento de uma coloração verde escura.
- Negativo: sem desenvolvimento de cor.
PROVA DO MALONATO
1. Finalidade:
Verificar a capacidade do microrganismo em utilizar o malonato de sódio como sua única fonte de
carbono
2. Fórmula:
Glicose 0,25 g
Sulfato de amônio 2,0 g
Fosfato monopotássico 0,4 g
Malonato de sódio 6,0 g
Azul de bromotimol 0,025 g
H2O 1000 mL
pH 6,7
3. Mecanismo:
O malonato é um inibidor enzimático que interfere na oxidação do ácido succínico a ácido fumárico,
inibindo a enzima succinato-dihidrogenase. Com a supressão do ácido fumárico o ciclo de Krebs deixa de
funcionar privando a célula de energia.
O acúmulo do ácido succínico interfere também no ciclo do ácido glioxílico impedindo a produção de
substâncias intermediárias para a biossíntese de novos compostos necessários ao metabolismo. Como
resultado o microrganismo é incapaz de multiplicar-se a menos que possa fermentar ou utilizar o malonato de
sódio como única fonte de carbono. A adição de extrato de levedura e uma quantidade pequena de dextrose
como fonte de carbono respectivamente, estimula o crescimento de organismos que não são aptos a utilizar o
malonato ou sal de amônio.
4. Técnica de semeadura: Semear por dispersão.
Após incubação a 35º C, durante 24 - 48 horas observar a seguinte reação:

Positiva: Cor azul claro a azul da prússia intenso em todo o meio
Negativa: Sem alteração de cor (verde ou amarelo → fermentação da glico se)
Alguns microrganismos malonato positivo produzem somente uma ligeira
alcalinização do meio, havendo dificuldade na leitura. Qualquer vestígio de cor azul,
após 48 horas de incubação, indica prova positiva. Não deve ser reportado resultado
com negativo antes de completar 48 horas de incubação.
PROVA DO KCN
1. Finalidade: Determinar a capacidade de um microrganismo em reproduzir-se em um meio que contenha
cianeto de potássio.
2. Fórmula:
Peptona 3,0 g
NaCl 5,0 g
KH2PO4 0,225 g
Na2HPO4 5,65 g
H2O 1000 mL
pH 7,6
3. Mecanismo:
A respiração aeróbia é um processo de óxido-redução que produz energia. A maioria dos organismo
aeróbicos possuem a enzima citocromo-oxidase que as tornam capazes de utilizar o oxigênio como aceptor de
hidrogênio. O Cianeto é um inibidor não competitivo do sistema citocromo-oxidase. No entanto, alguns
microrganismos aeróbicos não são sensíveis ao cianeto. Esta resistencia se deve provavelmente, a um sistema
de respiração flavoproteica.
Pesar os ingredientes segundo a fórmula acima descrita. Dissolver e distribuir em tubos de rosca e
esterilizar a 121º C durante 15 minutos.
Na hora de usar adicionar assepticamente 1 gota de solução de KCN (0,5 %) previamente esterilizada por
filtração.
5. Técnica de semeadura: Semear por dispersão inóculo pouco denso.

Após 24 - 48 horas de incubação a 35º C, alguns podem precisar até 4 dias de incubação, observar a
presença ou ausência de crescimento bacteriano.
- Positivo: Crescimento (meio turvo).
- Negativo: Ausência de crescimento (meio inalterado).
OBS: O cianeto é extremamente tóxico e deve ser destruído pela adição de sulfato ferroso e 0,1 mL de
KOH a 40 % para inativação do cianeto. Após autoclavar os tubos.
PROVA DA UREASE (URÉIA DE CHRISTENSEN)
PRINCÍPIO: Determinar a habilidade de um determinado microrganismo em “degradar” enzimaticamente a

uréia com a formação de duas moléculas de amônia.
FÓRMULA (base):
Peptona 1,0g
Glicose 1,0g
Cloreto de sódio 5,0g
Fosfato dipotássico 2,0g
Vermelho de fenol 0,012g
Agar 12,0g
Água destilada 1000mL
pH 6,8
Vermelho de fenol: C19H14O5S – fenolftaleína

Ácido: pH = 6,8 – amarelo
Alcalino: pH = 8,0 – vermelho
URÉIA
Preparar solução a 40% e esterilizar por filtração (membrana de celulose, 0,45µm).
TÉCNICA DE PREPARO
Preparar o meio-base de acordo com o fabricante. Autoclavar. Resfriar e adicionar ao meio ainda
liquefeito, quantidade suficiente da solução estéril de uréia 40% de modo a obter uma concentração final de
2% em relação ao meio base. Homogeneizar e distribuir assepticamente volumes de 3,0 mL para tubos
13x100mm de rosca, estéreis. Deixar o meio esfriar na posição inclinada, sem base.
SEMEADURA
Por estrias superficiais, utilizando-se de um inoculo “pesado”.
BIOQUÍMICA ENVOLVIDA
O substrato uréia é uma diamida do ácido carbônico, sendo freqüentemente referida como uma
carbamida. A hidrólise da uréia é catalizada por uma enzima específica “urease” , rendendo duas moléculas
de amônia (NH3). Em solução a hidrólize de uréia fornece um produto final o carbonato de amônia.
A urease é uma importante enzima relacionada a decomposição microbiana de compostos orgânicos. Ela
é considerada uma enzima constitutiva, pois é sintetizada pela bactéria na presença ou ausência do substrato
uréia.
LEITURA E INTERPRETAÇÃO
POSITIVO: desenvolvimento de coloração rósea.

NEGATIVO: sem alteração da cor do meio (amarelo).
5) Identificação de BGN não-Fermentadores de Glicose
1. IMPORTANTE:
➔ São bacilos ou cocobacilos gram negativos não esporulados;

➔ Não utilizam carboidrato como fonte de energia ou os utilizam por outras vias diferentes do que a
fermentação;
➔ São patógenos oportunistas;
➔ Habitantes do solo, água, plantas e microbiota homem/animal;
➔ Não-fermentadores da glicose;
➔ Epidemiologia: meio ambiente (ubíquas), Microbiota normal* (hospitalizados), Resistência
intrínseca, Bactérias oportunistas, Prevalência aumentando → Água, solo, vegetais, plantas e superfícies
hospitalares.
➔ Crescimento ou não em meio MacConkey;
➔ Oxidase positiva (se for negativa não exclui);
➔ Ausência de fermentação de glicose.
➔ 15 % dos isolados clínicos hospitalares: 75% Pseudomonas aeruginosa e 25% Acinetobacter spp.,
Stenotrophomonas maltophilia e Burkholderia cepacia.
1.1. PRINCIPAIS DOENÇAS:
➔ Septicemias
➔ ITU
➔ Pneumonias
➔ Feridas cirúrgicas
➢ Doenças de Base:
➔ Fibrose cística
➔ Neoplasias
➔ Doença granulomatosa crônica (defeitos na NADPH oxidase dos fagócitos)
1.2. TAXONOMIA COMPLEXA!!
➔ Estudos filogenéticos baseados na sequência 16S do rRNA levaram a inúmeras mudanças na

classificação e nomenclatura deste grupo bacteriano.
➔ Motilidade
➔ Tipo de flagelos –Polares, Peritríquios
1.3. NÃO FERMENTADORES DE IMPORTÂNCIA MÉDICA
FAMILIA GENERO FAMÍLIA GÊNERO

Pseudomonadaceae Pseudomonas Oceanospirillaceae Balneatrix
Burkholderia
Pandoraea Paracoccus
Burkholderiaceae Ralstonia Rhodobacteriacea Haematobacter
Cupriavidus Pannonibacter
Lautropia
Comamonas
Comamonadaceae Acidovorax Sphingomonadaceae Sphingomonas
Delftia
Brevundimonas
Caulobacteraceae Shewanelaceae Shewanella
Caulobacter
Alcaligenes
Advenella
Stenotrophomonas Bordetella
Xanthomonadaceae Alcaligenaceae
Wohlfahrtiimonas Achromobacter
Oligella
Kerstersia
Acetobacter
Acidomonas
Asaia Cupriavidus
Acetobacteraceae Burkholderiaceae
Gluconobacter (C. pauculus)
Granulibacter
Roseomonas
Rhizobium
Alteromonadaceae Alishewanella Rhizobiaceae
Agrobacterium
Hlomonadaceae Halomonas Rhodospirillaceae Pannonibacter
Methylobacteriaceae Methylobacterium Brucellaceae Ochrobactrum
Chryseobacterium
Elizabethkingia
Empedobacter
Neisseria
Neisseriaceae Flavobacteriaceae Weeksella
Laribacter
Bergeyella
Flavobacterium
Myroides
Herbaspirillum Acinetobacter
Oxalobacteraceae Massilia Moraxellaceae Moraxella
Naxibacter Psychrobacter
2. GÊNERO PSEUDOMONAS:
➔ Pseudomonas aeruginosa
➔ P. putida
➔ P. fluorescens
➔ P. veronii
➔ P. oryzihabitans
➔ P. stutzeri
➔ P. mosselii
➔ P. alcaligenes
➔ P. pseudoalcaligenes
➔ P. luteola
➔ P. mendocina
➔ P. monteilii Significado clínico duvidoso
➢ Espécies de interesse clínico:
➔ BGN retos ou ligeiramente curvos, finos

➔ A maioria das espécies degrada a glicose
➔ Móveis – 1 ou mais flagelos polares
➔ Oxidase positiva (exceção P.oryzihabitanse, P.luteola)
➔ Crescem em MacConkey(os isolados de interesse médico)
➔ Alguns possuem pigmentos que se difundem no meio de cultura
➢ Tipos de coloração:
2.1. Pseudomonas aeruginosa:
➢ Manifestações clínicas:
➔ Foliculite
➔ Feridas operatórias
➔ Infecções de queimaduras
➔ Infecções pulmonares
➔ Infecção de ouvido
➔ Infecções urinárias
➔ Exsudação purulenta azulada, com odor de uva, devido a produção de piocianina, é característica.
➔ Infecções oculares (Após traumatismo da córnea (por lentes de contato, arranhadura...) e exposição à
água contaminada), Pneumonias, Endocardite, Meningites, Abscesso cerebral e Infecções ósseas/articulações.
➔ Ceratite: por P. aeruginosa adquirida pelo uso de lente de contato.
➔ Infecções pulmonares: Infecção respiratória em pacientes com fibrose cística (mucoviscidose).
➔ Em pacientes com fibrose cística exacerba a doença (isolados clínicos mucóides de difícil erradicação).
➔ Sério problema infecção crônica em aproximadamente 70 a 80 dos adolescentes e adultos;
➔ Fenótipo mucóide: acredita-se que pode inibir a fagocitose, aumentar a resistência aos
antimicrobianos e induzir uma significante resposta imune nos pulmões → dano aos pulmões → morte.
2.2. Gênero Acinetobacter:
➔ Taxonomia confusa;
➔ CBGN;
➔ Oxidase negativa;
➔ Imóveis;
➔ 31 espécies;
➔ Complexo Acinetobacter calcoaceticus, Acinetobacter baumannii.
➔ A. lwoffii
➔ A. haemolyticus
➔ A. junii
➔ A. johnsonii
➔ São isolados na natureza;
➔ São importantes agentes de infecções hospitalares (IRAS);
➔ Sobrevivem em superfícies úmidas, mas tem secas (pele)
➔ Podem fazer parte da microbiota orofaríngea ou pele de pessoas “normais”.
➔ A. baumannii é a espécie mais comumente isolada de amostras clínicas humanas.
➔ Patógenos oportunistas;
➔ Infecções hospitalares: Vias aéreas, ITU (cateter), Feridas, Endocardite, Meningite, Pneumonia (pós
traqueostomia ou ventilação mecânica), Peritonite;
➔ Problema: Resistência antimicrobiana
➔ Resistência intrínseca: Ampicilina Amoxacilina, Cefalosporinas 1 ª e 2 ª geração e Nitrofurantoína.
2.3. Gênero Stenotrophomonas:
➢ Stenotrophomonas maltophilia:
➔ BGN móvel: IRAS, qualquer sítio, contaminação de soluções desinfetantes; Steno: estreito
➔ Resistente: carbapenêmicos (imipenem, meropenem e ertapenem). Tropho: alimentação
➔ Sensível: colistina, polimixina B, sulfametoxazol-trimetoprima. Mono: um
➔ Bactéria emergente; Malto: “maltose”
➔ PAV (Pneumonia associado a ventilação); Philia: amiga
➔ Sepse;
➔ ITU;
➔ Imunocomprometidos
2.4. Gênero Burkholderia:
➔ Mais frequente como patógeno humano: Complexo Burkholderia cepacia, B. pseudomallei, B.

gladioli e B. mallei.
➔ Resistência à polimixina B e colistina → Difere da Stenotrophomonas
➔ Tem odor característico de roupa suja;
➔ Predileção por superfícies úmidas do ambiente;
➔ Sobrevive em Povidine , Clorexidina , desinfetantes, água destilada.
➔ B. cepacia é resistente a aminoglicosídeose polimixinas, mas é sensível a sulfametoxazol-
trimetoprima → Surtos associados a uma fonte contaminada: desinfetantes, Anestésicos e Soluções de
PVP-I
3. DIAGNÓSTICO LABORATORIAL:
➢ Primeiros indícios de ser um não-fermentador:
➔ BGN
➔ Crescimento ou não em McConkey: ágar seletivo para gram negativo pois os cristais violetas e sais
biliares presentes nele inibem o crescimento das gram positivas, e a lactose junto com o indicador de pH
evidencia os MO que degradam a lactose.
➔ Oxidase positiva (se negativa não exclui)
➔ Ausência de Fermentação da Glicose
➔ ÁGAR MacCONKEY É SELETIVO PARA GRAM NEGATIVO
4. IDENTIFICAÇÃO BIOQUÍMICA BGN-NF
➢ A partir de colônia isolada com 24 a 72h de

crescimento fazer as seguintes provas:
4.1. Oxidase:
➔ Fazer oxidase a partir de meios não seletivos;

➔ Leitura imediata até 1 minuto (oxidase positiva
lenta – entre 15 segundos e 1 minuto –B. cepacia);
➔ Deve-se obter um resultado POSITIVO, ou
seja, deve-se obter um pigmento ROXO.
4.2. Triagem inicial:
➢ Definir a via de utilização de glicose:
MEIOS
1) TSI 2) OXIDAÇÃO/FERMENTAÇÃO – OF
+ BGN-NF
Original TOPO DO OXIDATIVO
INERTE FERMENTATIVO
laranja TUBO + BGN-NF
VERMELHO
➔ Indicador: azul de bromotimol

➔ Usa-se um tubo contendo vaselina (ajuda a reduzir a tensão de O2
no meio) e outro não
➔ Inerte: não utilizam glicose como fonte de C (não deixa de ser NF);
➔ fermentativo: usou a glicose como fonte de C – BGN-F;
➔ se os dois ficarem ác/amarelo: fermentadora;
➔ se o tubo amarelo com óleo tiver mais crescimento: não
fermentadora;
➔ se o tubo sem óleo ficar ác/amarelo (ocorreu a aerobiose):
oxidativo - não fermentadora;
➔ sem ácido não muda a cor, mantem-se verde, pois o pH é neutro.
3) MEVAG
➔ Meio para o estudo da via de ataque aos glicídios
➔ Meio menos tamponado para melhor visualização da oxidação pelos BGN NF Indicador é o
vermelho de fenol.
➔ Se o topo do tubo ficar amarelo de cima para baixo, é positivo para BGN-NF, pois utilizou a via
oxidativa.
Este meio é menos tamponado e
detecta facilmente a oxidação É um
meio bom para identificar a
oxidação de outros açúcares que não
a glicose, pois detecta os ácidos
fracos formados
➔ Após fazer os testes para triagem inicial, deve-se seguir para as provas bioquímicas, onde existe alguns
fluxogramas que a distribui e que permitem identificar a bactéria.
➔ Lembrando que, para a escolha do fluxograma, deve-se seguir este roteiro acima antes, além da
identificação morfológica em microscópio, para saber se é um bacilo, cocobacilos ou cocos gram negativos,
que farão total diferença na escolha do fluxograma.
4.3. Provas bioquímicas:
4.3.1. Motilidade:
➔ Aqui é avaliado a capacidade da bactéria em se

locomover, em um meio semi-sólido, onde é inoculado o
MO através de uma picada no ágar e após este meio é
incubado a 25º C, onde realiza-se uma primeira leitura
dentro de 4 a 6h após a inoculação e depois, uma segunda
leitura entre 24 e 48h, para que seja possível a
identificação de cepas com motilidade mais lenta.
➔ A bactéria tem motilidade positiva, quando forma
uma espécie de “nuvem” no ápice do tubo, tanto que
chamamos de “guarda-chuva”.
➔ Já a bactéria que possui motilidade negativa permanece na região a picada.
4.3.2. Redução nitrato:

→ Gás
NITRATO → NITRITO
→ Outros compostos
1) Semear a bactéria no caldo com nitrato e incubar por 48h.
2) Se a redução for completar (positiva), ocorrerá o aparecimento de bolha no tubo de Durhan, se não
ocorrer o aparecimento de bolha (negativa), deve-se utilizar um revelador para que possa identificar se ocorreu
ou não a redução para nitrato.
3) Para a revelação, utiliza-se dois reveladores:
➔ Reativo de Griss A (dimetil alfa naftilamina).

➔ Reativo de Griss B (ácido sulfanílico) → vermelha o meio e indica que ainda há presença de nitrito.
LEITURA E INTERPRETAÇÃO:
a) o nitrato presente no caldo não foi

reduzido
b) o nitrato foi reduzido além do estágio
de nitrito para algum outro composto (
óxido nítrico, óxido nitroso) ou para gás
nitrogênio (nitrogênio molecular: N2)
c) Adicionar zinco em pó: Se o nitrato
ainda estiver presente, será reduzido pelo zinco
e, então, uma coloração vermelha aparecerá
dentro de 5 minutos (redução negativa). Se não
aparecer coloração vermelha significa que
houve redução (redução positiva) total do
nitrato a outros compostos.
4.3.3. Prova de crescimento em caldo:
➔ Crescimento a 44 ºC em TSB (Tripticase Soy

Broth);
➔ Positivo: meio fica turvo;
➔ Negativo: meio se mantem límpido.
4.3.4. Citrato e malonato:
➢ Citrato:
➔ Com a utilização do citrato, CO2 é liberado, este combina-se com o sódio e

água e forma carbonato de sódio → alcalino → azul. O micro-organismo que usa o
citrato como única fonte de carbono também utiliza o sal de amônia como única
fonte de nitrogênio.
➔ CITRATO É MEIO SÓLIDO.
➔ Qualquer crescimento é positivo.
➔ Se o meio ficar azul: citrato positivo → pH alcalino.
➔ Se o meio ficar verde: citrato negativo → pH neutro.
➢ Malonato:
➔ As bactérias ao utilizarem o malonato de sódio, alcalinizam o meio,

provocando mudança na coloração verde do meio para azul.
➔ MALONATO É MEIO LÍQUIDO.
➔ Se o meio ficar azul: malonato positivo → pH alcalino.
➔ Se o meio ficar verde: malonato negativo → pH neutro.
Obs sobre o azul de bromotimol: quando o MO provoca mudanças no meio, em pH ácido o meio fica
amarelo, em pH neutro o meio fica verde e, em pH básico o meio fica azul.
4.3.5. DNAse:
➔ Determinar a capacidade de um micro-organismo em produzir
a enzima desoxirribonuclease.
➔ HCl 1 N precipita DNA íntegro.
➔ Positivo: ocorre a formação de um halo transparente/claro ao
redor do crescimento bacteriano;
➔ Negativo: não ocorre a formação deste halo transparente.
4.3.6. Hidrolise de aminoácidos:
➔ Hidrólise de Aminoácidos: Lisina, Arginina ou Ornitina:

Testar em base de Möeller. Comparar com controle negativo.
Leitura em até 72h.
➔ Positiva: intensificação da cor púrpura (descarboxilação do
aminoácido com aumento do pH).
➔ Nagativo: cor púrpura igual ao controle (meio fica + - c
acinzentado ou amarelo)
4.3.7. Hidrolise da gelatina:
➔ capacidade do microrganismo de excretar uma

enzima hidrolítica extracelular, capaz de degradar a
gelatina (A gelatina é uma proteína produzida pela
hidrólise do colágeno que, abaixo dos 25 ºC, mantém as
suas propriedades de gel e é sólida, enquanto acima dos
25 º C é líquida).
➔ Positivo: se o MO tem a enzima, o meio se torna
líquido;
➔ Negativo: se não tem a enzima o meio se mante
gelatinoso.
5. PARTE DA APOSTILA QUE CORRESPONDE AO CONTEÚDO DE BGN-NF
UNIDADE 5
IDENTIFICAÇÃO DE BACILOS GRAM NEGATIVOS NÃO FERMENTADORES DE GLICOSE
1. INTRODUÇÃO
Bacilos Gram negativos não fermentadores de glicose (BGN-NF) vêm gradativamente adquirindo
importância na bacteriologia clínica, representando importantes agentes de infecções, principalmente em
pacientes imunocomprometidos. Entretanto a identificação bioquímica deste grupo de microrganismos é
bastante complexa, principalmente devido às dificuldades taxonômicas.
2. IDENTIFICAÇÃO
Para identificação destes microrganismos encontram-se descritos na literatura vários esquemas, como
por exemplo, Weaver-Hollis, Gilardi e Pickett; Oberhofer e colaboradores; Romeo, etc. Todos estes esquemas
utilizam-se de meios de cultura padronizados preparados nos laboratórios clínicos ou adquiridos
comercialmente.
Existem também esquemas disponíveis comercialmente, em forma de “kits” ou sistemas compactos de
identificação, como por exemplo: API 20E (bioMerieux Vitek, Inc., Hazelwood, MO); API NFT (bioMerieux
Vitek, Inc., Hazelwood, MO); OXI/ FERM Tube (Becton Dickinson Microbiology Systems, Cockeysville,
MD); N/F system (Remel Laboratories, Lenexa, KS); RapID NF Plus (Innovative Diagnostics Systems, Inc.,
Norcross, GA); etc. São sistemas geralmente simples, baseados em técnicas padronizadas, cujos resultados
reprodutíveis são iguais ou melhores que os procedimentos convencionais.
O principal problema inerente ao uso de muitos dos sitemas compactos para identificação de não
fermentadores é a tendência desses microrganismos apresentarem atividade bioquímica fraca ou tardia, o que
produz reações falso-negativas. O microbiologista deve ter uma experiência considerável para interpretar
certas reações incompletas ou fracas, que podem ocorrer durante o uso desses sistemas.
Existem também os sistemas automatizados capazes de identificar bacilos não entéricos em
concordância variando de 71% a 92% com os métodos convencionais. São exemplos os sistemas: Vitek
(bioMerieux Vitek, Inc., Hazelwood, MO); Autoscan-4; Walkaway-96 e Walkaway-40 (Todos da Dade
Behring, West Sacramento, CA) e Sensititre AP80 Identification (Accumed International, Inc., Westlake,
OH).
Nesta unidade apresentaremos o sistema de identificação de BGN-NF adotado pelo Laboratório de
Bacteriologia Clínica do Laboratório de Ensino e Pesquisa em Análises Clínicas (LEPAC) desta universidade.
Este sistema foi adaptado a partir daquele utilizado no Instituto Adolfo Lutz – São Paulo e emprega
metodologia e meios de cultura padronizados.
2.1 Primeiros indícios de que um isolado desconhecido é um Não-Fermentador
Pode-se suspeitar que um BGN desconhecido pertença ao grupo de não-fermentadores quando se
observa uma ou mais das seguintes características:
1) Ausência de evidências de fermentação de glicose - Reação K/K (ápice e base alcalinos) em TSI ou
ágar ferro de Kligler;
2) Reação de citocromo oxidase- positiva - Os Não Fermentadores podem ser oxidase + ou -. Se a
bactéria for oxidase + podemos excluir a família Enterobacteriaceae (exceção do gênero Plesiomonas spp).
3) Dificuldade de desenvolver-se em meio de Mac Conkey (Não Fermentadores podem crescer ou não
em meio de Mac Conkey. Entretanto se não houver crescimento neste meio podemos excluir a família
Enterobacteriaceae).
2.2. MEIOS EMPREGADOS
2.2.1. Meios Comerciais :
Além dos sistemas compactos e automatizados citados acima, encontram-se disponíveis

comercialmente, meios de cultura avulsos ou sistemas de identificação produzidos por laboratórios nacionais.
2.2.2. Meios de Rotina:
Os meios de cultura aqui apresentados são os empregados em rotina no nosso laboratório.
2.3. IDENTIFICAÇÃO BIOQUÍMICA:
2.3.1. Sistema adotado pelo Laboratório de Bacteriologia Clínica do Laboratório de Ensino e Pesquisa
em Análises Clínicas (LEPAC) desta universidade (FLUXOGRAMA DE IDENTIFICAÇÃO I e II). Este
sistema foi adaptado a partir daquele utilizado no Instituto Adolfo Lutz – São Paulo e emprega metodologia e
meios de cultura padronizados.
2.3.1.1 - Identificação Preliminar

Baseia-se em: morfologia celular, utilização da glicose, atividade de citocromo-oxidase e motilidade
2.3.1.1 a) - Morfologia Celular
Confeccionar esfregaços a partir da colônia isolada, corar pela técnica de Gram e observar a
morfologia: Bacilo, Coco ou Cocobacilo.
2.3.1.1 b)- Prova da Utilização da Glicose
Semear em 2 tubos de meio OF (Hugh e Leifson) glicose ou MEVAG glicose vedando um dos tubos
com vaselina estéril. As tampas de rosca devem ficar levemente fechadas. Incubar a 30 - 35º C por 24 - 48
horas.
2.3.1.1 c)- Atividade do citocromo - oxidase
Utilizando alça de platina colocar a bactéria sobre um papel de filtro. Gotejar o reativo de tetrametil-
p-fenileno-diamina HCl 1%, ou utilizar tiras de oxidase comercial. O aparecimento de cor azul dentro de 10
segundos indica prova positiva.
2.3.1.1 d)- Motilidade
2.3.1.1 d1 - Exame direto (gota pendente):
uma alçada da suspensão bacteriana, obtida de cultivo com crescimento ativo em caldo a 25º C durante
6 a 24 horas, é colocada no centro de uma lamínula que será invertida sobre a concavidade de uma placa
escavada.
Examinar com objetiva de 40 X. A motilidade deve ser diferenciada do movimento browniano e das
correntezas de fluido causadas pela pressão da lâmina. Na verdadeira motilidade os organismos trocam de
posição em relação a eles mesmos, enquanto no movimento browniano e nas correntezas de fluido eles podem
parecer ativos, porém, estão sempre na mesma posição em relação aos outros organismos.
2.3.1.1 d2 - Inoculação em meio de cultura:
Usar um meio semi-sólido de ágar com teor de ágar não superior a 0,3%, para não impedir a difusão.
Inocular os 4 mm superior do meio. Incubar à temperatura ambiente ou 25ºC. Realizar leitura inicial
dentro de 4 a 6 horas. Outra leitura deve ser feita após 24-48 horas a fim de detectar cepas móveis de
crescimento lento.
Se a motilidade é o único critério para identificar uma espécie, torna-se necessário a coloração flagelar.
Os principais gêneros de bactérias, não fermentadoras da glicose, causadores de patologias em
humanos podem ser classificados preliminarmente, baseados nas provas acima, como:
Para identificação bioquímica de bactérias não fermentadoras de glicose, em nível de espécies,

podemos seguir um dos dois esquemas de identificação sugeridos a seguir, partindo-se da morfologia
observada no Gram.
2.3.2 PROCEDIMENTOS PARA IDENTIFICAÇÃO BIOQUÍMICA DE BACTÉRIAS NÃO
FERMENTADORAS (segundo ANVISA, 2005) – curso de treinamento realizado pela Agência Nacional de
Vigilância Sanitária (ANVISA) e Escola Paulista de Medicina da UNIFESP.
A partir de colônia isolada fazer: Gram, oxidase e observar pigmento: amarelo ou rosa.
De acordo com o resultado obtido acima, seguir identificação utilizando as tabelas:
IMPORTANTE:
Rever identificações duvidosas
Oxidase: reações duvidosas repetir com repique novo
TABELA 1A – Cocos ou Cocobacilos Gram negativos, oxidase negativa e motilidade negativa.

MEIOS DE CULTURA UTILIZADOS PARA A IDENTIFICAÇÃO DE
BACTÉRIAS NÃO FERMENTADORAS DA GLICOSE
MEIO DE O-F (HUGH & LEIFSON)
Fórmula:
Peptona 2,0 g
Dextrose 10,0 g
Azul de Bromotimol 0,03 g
Ágar 2,5 g
Cloreto de Sódio 5,0 g
Fundamento:
O meio de O-F (Meio oxidativo e fermentativo de Hugh & Leifson , 1953), é o meio mais apropriado
para a caracterização e identificação dos Não Fermentadores.
Este meio contém 0,2% de peptona e 1% de carboidrato, com taxa de peptona/carboidrato no meio 0,2:
1, em contraste com a taxa de 2:1 encontrada nos meios convencionais utilizados para teste de fermentação
de carboidratos.
Esta baixa concentração de peptona minimiza a formação de aminas alcalinas provenientes da oxidação
da peptona, as quais tendem a elevar o pH do meio podendo neutralizar os ácidos fracos que são produzidos
pelas bactérias Gram negativas Não Fermentadoras. A concentração relativamente alta de carboidrato estimula
o organismo à produção do ácido. A consistência semi-sólida do meio e o emprego do Azul de bromotimol,
como indicador de pH, são fatores que tornam o meio de O-F um sistema mais sensível para a detecção das
pequenas quantidades de ácidos formados pelo metabolismo oxidativo.
Semeadura:
Inocular dois tubos de meio de O-F, sendo que um é selado com 1 cm de vaselina estéril; incubar a
36ºC por 24-48 horas.
Leitura e interpretação:
Produção de ácido (cor amarela) nos dois tubos: FERMENTATIVO.

Produção de ácido (cor amarela) no tubo em aerobiose: OXIDATIVO.
Sem produção de ácido (não muda a cor do meio): INERTE.
M.E.V.A.G.
( Meio para o Estudo da Via de Ataque dos Glicídios)
Fórmula:
Caldo simples 50 mL
KCl 5g
Agar-ágar 3g
Vermelho de fenol (sol.aquosa a 0,2%) 10 mL
Acertar o pH para 7,6-7,8 e autoclavar à 121ºC por 15 minutos.
Manter o meio em Banho-Maria a 56ºC e adicionar 5 mL do carboidrato (solução a 20%) para cada 95
mL de meio pronto.
Distribuir 5 mL em tubo 13 X 100.
Fundamento:
Este meio é menos tamponado e detecta facilmente a oxidação. É um meio bom para identificar a
oxidação de outros açúcares que não a glicose, pois detecta os ácidos fracos formados.
Semeadura:
Inocular dois tubos de meio de MEVAG -glicose , sendo que um é selado com 1 cm de vaselina estéril;
incubar a 36ºC por 24-48 horas. Para os outros carboidratos semear um tubo sem selar com vaselina.
➔ MEVAG – Glicose:
Produção de ácido (cor amarela) nos dois tubos: FERMENTATIVO

Produção de ácido (cor amarela) no tubo em aerobiose: OXIDATIVO
Sem produção de ácido (não muda a cor do meio): INERTE
➔ MEVAG - outros carboidratos:
Produção de ácido (cor amarela) no tubo em aerobiose: OXIDATIVO

Sem produção de ácido (não muda a cor do meio): INERTE
REDUÇÃO DO NITRATO
Fórmula:
Peptona 20,0 g
KN03 2,0 g
Ajustar o pH a 7,0. Distribuir em alíquotas de 4 mL por tubo de 13 X 100 contendo tubos de Durham
invertidos. Autoclavar a 121ºC durante 15 minutos.
Reagentes:
SOLUÇÃO A:
Ácido acético glacial 100 mL

Dimetil-alfa-naftilamina 2,1 g
SOLUÇÃO B:
Ácido acético glacial 100 mL

Ácido sulfanílico 2,8 g
Dissolver os pós na água e então adicionar o ácido acético. Guardar os reagentes A e B em frascos
conta-gotas (escuros), na geladeira.
Semeadura:
Inocular o meio de redução do nitrato com a bactéria em estudo. Incubar a 35-37ºC por 24-48 horas.
Adicionar 0,25 mL de solução A e 0,25 mL da solução B, nesta ordem. Homogeneizar e observar o
aparecimento de coloração (vermelha) dentro de 1 minuto.
O aparecimento de cor vermelha indica a presença de nitrito, então houve a redução do nitrato. Se não
aparecer coloração vermelha significa que:
a) o nitrato presente no caldo não foi reduzido;
b) o nitrato foi reduzido além do estágio de nitrito para algum outro composto (amônia, óxido nítrico,
óxido nitroso) ou para gás nitrogênio (nitrogênio molecular: N2), que deverá estar contido nos tubos de
Durham. Os reativos A e B detectam unicamente nitrito. Para verificar o processo que ocorreu, adicionar uma
pitada de zinco em pó ao tubo com o caldo nitrato após a adição dos reativos A e B. Se o nitrato ainda estiver
presente, será reduzido pelo zinco e, então, uma coloração vermelha aparecerá dentro de 5 minutos. Se não
aparecer coloração vermelha significa que houve redução total do nitrato a outros compostos.
Equação química:
NO3- + 2e- + 2H+ → NO2- + H2O

2NO3- + 10e- + 12H+ → N2 + 6H2O (desnitrificação)
HIDRÓLISE DA ESCULINA
Fórmula:
Peptona 10,0 g
Citrato férrico amoniacal 1,0 g
Esculina 1,0 g
Ágar 20,0 g
Acertar o pH para 7,4 . Autoclavar a 121ºC por 15 minutos.

Distribuir em alíquotas de 3 mL por tubo de 13 X 100.
Deixe esfriar em posição inclinada.
Semeadura:
Inocular a superfície do ágar esculina com uma alçada proveniente do crescimento em meio sólido.
Incubar a 35 - 37º C por 24 - 48 horas.
A esculina, neste meio, é fluorescente sob a luz ultravioleta. Quando ocorre a hidrólise da mesma, o
meio torna-se negro e não mais fluorescerá.
HIDRÓLISE DA GELATINA
Fórmula:

Peptona de carne 0,5 g
Gelatina 12,0 g
água destilada 100 mL
Suspender os componentes em água destilada. Aquecer a 50ºC. Distribuir em tubos,13 X100, 2 a 3 cm

de camada. Esterilizar por 15 minutos a 121ºC.
Semeadura:
Deixar o tubo com o meio de gelatina a 35 - 37º C até que a mesma se torne líquida. Inocule com alça
ou agulha a colônia de bactéria que se quer testar. Incube a 35-37ºC por 24 horas. Retire e coloque na geladeira
por 15 minutos.
Se a bactéria produzir a enzima gelatinase a gelatina se hidrolizará e não se solidificará após ser
colocada em geladeira.
Meio fica líquido após 15 minutos na geladeira → positivo

Meio solidifica-se após 15 minutos na geladeira → negativo
DNase
Princípio:
Determinar a capacidade de um microrganismo em produzir a enzima desoxirribonuclease.
Fórmula:
Triptona 20,0 g
Ácido desoxirribonucleico 2,0 g
Ágar-ágar 15,0 g
Técnica de preparo:
Preparar o meio de acordo com as instruções do fabricante. Autoclavar a 121º C por 15 minutos.
Distribuir assepticamente em placas.
Técnica de semeadura:
Semear fazendo um “risco”, com auxilio de uma alça de semeadura bacteriológica, no meio contido
em placa. Incubar a 35ºC por 24 horas.
Bioquímica envolvida:
Com a produção da enzima Dnase pelo microrganismo, esta é difundida no meio de cultivo, e agindo
sobre o DNA presente no meio, quebrará sua dupla hélice. Ao se fazer a revelação com HCl 1N ocorrerá
precipitação do DNA íntegro, tornando desta forma o meio com aparência turva. Onde não houve precipitação
do DNA, por não estar íntegro, ruptura esta causada pela ação da enzima DNase, não ocorrerá turvação do
meio de cultura, aparecendo desta forma um halo transparente ao redor da semeadura do microrganismo
produtor da enzima.
Leitura
Cobrir toda a superfície do meio de cultura na placa com ácido clorídrico 1N. Aguardar alguns minutos
para fazer a leitura.
POSITIVO: aparecimento de um halo transparente ao redor da semeadura.
CRESCIMENTO EM DIFERENTES TEMPERATURAS (42-44 C)
Meio de cultura empregado:
TSB (normalmente)
Fórmula descrita na UNIDADE 03
Incubação
Estufa específica
Por 24 a 48 horas
PROVAS DE FENILALANINA, CITRATO, MALONATO, INDOL E URÉIA
descritas na UNIDADE 05
PROVA DE DEGRADAÇÃO DE AMINOÁCIDOS PARA NÃO FERMENTADORES
(Arginina, Lisina, etc.)
Princípio:
É o mesmo definido para enterobactérias (UNIDADE 05), entretanto como muitos não fermentadores
apresentam fraca atividade descarboxilase e podem produzir aminas insuficientes para converter o sistema
indicador de pH, mesmo utilizando a base de Moeller (que apresenta uma quantidade menor de glicose em
sua composição), deve-se empregar um inóculo pesado a partir de um crescimento bacteriano ativo. É
essencial inocular um segundo tubo com meio de cultura, sem o aminoácido a ser testado, para servir de
controle durante a leitura. Em não fermentadores a conversão do meio para amarelo, devido ao acúmulo de
ácidos provenientes da degradação da glicose, não é observada. Deve-se cobrir o inóculo, nos dois tubos, com
vaselina, já que a reação de descarboxilase ocorre anaerobicamente.
FÓRMULA – Base de Moeller:
Peptona 5g
Extrato de carne 5g
Púrpura de Bromocresol 0,01g
Vermelho de cresol 0,005g
Glicose 0,5g
Piridoxal 0,005g
Água destilada 1000mL
pH final = 6,0
Aminoácido: Adicionar 10g, para uma concentração final igual a 1%, da forma L (levo) do aminoácido
a ser testado. Dobrar esta concentração se a forma D (destrógena) for usada, já que somente a forma L é ativa.
Técnica de semeadura:
A partir de colônias, recentemente crescidas, inocular 2 tubos de meio, um contendo o aminoácido e o

outro não (tubo controle). Cobrir o crescimento dos dois tubos com vaselina e incubar por 24 a 48 horas. Para
alguns Não-Fermentadores uma incubação mais prolongada (por mais de 5 dias) pode ser recomendada.
POSITIVO: Intensificação da coloração púrpura no tubo teste quando comparado ao tubo controle.
NEGATIVO: Tubos teste e controle apresentam a mesma coloração (fracamente púrpura).
PROVAS DE CRESCIMENTO A 6,5% DE NaCl (MTS), PYR

RESISTÊNCIA A POLIMIXINA E HEMÓLISE
descritas na UNIDADE 06
6) Diagnóstico bacteriológico de infecções urinárias
MICROBIOTA
ORGÃO MICRORGANISMO
RINS E URETERES Normalmente livres de microrganismos
Mulher: muito discutido principalmente devido a
variação das coletas. Lactobacillus, Gardnerella,
Streptococcus (em pequenas quantidades, não
interferem nas culturas tradicionais).
BEXIGA
Homem: Estudos indicam a presença de
Microrganismos variadas espécies em pequena
quantidade.
Porção distal (próxima ao meato urinário)
Staphylococcus epidermidis e outros Estafilococos

coagulase negativa Enterococcus spp. - (CGP)
Corynebacterium spp e Lactobacillus spp. – (BGP)

URETRA
Neisseria spp. (exceto N gonorrhoeae e N
meningitidis) – (CGN)
Enterobacterales como a Escherichia coli, Proteus

mirabilis...
➢ INFECÇÕES DO TRATO URINÁRIO – ITUs – Manifestações Clínicas:
➔ Bacteriúria Assintomática;
➔ Cistite;
➔ Pielonefrite;
➔ Prostatite aguda;
➔ Abscessos Perinéfricos e intra renais;
➔ Urosepsis;
➢ BACTERIÚRIA ASSINTOMÁTICA:
➔ Mulheres: Bacteriúria significativa (≥ 104 - 105 UFC/ml) sem sintomas atribuíveis ao trato urinário,
em 2 amostras de urina coletadas por micção espontânea (jato médio) consecutivamente;
➔ Homem: Bacteriúria significativa (≥ 104 - 105 UFC/ml) sem sintomas atribuíveis ao trato urinário,
em 1 amostras de urina coletadas por micção espontânea (jato médio) consecutivamente
➔ Preocupante em: mulheres grávidas, procedimento invasivo, refluxo vesicoureteral (crianças).
➔ A falta de sintomas é mais comum em: idoso, diabético e pacientes c/ cateter de demora.
➢ MANIFESTAÇÕES CLÍNICAS MAIS COMUM:
❖ Cistite:
➔ Infecção do trato urinário inferior (bexiga);

➔ Conhecida como síndrome disúria frequência (apresentação clássica);
➔ Sintomas que sugerem o envolvimento apenas da bexiga, ou seja, disúria e frequência urinária;
❖ Pielonefrite:
➔ Infecção do parênquima renal;

➔ Febre, dor no flanco, calafrios, náusea, vômito, inchaço;
➔ + Sintomatologia de Infecção em trato urinário inferior;
❖ Abscessos Renais ou Perinéfricos:
➔ Como aparecem: pielonefrite não tratada ou tratada de forma inadequada pode causar supuração,
liquefação e necrose do parênquima que, por fim, leva ao abscesso.
➔ Tipo de paciente: diabetes, doenças crônicas, estado imunocomprometido obstrução do trato urinário
e usuários de drogas intravenosas.
➔ Perirenais: A extensão da infecção para o espaço perirrenal é comum e podem ocorrer abscessos
perirrenais. Coleções extra parenquimatosas podem se estender ao músculo psoas, pelve ou virilha;
❖ Pielonefrite enfisematosa:
➔ Pielonefrite enfisematosa pielonefrite necrosante (grave)

➔ Principalmente em diabéticos (90%) mas também em pacientes imunocomprometidos e pacientes
com obstrução urinária.
➔ O gás é produzido a partir do metabolismo da glicose por bactérias gram negativas (Mais comuns
Escherichia coli Klebsiella pneumoniae e Proteus mirabilis.
❖ Tuberculose renal:
➔ O trato urinário é o local extrapulmonar mais comum de infecção por Mycobacterium tuberculosis.
Resulta da disseminação hematogênica em 15 20 dos casos;
➔ O trato urinário pode estar envolvido, mesmo quando as radiografias de tórax não mostrem evidências
de TB;
➔ Vários granulomas caseosos se formam no córtex por causa de seu fornecimento de sangue favorável.
Estes podem permanecer dormentes ou reativar, espalhando bacilos para os túbulos, resultando em necrose
papilar. A infecção progressiva pode destruir o rim;
❖ Prostatite Bacteriana aguda:
➔ Infecção aguda da próstata que causa dor pélvica e sintomas do trato urinário, como disúria, frequência
urinária e retenção urinária, e pode levar a sintomas sistêmicos, como febre, calafrios, náusea, emese e mal-
estar;
➔ Agentes: mais frequentemente causada por Escherichia coli seguida por Pseudomonas aeruginosa
(associada a procedimentos diagnósticos com manipulação do trato genital) e espécies de Klebsiella
Enterobacter, Proteus e Serratia além de Enterococcus;
➔ Em homens sexualmente ativos, considerar Neisseria gonorrhoeae e Chlamydia trachomatis Pacientes
imunocomprometidos (por exemplo, pessoas com vírus da imunodeficiência humana) são mais propensos a
ter causas incomuns para prostatite como espécies de Salmonella, Cândida e Cryptococcus;
➔ Culturas de urina (primeiro jato ou após massagem protática).
❖ Urosepsis:
➔ Paciente pode ter falência renal, levando a quadros que necessitam de hemodiálise e dialise peritoneal.
➢ EPIDEMIOLOGIA DAS ITUs
➔ ITU é uma das infecções bacterianas mais comum Comunitária ou Hospitalar;

➔ Estimativa mundial 150 milhões de pessoas/ano;
➔ A prevalência de ITU associada à comunidade é de 0 7 Mulheres são mais acometidas (grupo
predominante) Os principais fatores de risco são idade, história de ITU, atividade sexual e diabetes;
➔ A cada ano, 7 milhões de mulheres procuram atendimento ambulatorial por causa de ITUs não
complicadas;
➔ A frequência de ITU associada a cuidados de saúde (é de 12 9 19 6 e 24 nos Estados Unidos, Europa
e países em desenvolvimento, respectivamente;
➢ O Microrganismo poderá atingir o sistema urinário levando a infecção por três vias:
I. Via ascendente:
❖ Pela uretra o microrganismo poderá atingir a bexiga, ureter e o rim. Via mais frequente de infecção.
II. Via hematogênica: Devido a intensa vascularização do rim;
III. Via linfática: pelas conexões linfáticas entre o intestino e o rim e/ou entre o trato urinário inferior e
superior. Via mais rara.
➢ PATOGÊNESE DAS ITUs
➔ O Microrganismo poderá atingir o sistema

urinário levando a infecção por três vias:
IV. Via ascendente: Pela uretra o microrganismo poderá

atingir a bexiga, ureter e o rim. Via mais frequente de infecção.
V. Via hematogênica: Devido a intensa vascularização
do rim;
VI. Via linfática: pelas conexões linfáticas entre o
intestino e o rim e/ou entre o trato urinário inferior e superior.
Via mais rara.
➔ Mecanismos de defesa do hospedeiro:
I. Atividade antibacteriana do fluído prostático – Microbiota;

II. Propriedades antibacterianas da urina – Elevada osmolalidade e baixo pH;
III. Efeito Mecânico da Micção - Descarga urinária;
IV. Integridade Anatômica e funcional - vias urinárias;
V. Propriedades antibacterianas da mucosa do trato urinário – Citocinas, mecanismos antiaderência;
VI. Resposta Imune - Migração leucocitária p/ mucosa vesical (fagocitose)/ Anticorpos IgA e IgG;
➔ Fatores de virulência bacteriano:
I. Adesinas:
o Fimbriais: E. coli Fímbria P;
o Não fimbriais: Afimbrial
Adhesisns (AFA I, AFA II); Dr Adhesin
(receptor é o antígeno Dr do grupo
sanguíneo);
II. Toxinas: Hemolisinas E. coli
III. Estruturais: LPS, Antígenos capsulares
IV. Produção de enzimas: urease do
Proteus spp.
➔ Fatores complicadores:
I. Esvaziamento incompleto da bexiga – Bexiga neurogênica (Diabéticos, idoso);

II. Reconstruções cirúrgicas – bexiga;
III. Cateteres de demora – Cateter vesical (Foley);
IV. Cálculos urinários – Retenção de urina/lesão;
V. Tubos de nefrostomia – Cateteres renais;
➔
➢ ETIOLOGIA DAS ITUs
1. Via ascendente – mais frequentes:
❖ Comunitárias:
➔ BGN -Enterobacterales (E. coli> 80%).

➔ CGP –Staphylococcussaprophyticus(especialmente em mulheres jovens).
❖ Hospitalar
➔ BGN:
▪ E. coli; Klebsiella spp.; Proteus mirabilis; Serratia spp.; outras Enterobacterales.

▪ Pseudomonas aeruginosa; Acinetobacter spp., outros não fermentadores
➔ CGP:
▪ Staphylococcus aureus;
▪ Enterococcus spp.
➔ Leveduras: Candida spp.

2. Via hematogênica:
➔ S. aureus
➔ Salmonella Typhi
➔ Leptospira spp.
➔ Mycobacterium tuberculosis
➔ Candida albicans
➔ Vírus: raramente envolvidos em infecção urinária. Alguns sorotipos de Adenovírus parecem estar
envolvidos com cistite. Poliomavírus JC e BK e citomegalovírus podem ser isolados de urina na ausência de
doença do TU.
➢ DIAGNÓSTICO LABORATORIAL DAS ITUs
➔ Antes do início da antibioticoterapia deve-se atentar ao tipo de coleta do local a ser analisado:
❖ Punção Suprapúbica:
• Método de coleta padrão-ouro(gold standard).

• Coleta feita por um profissional treinado
❖ Urina de jato médio
• Coletar o material em frasco estéril e devidamente Identificado.
- Orientações ao paciente:
• Colher a primeira urina da manhã ou depois de transcorrido no mínimo 3 horas entre uma micção e
outra;
• Lavar rigorosamente os genitais externos com água e sabão (na mulher separar os grandes lábios
mantendo-os separados até o fim da coleta e no homem afastar a glande do pênis);
• Enxaguar bem e enxugar com pano limpo, de preferência gaze;
• Desprezar o primeiro jato, em seguida coletar o jato médio em frasco estéril, adequadamente
identificado, com o nome e registro do paciente. Desprezar o último jato;
• Fechar o frasco assim que a urina for colhida. Enviar a urina imediatamente ao laboratório.
❖ Cateterização direta - Coletores para crianças
• Posicionar adequadamente após correta lavagem dos órgãos genitais externos;

• Fazer a troca a cada 30 min, até que a urina seja colhida.
• Amostra facilmente contaminada pela microbiota.
❖ Cateter de demora (sonda de Foley)
• Colher do local adequado, após correta assepsia (álcool 70%), com agulha e seringa estéreis.
• Colher até 24 h após a troca da sonda, não colher de sonda colocada há vários dias (contaminação).
❖ Cistoscopia ou outro procedimento cirúrgico:
• A cistoscopia (ou uretrocistoscopia) é o exame endoscópico do interior da uretra e da bexiga.

Possivelmente, é o procedimento diagnóstico mais realizado por Urologistas na prática diária. Está indicada
para investigar sintomas e confirmar o diagnóstico de diversas doenças do trato urinário inferior.
• Nesse procedimento, o urologista insere um cistoscópio através da abertura externa da uretra. Quando
o citoscópio está na bexiga é injetado soro fisiológico para expandir a bexiga e permitir a visualização do seu
interior. A cistoscopia pode ser feita no consultório médico ou no centro cirúrgico.
➢ TRANSPORTE DA AMOSTRA
• 2h (países de clima ameno).

• No Brasil, preferencialmente, não ultrapassar 1h ou 24h se refrigerada (não congelar) ou tubos com
meios de transporte (ácido bórico) → Se > 1h de coleta, não refrigerada ou tempo não informado → pedir
nova amostra!
➢ Exames Laboratoriais Rotineiros para detecção de ITUs
❖ Parcial de urina – auxiliar:
• Exame Físico-químico;
• Exame microscópico;
• Hematúria;
• Leucocitúria;
• Cilindros;
• Bacteriúria.
❖ Bacterioscopia de urina não centrifugada:
• 1 ou mais micro-organismos/campo imersão de urina não centrifugada → ≥ 105 UFC/ml de urina → a

partir de esfregaço realizado com 1 gota (10µL) de urina.
❖ Cultura de urina quantitativa:
• Técnica para Semeadura - alça

calibrada:
▪ Alça 1µL (0,001 mL) → Fator = 103 →

Diâmetro = 1,45 ± 0,06 mm
▪ Alça 10 µL (0,01mL) → Fator = 102 →
Diâmetro = 4,0 ± 0,06 mm
• Cuidados na aferição:
▪ Frequência de Calibração: mensal ou sempre que mudar de alça (novo lote);

▪ Procedimento p/ calibração - Colorimétrico ou Ponta de broca:
✓ alça 1µL → passa 54 e não passa 53.
✓ alça 10µL → passa 22 e não passa 21.
• Meios de cultura:
▪ Ágar sangue: meio não seletivo →

pode ser substituído pelo CLED
▪ Ágar MacConkey: meio seletivo,
diferencial para BGN → pode ser substituído
pelo CLED
▪ CLED: meio Cistina–lactose-
eletrólitos deficiente
▪ Ágar Columbia com ácido
nalidíxico: seletivo para CGP;
▪ _____________: visa o isolamento
de MO fastidiosos como o Haemophilus spp.
Outras opções:
▪ BD CHROMagar
Orientation Medium
▪ Laminocultura:
➢ CULTURA DE URINA – PROCESSAMENTO DA URINA
• Comunicação clínico e laboratório e definir o protocolo de acordo com o método de coleta e de sinais
e sintomas clínicos.
❖ Tipos de coleta:
NÃO INVASIVA INVASIVA
Urina de jato médio Cateterização direta

Cateter de demora Punção suprapúbica
Coletor infantil Cistoscopia e nefrostomia
Tipo de alça, meio de cultura Tipo de alça, meio de cultura

e tempo de incubação e tempo de incubação
Alça de 1 µL (0,001 mL)
Alça de 10 µL (0,01 mL)
AS e MC (CLED): Pode acrescentar CNA ou
outro meio para isolar Gram positivos entre Gram AS e MC (CLED)
negativos)
Tempo de incubação: mínimo de 48 h
Tempo de incubação: mínimo de 16h
❖ Gram da gota de urina – NÃO CENTRIFUGADA - No nosso laboratório:
• < 1 micro-organismo/campo imersão → alça 10 µL

• ≥ 1 micro-organismo/campo imersão → alça 1µL
• Semeadura em CLED [Agar Sangue Se observar presença de CGP tipo Estreptococos (em cadeia) no
Gram da gota];
• Incubação: 16 a 24 h → Se com 24 h de incubação → cultura negativa com presença ≥ 1 bactéria/campo
no Gram → reincubar por mais tempo.
❖ Interpretação – contagem de colônias:
• Para liberar o resultado em UFC/mL de urina:
Alça de 1µL Alça de 10 µL

multiplicar o número de colônias por 103 multiplicar o número de colônias por 102
1µL = 0,001 mL 10µL = 0,01 mL
O que escrever como resultado O que escrever como resultado
Alça de 1µL → x 103 → XXX UFC/mL Alça 10µL → x 102 → XXX UFC/mL
❖ Interpretação – usando normas padronizadas:
URINA NÃO INVASIVA

Cultura c/ 1 tipo de bactéria Cultura c/2 tipos de bactéria Cultura c/ ≥ 3 tipos de bactéria
1 isolado
≥ 104 1 isolado ≥ 105
Ambos Ambos UFC/ mL UFC/ mL
em contagem em contagem Diferente
≥ 10 4
< 10 4
≥ 10 4 UFC/mL < 10 4 UFC/mL disso
UFC/mL UFC/mL 1 isolado e outros < 104
< 104 UFC/ mL
UFC/ mL
resultado resultado resultado resultado resultado resultado resultado
Valorizar Valorizar
o isolado Valorizar o
Não Não
Identificar a bactéria e Não valorizar valorizar ≥ 104 isolado
valorizar Valorizar
fazer antibiograma
UFC/ mL ≥105 UFC/mL
(TSA)
(se apropriado)
URINA INVASIVA
Cultura c/ 1 tipo de bactéria Cultura c/2 tipos de bactéria Cultura c/ ≥ 3 tipos de bactéria
1 isolado
≥ 103 1 isolado ≥ 104
Ambos Ambos UFC/ mL UFC/ mL
em contagem em contagem Diferente
≥ 10 3
< 10 3
≥ 10 3 UFC/mL < 10 3 UFC/mL disso
UFC/mL UFC/mL 1 isolado e outros < 103
< 103 UFC/ mL
UFC/ mL
resultado resultado resultado resultado resultado resultado resultado
Valorizar
o isolado Valorizar o
Não Não
Valorizar Não valorizar valorizar ≥ 103 isolado
valorizar Valorizar
UFC/ mL ≥ 104 UFC/mL
(se apropriado)
➢ IDENTIFICAÇÃO DO MICRORGANISMO:
➢ DIAGNÓSTICOS DAS ITUs – RESULTADO: como escrever na prova
Alça de 1µL Alça de 10µL

Material: Urina Material: Urina
Cultura: Negativa Cultura: Negativa
Contagem de colônias: Inferior a 10 UFC/mL de Contagem de colônias: Inferior a 102 UFC/mL de
3
urina urina
Material: Urina
Material: Urina
Cultura: Desenvolvimento de bacilos Gram
Cultura: Desenvolvimento de cocos Gram positivos
negativos com caracteres bioquímicos de
com caracteres bioquímicos de Enterococcus
Escherichia coli.
faecalis.
Contagem de colônias: Superior 105 UFC/mL de
Contagem de colônias: 7,0 X 10 4 UFC/mL de urina
urina

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1) Introdução a bacteriologia

COMO É FEITA A COLORAÇÃO DE RECOMENDAÇÕES:

• Normalmente livres - Lactobacillus • Placa dentária: 1011 bactérias/mg;

CATALASE POSITIVA CATALASE NEGATIVA ANAERÓBIOS

1. EM QUAIS MEIOS DE CULTURA OS CGPS CRESCEM?

a) AS, AC, MC, CLED e Chapman

2. CRESCIMENTO DE CGP EM MEIO DE CULTURA:

3. IDENTIFICAÇÃO DE ESTAFILOCOCOS EM MEIOS DE CULTURA:

3.1. Coloração de gram:

➔ A realidade é bem diferente

✓ Utiliza-se o Peróxido de hidrogênio 3%

Para os Staphylococcus a catalase é a POSITIVA e para os Streptococcus a catalase é a NEGATIVA

3.2.1. Provas bioquímicas para CATALASE POSITIVA (+) - STAPHYLOCOCCUS

➔ Padronização de McFarland (tubo 0,5): A escala de McFarland é um

➔ Finalidade prova da coagulase? Determinar a capacidade de um micro-

Classificação de interesse médico

➔ Determina a habilidade de um micro-organismo em produzir acetoína a partir da

2) Prova da maltose e manitol:

➔ Microbiota da pele e mucosas de mamíferos e pássaros

4.2. FATORES PREDISPÔNENTES A DOENÇAS

4.4. ALGUMAS DOENÇAS CAUSADA PELO Staphylococcus aureus:

4.5. Família Micrococcaceae

5. GENERALIDADES DO Estafilococos coagulase-negativa (ECN):

➔ Antigamente considerados como contaminantes;

3) Identificação de CGP – Estreptococos e enterococos

➔ Tanto os Streptococcus spp. quanto os Enterococcus spp. possuem catalase NEGATIVA!!

1. CARACTERISTICAS DO STREPTOCOCCUS SPP.

➔ CGP – catalase negativa;

2. GRUPOS PERTENCENTES AOS ENTEROCOCOS E ESTREPTOCOCOS

3. PROVAS BIOQUÍMICAS PARA OS GRUPOS α, β e γ – HEMOLÍTICO PARA CATALASE (-):

OPTOQUINA BILE SOLUBILIDADE

AMBOS OS TESTES PODEM DAR RESULTADO

NEGATIVO POSITIVO SENSÍVEL RESISTENTE

4. SEMEADURA PARA A AULA

➢ Hipurato: dispersar colônias da bactéria no tubo (incubar 2 h);

5. CONCEITOS DAS PROVAS BIOQUÍMICAS PARA AULA

PROVA BIOQUÍMICA DEFINIÇÃO IMAGEM E RESULTADO

Capacidade da bactéria em produzir

Habilidade de hidrolisar a esculina

A atividade hemolítica da beta lisina

Capacidade de hidrolisar o Hipurato

Determina a presença de enzima

Crescimento em presença de alta

Enterococcus faecalis cresce

Prova dos 6 açucares: sorbitol,

UNIDADE 6 - IDENTIFICAÇÃO DE COCOS GRAM POSITIVOS

Teste rápido em lâmina a temperatura ambiente.

PRINCÍPIO: Verificar a presença da enzima catalase.

H2O2 + H2O2 → 2 H2O + O2

POSITIVO: Formação imediata de bolhas de gás.

2) Com um swab, espalhe a suspensão do microrganismo em uma placa de ágar sangue;

4) Incube a placa em estufa a 35 ºC por 18 a 24 horas.

SENSÍVEL: Considerar qualquer halo de inibição de crescimento como sensível.

PRINCÍPIO: Determinar a capacidade de um microrganismo em coagular o plasma pela ação da enzima

Recomenda-se, de preferência, utilizar plasma de coelho com EDTA (disponível comercialmente em

5) Se não houver formação de coágulo em 4 horas, incubar por 24 horas.

POSITIVO: Forma um coágulo ou filamentos de fibrina definidos.

Qualquer grau de coagulação se considera positivo.

NEGATIVO: Não há formação de coágulo. A suspensão se mantém homogênea

PRINCÍPIO: Determinar a habilidade de um certo moicrorganismo em produzir um composto neutro, o

FÓRMULA - VM/VP (Clark e Lubs)

Reagentes Empregados (reativos de Barrit):

1. Solução alcoólica de alfa-naftol a 5%: dissolver 5g de alfa-naftol em 80 mL de álcool etílico