Histotecnologia I

2ºano
1ºsemestre

Andreia Horta; Catarina Ferraz

2021-2022
 Elaboração de Soluções – Conceitos Gerais
Notas:
• O corante basófilo (hematoxilina) tem afinidade para corar de roxo, estruturas ácidas,
como o núcleo e a cartilagem. Por outro lado, o corante acidófilo (eosina) tem afinidade
para corar estruturas básicas, como o citoplasma.
• O fixador mais utilizado é o Formaldeído, que se trata de um gás e sendo também um
soluto.
• A solução aquosa constituída por Formaldeído (gás) + H2O denomina-se por
formalina/formol [g/l], sendo esta um fixador universal.
• No máximo o formaldeído só consegue estar dissolvido na água de 37%-40%.

Soluções
Existem três tipos de soluções:
• Verdadeira
• Coloidal
• Suspensão
Em geral, nesta cadeira, elaboramos soluções verdadeiras (ou simplesmente
designadas por soluções).
• Soluções verdadeiras ou Soluções → Mistura homogénea de duas ou mais substâncias
(solvente e solutos) que constituem uma só fase.
• Solvente ou Meio ou Fase dispersante → É o componente que satisfaz uma das
condições, pela ordem seguinte:
o Ter o mesmo estado físico que a solução;
o Ter maior quantidade de substância (nº de moles).
• Soluto ou Fase dispersa → Ou não tem inicialmente o mesmo estado físico da solução
ou está em menor quantidade.

Soluto Solvente Estado físico da mistura Exemplos

Líquido Líquido Líquido Etanol (etanol + água)

Sólido Líquido Líquido Água do mar (NaCl + H20)

Gás Líquido Líquido Bebidas gaseificadas (CO2 em refrigerantes)

Gás Gás Gás Ar atmosférico

Gás Sólido Sólido H2 dissolvido em paládio metálico

Sólido Sólido Sólido Ligas metálicas (bronze – Cu/Zn; solda – Sn/Pb)

Líquido Sólido Sólido Amálgama de dentista – Hg/Zn

Uma solução poderá ter mais do que um soluto, mas tem, apenas, um único solvente.

Existem soluções nos três estados físicos: sólido, líquido e gasoso.

 Apesar de existirem soluções sólidas, líquidas ou gasosas, habitualmente o termo
solução aplica-se mais aos sistemas em que o solvente é um líquido.

As soluções em que o solvente é a água são designadas soluções aquosas.

Concentrações
A concentração de uma solução exprime a composição quantitativa dessa solução.
Existem várias formas de exprimir a concentração das soluções:

• Massa de soluto por unidade de volume de solução.

• Massa de soluto por unidade de massa da solução.
• Concentração molar ou molaridade.

Existem outras formas de expressar a composição quantitativa:

• Rótulo de etanol: 96% em volume.

o Significado: existe 96 ml de etanol e 4 ml de água em cada 100 ml (%V/V).

Notas:

✓ Os álcoois mais utilizados são os de 70%, 96% e 100%.

✓ Em soluções é importante utilizarmos água destilada, porque esta mantém o pH de
uma solução neutro, não o modificando e não alterando, assim, a solução/reação.

Outras formas de exprimir a concentração das soluções são:

• Percentagem em massa
• Percentagem em volume
• Percentagem em massa/volume
• Partes por milhão (ppm) e por bilião (ppb)
• Fração em quantidade de substância ou fração molar
• Molalidade de um soluto
• Normalidade

Normalidade
Trata-se de uma unidade mais antiga para concentração que caiu em desuso, sendo
pouco utilizada na prática escolar, mas muito utilizada na indústria. Expressa a composição de
uma solução em equivalentes grama por decímetro cúbico de solução.

A determinação do equivalente-grama depende do tipo de reação química (ácido-base,

oxidação-redução) em que os reagentes intervêm.

Classificação de Reagentes
Os reagentes podem ser classificados do menor para o maior grau de pureza como:
técnicos, puros, para-análise, cromatograficamente puros ou espectrograficamente puros.

• Técnicos → Destinados a fins industriais correntes, com um grau de pureza não muito
elevado;
 • Puros → Destinados a preparações laboratoriais correntes, que não envolvam técnicas
especiais de análise.
• Para-análise (p.a. e p.a. Plus) → Destinados a análises exigentes, indicam teores
máximos de impurezas;
• Cromatograficamente puros → Destinados a processos analíticos altamente sensíveis,
como a cromatografia;
• Espetrograficamente puros → Destinados a análise espetroscópica, sendo o grau de
pureza ainda superior aos anteriores.

Um aumento do grau de pureza de um reagente corresponde a um aumento

exponencial do seu custo (quanto mais puro for um reagente mais caro ele é).

É por isso que, na elaboração de soluções, em diluições, são usados reagentes com
graus de pureza inferior a 100%. Por exemplo, para diluirmos o etanol utiliza-se,
preferencialmente, o etanol a 96%, por ser bastante mais acessível.

Assim, a escolha de um reagente para um determinado trabalho deve ser feita de acordo
com as exigências desse mesmo trabalho.

Em histotecnologia costuma-se utilizar mais frequentemente os reagentes técnicos,

puros e os para-análise.

Preparação de Soluções
O manuseamento de reagentes implica o conhecimento das normas de segurança a
respeitar, bem como as propriedades próprias do soluto que obrigam a procedimentos
particulares, nomeadamente o trabalho na hotte, uso de luvas, etc.

As soluções podem ser preparadas a partir:

• Uma substância primária de massa rigorosamente pesada, dissolvida num solvente

apropriado e diluída, em balão volumétrico, até à capacidade pretendida.
• Soluções de concentração rigorosamente estabelecida e existentes no mercado em
ampolas hermeticamente fechadas, que se diluem em balão volumétrico.
• Soluções que foram tituladas com uma substância primária ou com uma solução-
padrão.

Cálculo da Quantidade de Composto

• Conhecidos a concentração e o volume da solução a preparar, calcula-se a massa ou o

volume de soluto necessários.
• É fundamental saber ler e interpretar as informações contidas no rótulo do frasco do
reagente a usar.

Cálculo de Soluções

Medição:

Para a medição de uma massa usa-se: Para a medição de volumes usa-se:

• Balança de precisão (precisão +/- 0,01g) nos • Provetas para medições não rigorosas.
casos correntes. • Pipetas para medições rigorosas.
• Balança analítica (precisão +/- 0,0001g), • Balões volumétricos para diluições
para medições rigorosas. rigorosas.
 Dissolução/Diluição: Após a pesagem do soluto sólido, finamente dividido, adiciona-se a uma
parte do solvente. Adiciona-se em seguida o resto do solvente para completar o volume final
pretendido.

Homogeneização: Agita-se a solução preparada para completa homogeneização.

Armazenamento:

As soluções devem ser sempre transferidas e guardadas em frascos apropriados e

devidamente rotulados.

Soluções de hidróxidos, amoníaco e EDTA devem guardar-se em frascos de polietileno.

Por outro lado, soluções de Ácido nítrico, Nitrato de prata, Iodetos de potássio ou de sódio
guardam-se em frascos de vidro escuro (pois podem alterar-se com a exposição à luz solar).

Nota: Os rótulos devem indicar quando e por quem foi feita a solução, bem como os elementos
que a constituem.

Cálculo de Soluções – Diferenciador da Hematoxilina

Trata-se de uma coloração Corante nuclear, pois

regressiva, pois coramos por
excesso/ a mais após a
aplicação da hematoxilina e
vamos removendo permitindo
diferenciar as estruturas para
as quais o corante tem maior
afinidade das que têm menos.
cora estruturas ácidas
como o núcleo a roxo.
O diferenciador trata-se do
álcool clorídrico, sendo este
formado por:
Etanol a 70% (solvente) + HCl a
1% (soluto).

Nota: A concentração de ácido clorídrico normalmente usada é de 0,5% ou 1%, estas

concentrações são baixas para que o processo seja mais lento (aproximadamente 7 segundos) a
fim de se ter maior capacidade de controlo e de atuação no mesmo. Assim, os processos de
diferenciação devem ser lentos para poderem ser controlados.

Álcool clorídrico a 0,5% ou a 1% constituído por:

• Etanol a 70% (solvente)

• HCl a 1% (soluto).

Exercício:
a) Queremos fazer uma solução de 1L de álcool clorídrico a 1%.

Ci × Vi = Cf × Vf ⇔ 100 × Vi = 1 × 1000 ⇔ Vi = 10 ml de HCl

Vf = 1000 ml
Vetanol = 1000 − 10 ⇔ Vetanol = 990 ml ETOH 70%
R: Para prepararmos esta solução necessitamos de 990 ml de etanol
a 70% e 10 ml de HCl.
 b) No laboratório houve uma rutura de stock do álcool a 70% e só há de 96% e de 100%.
Qual utilizamos, porquê e como se prepara a solução?

• Etanol a 100%:

Ci × Vi = Cf × Vf ⇔ 100 × Vi = 70 × 990 ⇔ Vi = 693 ml de ETOH a 100%

Nota: Ainda é necessário adicionar água destilada para chegar à solução desejada.

Vágua destilada = 990 − 693 ⇔ Vágua destilada = 297 ml de água destilada

Assim, para preparamos uma solução de 1L de álcool clorídrico a 1%, tendo apenas
disponível etanol a 100%, necessitamos de 693 ml de álcool a 100%; 297 ml de água destilada e
10 ml de HCl.

• Etanol a 96%:

Ci × Vi = Cf × Vf ⇔ 96 × Vi = 70 × 990 ⇔ Vi = 721,88 ml de ETOH a 96%

Vágua destilada = 990 − 721,88 ⇔ Vágua destilada = 268,13 ml de água destilada

Assim, para preparamos uma solução de 1L de álcool clorídrico a 1%, tendo apenas
disponível etanol a 96%, necessitamos de 721,88 ml de álcool a 100%; 268,13 ml de água
destilada e 10 ml de HCl.

R: É preferível usar o álcool a 96%, pois de um ponto de vista económico é mais barato que o
álcool a 100%, uma vez que quanto maior é o grau de pureza mais caro o álcool é.

Fixação
• É a primeira etapa histotécnica após colheita do material biológico.
No entanto, em alguns livros há contradições, porque consideram como
primeira etapa o processamento histológico, defendendo que a fixação não faz parte da
histotécnica.
• Os tecidos vivos são sistemas dinâmicos que respondem à presença ou à ausência de
estímulos.
• Visa a preservação dos tecidos.
Os tecidos estão inseridos em sistemas vivos com homeostase, estando sempre
a receber quer a nível nutricional, hormonal, etc., estímulos. Quando um tecido é
removido vivo vai entrar em necrose (sem estímulos o tecido morre, quando morre dá-
se a morte celular e ocorrem reações).
 A nível da anatomia patológica o que se deseja é que os tecidos estejam
preservados para que o diagnostico seja feito num tecido que mimetize o tecido em
estado vivo, se não estiver preservado podem-se dar alterações celulares tendo como
consequência não se poder fazer um diagnostico com base neste tecido. Logo, esta
etapa da fixação é muito fundamental. *
• É uma etapa crucial. *
• Uma má fixação compromete todo o trabalho posterior, uma vez que é impossível
reconstituir um tecido mal preservado. Um tecido que não seja num determinado
tempo fixado para depois ser preservado, encontra-se num processo irreversível, pois
sem fixação e preservação dão-se reações irreversíveis e depois disto não há nada que
se possa fazer.

A nível patológico, seja patologia benigna ou maligna cada uma delas vai ter as suas
particularidades. Os núcleos podem estar irregulares ou picnóticos, há sempre relação núcleo
citoplasma transformada. Nas células o processo neoplásico ocorre a uma velocidade rápida,
pois ao nível do ciclo celular os check points acabam por estar todos a ser passados. Podemos
ainda ter a nível patológico núcleos grandes, pois ocorre uma enorme síntese nuclear para se
produzir cada vez mais células.

Princípios Gerais da Fixação

Imobilização de Células e Tecidos
• Depois de removido, um órgão ou tecido começa imediatamente
a sofrer alterações (o tempo que ocorre desde a remoção até à
colocação do tecido em fixador ou outro método de fixação deve
ser o mais curto possível), pois todas as vigilâncias que existiam
para evitar a autólise das células desaparecerem e as enzimas
começam a digerir as membranas proteicas.
• Para o seu estudo devem ser recriadas as condições que existiam
no seu ambiente de origem, tendo em atenção que não podem ser
idênticas, porque não existem estímulos hormonais.
• A fixação deve promover a máxima semelhança entre o aspeto do tecido visto ao
microscópio e o seu aspeto no estado in vivo.

Nota: Biopsia – remoção de um pequeno fragmento de tecido com vista o diagnostico.

Inibição da Autólise Tecidular

• Ocorre devido a algumas enzimas presentes continuarem os seus processos metabólicos
– autodigestão enzimática.
• Instabilidade da membrana lisossómica causada por fatores físicos e/ou químicos
promove a sua rutura.
• Libertação enzimática → digestão da parte orgânica da célula e, consequentemente, a
sua destruição.
• O grau menor ou maior de autólise depende da localização, natureza e temperatura
ambiente que o tecido se encontra (o aumento da temperatura acelera as reações).

Exemplo: pâncreas, fígado, cérebro (órgãos com conteúdo enzimático elevado, logo entram em
autólise com maior facilidade quando o tecido é removido do seu sistema dinâmico).
Efeitos da Autólise

Área necrótica à esquerda de um seminoma (neoplasia

maligna dos túbulos seminíferos)

Inibição da Putrefação Tecidular

• Putrefação é a destruição dos tecidos por ação microbiana, por efeito de toxinas e
enzimas bacterianas.
• Após a extirpação as defesas do organismo contra os microrganismos, incluindo os que
constituem a flora normal.
• Os órgãos mais sujeitos são aqueles que possuem uma flora normal abundante, como o
intestino.
• Elevada influência da temperatura.

Órgãos mais sujeitos a putrefação: estômago, vesicula biliar (estes 2 órgãos, por
exemplo, têm presentes muitas enzimas e, por isso, entram em autólise mais rapidamente),
intestinos (tem microbiota normal, onde estão presentes bactérias que equivalem a 2 Kg do
nosso peso corporal, devido a estas bactérias entram em putrefação mais rapidamente).

Nota: O nosso sistema imunitário está sempre em alerta, logo mesmo tendo bactérias no nosso
corpo há certos limites no mesmo que fazem com que as bactérias não provoquem putrefação
in vivo.

Efeitos da Putrefação

Coloração muito difusa, há vacuolização (devido a

produção de ar por parte das bactérias)
Solidificação do Material Coloidal
• As macromoléculas estão presentes nos tecidos no estado coloidal (suspensão).
• A fixação induz a novas ligações entre as macromoléculas e provoca a sua solidificação.
• As soluções são transformadas em géis estabilizados (ex.: quistos – estes não são
sempre líquidos).

Exemplo: Quisto ovárico

Endurecimento dos Tecidos

• O endurecimento dos tecidos é desejável desde que não seja muito acentuado, porque
permite a manipulação das peças sem as danificar.

Nota: Na fixação ocorre uma mudança de cor.

Modificação dos Índices de Refração

• Os vários elementos tecidulares têm um índice de refração homogéneo, logo é
impossível diferenciá-los em cortes não corados.
• A fixação modifica o índice de refração dos tecidos de forma não uniforme, permitindo
distinguir certos detalhes celulares mesmo antes da coloração.

Modificação do Volume
• A fixação modifica de forma mais ou menos pronunciada o volume dos tecidos.
 • Esta modificação é maior ou menor
consoante a quantidade de água que
constitui o tecido e a diferença da pressão
osmótica entre o fixador e os tecidos.
• Qualquer que seja o fixador, o tecido sofre
nas fases seguintes uma retração, que anula
os efeitos de inchaço derivados da fixação.

Nota: A água tem de sair para que possa entrar o

fixador.

Insolubilização dos Constituintes Celulares

• Utilizar fixadores que não conduzam à solubilização de determinada estrutura ou
substância que se pretende estudar (queremos que as substâncias sejam insolúveis no
nosso fixador).
• Exemplo: preservação de glicogénio no endométrio (fixador alcoólico preserva melhor
glicogénio).
o A retenção de glicogénio e alguma glicose deve-se à ação de uma rede proteica
formada durante o processo.
o As formas menos polarizadas de glicogénio serão dificilmente fixadas por
fixadores de rotina.
o As formas mais polarizadas são retidas por uma variedade de fixadores.
• Exemplo: Carnoy (fixador de base alcoólica), a formalina também preserva glicogénio,
mas não em todas as formas.

Modificação das Afinidades Tinturiais

A fixação pode ter um efeito positivo ou negativo na coloração, ex.: Ácido acético
(fixador rápido e muito utilizado) e a fixação dos ácidos nucleicos.

• Positivo: separa os ácidos nucleicos das histonas libertando os grupos reativos (fosfatos)
facilitando a sua deteção (no caso da hematoxilina ela ligava-se ao núcleo das células
devido à presença do ácido fosfórico).
• Negativo: se a fixação for longa extrai os ácidos nucleicos e anula o seu estudo. Há
basofilia nuclear.

Nota: Ácido acético – usa-se numa mistura e dá uma coloração nuclear mais brilhante.

Métodos da Fixação
Existem diversos métodos de fixação, que podemos dividir de forma geral em:

• Métodos Físicos
• Métodos Químicos

Os métodos físicos baseiam-se essencialmente na temperatura:

• Frio
• Calor

Métodos Físicos – Frio

 • Baseia-se essencialmente na congelação do tecido como forma de preservação (e não
de fixação).
• Utilizado para o estudo morfológico e/ou funcional – conserva o conteúdo enzimático
(as enzimas num agente químico, neste caso na fixação, perdem a sua estrutura
quaternária e terciárias e ficam imoveis, se queremos estudar a sua atividade não
podemos fazer uma fixação com um químico, portanto para fazer estudos
histoenzimáticos necessitamos de recorrer ao frio e cortes congelação) e antigénico do
tecido (uso de imunofluorescência para os estudar através de anticorpos específicos
para aquele antigénio, o formaldeído que vai fixar a amostra por adição de pontes de
metileno, vai mascarar o antigénio).
• A congelação deve ser instantânea para ser boa.
• A congelação lenta e progressiva provoca a formação de cristais nos tecidos.
• Utiliza-se a congelação, também, na conservação de cadáveres em câmaras frigoríficas.

Nota: Exames extemporâneos peroperatório – exames que ocorrem quando o paciente está no
bloco a fazer uma cirurgia. Após removido o que se tem de estudar, para ver se se tem de retirar
mais ou não, faz-se um corte de congelação para fazer um diagnostico imediato. Exemplo:
cancro da mama, tiroide.

Pode-se diferenciar os seguintes métodos no frio:

• Congelação instantânea por imersão em isopentano.

• Criodissecação ou Liofilização.
• Criossubstituição.

Criodissecção ou Liofilização
• Arrefecimento instantâneo em nitrogénio líquido.
• A água é removida numa câmara de vácuo a - 40°C (sublimação).
• Conserva na íntegra a estrutura antigénica.
• O tecido pode ser fixado em FA (formaldeído).
• Técnica restrita em laboratórios de investigação.

Criossubstituição
• Envolve a rápida congelação até aos –160°C em isopentano.
• Os tecidos são imersos em acetona (altamente volátil, portanto evapora rapidamente
dos tecidos) e álcool, por exemplo, que removem a água lentamente através da
dissolução dos cristais gelados que se formam com a congelação do material.
• O aumento gradual de temperatura até aos 4°C termina eficazmente a fixação.
• As peças são cortadas no crióstato ou criomoto e são mantidas a essa temperatura.
• É fácil, conveniente, seguro, e fácil de implementar em laboratório.

Métodos Físicos – Calor

• Acelera as reações.
• Altera profundamente os tecidos → evitar.
• Utilizado em casos de diagnóstico imediato.
• Eventual fixação de esfregaços na chama → Gram (técnica muito antiga, mas ainda
utilizada, que permite distinguir gram positivos de negativos).
 Passamos a lamina com o esfregaço na chama do bico de bunsen para acelerar
a reação, que vai ser uma reação para abrir os poros da parede celular das bactérias
para que os corantes penetrem com maior eficácia.
É uma eventual fixação, até não devendo ser utilizada, porque se deixarmos um
bocado mais no período de permanência não é necessário calor para o corante penetrar
a célula, para além disso estar a aquecer estes componentes que tem fenol presente
não é nada saudável, portanto este método apesar de ser bom para acelerar reações,
não é muito recomendado.
• O seu uso maioritário prende-se com a necessidade de acelerar certas reações celulares
ou as reações entre o fixador e o tecido.
• Utilização de forno de MW.

Microondas
• Biópsias de pequeno tamanho.
• Solução isotónica de NaCl.
• Fixação pela ação das MW durante 3 a 5’.
• Preservação de antigénios.
• Podem ser utilizadas soluções fixadoras, como a formalina → calor aumenta a
volatilidade.
• Microondas com temperatura.

Métodos Químicos
• Mais utilizado em AP (anatomia patológica).
• Consiste na utilização de agentes químicos, normalmente líquidos, designados de
fixadores.
• Diferentes tipos de fixação:
o Vapores
o Perfusão
o Imersão (mais utilizado)

Tipos de Fixação
Vapores (métodos mais antigos a grande tecnologia está mesmo no forno de mw)
• Aquecimento do fixador.
• Coloca-se o tecido a fixar por cima do fixador.
• A libertação de vapores vai provocar a fixação da peça.
• Aplicações:
o Tecidos preservados por criodissecação ou liofilização.
o ICQ (imunocitoquímica).
o Estudos de fluorescência para anticorpos.
 o Demonstração de enzimas hidrolíticas.
o Estudos ultraestruturais (utiliza-se estes fixadores em microscopia eletrónica):
▪ Formaldeído (aldeído mais simples cor transparente)
▪ Glutaldeído (dialdeído, molécula mais estável que o 1º)
▪ Tetróxido de ósmio (cor preta)

Perfusão
• Técnica utilizada em animais de experimentação vivos.
• Consiste na “injeção” de líquido fixador no sistema
circulatório com o animal anestesiado – permite um estudo
mais in vivo possível.
• Em AP utiliza-se uma técnica similar à perfusão, ex.: na
árvore brônquica.
• Pseudo-perfusão – técnica ex vivo (células já saíram do seu
sistema dinâmico); injeção de fixador na árvore brônquica,
fixação de fora para dentro – se não fixarmos o suficiente
ao cortar no meio o corte ainda está em sangue.

Imersão
Dos métodos mais utilizados. Consiste em emergir
completamente o tecido no líquido fixador (tecido tem de estar
todo em contacto com o líquido fixador senão o fixador não consegue atuar).

Existem fatores que influenciam a fixação por imersão:

• Intervalo entre a colheita do material e a fixação – o intervalo deve ser o mais curto
possível para inibir fatores tal como a putrefação e autólise, para ficar o mais perto
possível do seu estado vivo no nosso caso usamos o tecido ex vivo.
• Rapidez de penetração do fixador.
• Volume do líquido fixador.
• Espessura do material biológico.
• Consistência dos tecidos.
• Tempo da fixação.
• Concentração do fixador.
• Temperatura.
• pH.
• Lavagens pós-fixação.
• Pressão Osmótica.
• Tipo de Fixador.

Intervalo entre a Colheita e a Fixação

Material Biológico
• O mais rápido possível.
• Recipientes adequados e com líquido fixador.
• Câmara frigorífica na preservação de cadáveres.
 • Para fixar uma peça, normalmente, leva-se 24h, logo no laboratório de anatomia
patológica acondiciona-se a peça de forma a potenciar a fixação.
• Cuidados de fixação a ter em situações especiais: pulmão; mama; intestino; estômago.
 Pulmão: Quando se coloca o pulmão num líquido fixador ele flutua por estar
cheio de ar. Faz-se, portanto uma pseudoperfusão onde injetamos fixador
através da árvore brônquica para começar a fixar de dentro para fora, para além
disso também se coloca gazes embebidas em formalina na superfície do pulmão
para fazer peso com finalidade deste ficar totalmente submerso.
 Mama: A mama pela sua constituição em adipócitos é também um órgão com
tendência a flutuar, além disso a mama é um tecido difícil de trabalhar, porque
dificulta a penetração pelos reagentes (ex. formalina, etanol, parafina) e como
consequência acaba por haver um processamento mais alongado para a fixar.
Para resolver a fixação neste caso, fatia-se a mama em cortes paralelos e
abrimos para que o fixador para além de penetrar pela superfície externa
também penetre através de novas superfícies de corte feitas (isto acelera a
fixação). A mama originalmente não tem corte nenhum, mas a tendência
quando se fazem estes cortes na mama é que o tecido se volte a unir, para se
evitar isto coloca-se gazes entre os cortes seriados da mama de forma que eles
não fechem e colocam-se gazes na superfície para que fique submersa.
Órgãos tubulares:
 Intestino: quando este órgão chega a AP normalmente é cortado e depois ou
coloca-se gazes no meio do lúmen de forma que este não enrole entre si e
dificulte a fixação ou então estica-se o intestino numa placa de forma que seja
fixado.
 Estômago: processo igual ao do intestino.

Nota: Temos um fragmento colocado num líquido fixador e o fixador vai atuar da superfície
externa para a interna. Se for um fixador com um fraco poder de fixação vai demorar muito
tempo a fixar o centro do tecido. Nós não queremos isto, pois acaba por ser uma zona não
representativa para dar o diagnóstico, o que fazemos então são cortes seriados transversais para
que o fixador possa penetrar no interior do tecido também. O objetivo é mesmo aumentar a
superfície de contato.

Existem 3 tipos de fontes de material biológico (podem ser de qualquer tecido do corpo
humano e também peças inteiras):

• Necropsias ou Autopsias
• Cirurgia: quando se esgotou vários métodos de diagnóstico menos invasivos,
possivelmente já se fez uma biopsia para perceber que tipo de patologia era aquela, e,
por isso, agenda-se uma cirurgia para remover uma lesão, sendo feita mais numa
perspetiva terapêutica do que diagnóstica.
• Biopsia: serve para se confirmar ou não uma patologia que se suspeita.
Exemplo: Pessoa com ardor no estomago há muito tempo, vai ao medico e há a suspeita
que pode ser uma gastrite aliada à presença da Helicobacter pylori, o que se faz é uma
endoscopia para visualizar o estomago e remove-se um pequeno fragmento.

Fatores que Influenciam a Fixação

Rapidez de Penetração do Fixador
 • Depende de que tipo de agente químico estamos a falar.
• A velocidade de penetração é uma propriedade intrínseca de cada fixador.
• O fixador que atua mais rapidamente é o que nos permite ver as coisas boas e más.
• Misturas fixadoras.
• E.g. de fixadores por ordem decrescente de rapidez:
 Ácido acético
 Ácido tricloroacético
 Formalina a 10% - o mais utilizado, excelente fixador de lípidos.
 Etanol a 95%
 Cloreto de mercúrio
 Ác. Pícrico em solução aquosa saturada
 Bicromato de potássio
 Tetróxido de ósmio (usado em ME juntamente com o glutaraldeido, é uma
solução combinada, mas não é uma mistura, pois coloca-se primeiro um e
depois o outro)

Nota: Formaldeído – aldeído mais simples; Glutaraldeido – segundo aldeído mais simples, é um
dialdeído e é uma molécula mais estável.

Volume do Líquido Fixador

• A quantidade de líquido fixador influencia diretamente a rapidez de reação da fixação.
• Para obter resultados ótimos o volume do fixador deve ser entre 20 a 40X superior ao
da peça (literatura variável). Como na literatura estas informações variam o que se faz
é colocar o fixador até estar tudo completamente tapado.
• As peças normalmente vão a fixar durante 24h, se nestas 24h não estiver fixado e
tivermos de renovar o líquido fixador renovamos. Isto porque, por exemplo, se
quisermos colocar a fixação com formalina terá que sair água e, portanto, para o fixador
estar fresco e concentrado para atuar teremos que o renovar, senão o que vai ficar ali
já que saiu água é mais água e não se fixa desta forma.
• Os frascos de armazenamento devem ser de boca larga para permitir o manuseamento
das peças.
• Algumas peças devido à sua constituição tendem a adquirir a forma do frasco onde
estão inseridas.

Na figura podemos ver um cérebro num recipiente

preso por um fio para que este fique em suspensão e não
toque no fundo do recipiente, para que se possa ver,
posteriormente, as formas e vilosidades do cérebro, ou seja,
para que fique com a sua forma original fixa-se assim.

Espessura do Material Biológico

• Quanto menor a espessura do material biológico, mais rápida e eficiente será a fixação.
• Espessura (altura) máxima recomendada – 5 mm, porque queremos que a trocas que
ocorrem sejam ótimas e também porque o processamento histológico está otimizado
para estas espessuras. Se, por exemplo, tivermos um fragmento superior a 5mm não
 poderemos fechar as cassetes (isto no caso do tratamento em que os fragmentos vão
para cassetes).

Consistência dos Tecidos

• Quanto mais denso um tecido mais difícil se torna a
penetração do fixador.

Duração da Fixação
A duração da fixação depende da maioria das outras variáveis, nomeadamente:

• Espessura das peças – a fixação é mais rápida quanto menor a espessura;

• Volume das peças;
• Volume do fixador – quanto maior o volume do fixador mais rápida a fixação (colocamos
até a peça ficar totalmente submersa);
• Temperatura – maior temperatura leva a uma rápida reação;
• Tipo de fixador – está relacionado com as características de cada um, um fixador que
atue de forma rápida faz com a duração de fixação seja menor, já um que atue de forma
lenta faz com que a duração de fixação seja maior.

Concentração do Fixador
• Quanto maior a concentração de um líquido fixador maior a rapidez de fixação.
• No entanto, deve-se ter cuidado, uma vez que concentrações elevadas podem ser
prejudiciais para a estrutura do material biológico.

Temperatura
• A fixação trata-se de uma reação química e como tal é influenciada pela temperatura.
• O aumento da temperatura acelera a fixação.
• O frio retarda a fixação, pelo método químico.
 • A temperatura ambiente deve ser sempre tida em conta.

pH
• Os valores de pH extremos podem ter efeitos nocivos, bem como as variações.
• Utilizam-se fixadores com um pH variável entre 6 e 8.
• Para a preservação da ultraestrutura é importante que o pH do fixador seja entre os 7.2
e 7.4 (ou seja usam-se soluções tampão).

Lavagem Pós-fixação
Alguns fixadores formam pigmentos artefatuais nos tecidos, sendo necessárias lavagens
pós-fixação.

• Pigmento Formólico: não é suposto acontecer, só acontece porque as soluções de

formalina (a formalina é incolor) antigas formam ácido fórmico e fazem com que a
solução acidifique e aparece o tal pigmento que é castanho.
Removido com Ácido pícrico alcoólico e com Carbonato de lítio.
• Pigmento de Ácido pícrico: tem uma cor amarela fluorescente.
Removido com Carbonato de lítio.
• Pigmento de Mercúrio: Removido com Iodina de Lugol e Tiossulfato de sódio.
Evita-se utilizar um fixador com mercúrio, porque a nível ambiental é toxico.

Pressão Osmótica
• A osmolaridade das misturas fixadoras é importante.
• Nº de partículas que se encontram em solução.
• Qualquer fixador provoca efeitos de retração nos tecidos.
• Soluções hipertónicas acentuam a retração.
• Soluções hipotónicas podem provocar o rebentamento das células.
• Aspeto com elevada relevância na ME (estuda-se ultraestruturas na ME).

Tipo de Fixador
Existem várias formas de classificar fixadores, entre as quais:

• O modo de atuação.
• Mecanismo de ação.
• A natureza das estruturas a fixar.

Modo de Atuação
Segundo o modo de atuação os fixadores são classificados em:

• Aditivos: está a adicionar algo, ex.: adicionar pontes de metileno entre os aminoácidos
• Não aditivos: não fixam por adição
• Coagulantes: coagulam proteínas
• Não coagulantes
 Ligam-se quimicamente ou
adicionam-se provocando alterações
nos tecidos
Sim Não

Fixadores Aditivos Fixadores Não Aditivos

+ comuns: Cloreto de mercúrio, Trióxido de + comuns: Acetona, Metanol e Etanol

crómio, Formaldeído, Glutaraldeído, Ácido
pícrico, Sulfato ou Cloreto de zinco, entre outros.

Fixadores Coagulantes Fixadores Não Coagulantes

Formação de rede → penetração Gel → dificulta penetração de soluções subsequentes

rápida → precipitação proteica. por tornar os tecidos mais impermeáveis.

+ comuns: Acetona, Metanol e Etanol + comuns: Formaldeído, Glutaraldeído, Ácido acético

Formalina – fixador aditivo não coagulante; Álcool – fixador não aditivo e coagulante.

Nota: Fixadores aditivos não coagulam e vice-versa.

Penetração nas Dificulta penetração

Ligação química ou Classificação segundo
Fixador células → formação de soluções
adição aos tecidos o modo de atuação
de precipitado subsequentes
Formalina (formação
Aditivo não
de pontes de Sim Não Sim
coagulante
metileno)
Aditivo não
Glutaraldeído Sim Não Sim
coagulante
Ácido pícrico Sim Sim Não Aditivo Coagulante
Não aditivo
Etanol Não Sim Não
coagulante

Mecanismo de Ação
• Álcoois – mecanismo dos fixadores por coagulação.
• Aldeídos – mecanismo dos fixadores aditivos.
 Cross-linking.
 Permitem preservação antigénica sendo necessário depois fazer a recuperação
de antigénio (isto em imunocitoquimica, se o fizermos em imunofluorescência
utilizamos o frio, fazemos cortes de congelação e não necessitamos de
recuperação do antigénio).
• Agentes Oxidantes
 Desnaturação proteica extensa.
  Formação de ligações cruzadas.
 Tetróxido de ósmio e Dicromato de potássio.
• Mercúrios
 Bom detalhe nuclear.
 Toxicidade elevada.
• Picratos
 Bom detalhe nuclear.
 Ácido pícrico e Líquido de Bouin.

Natureza da Estrutura a Fixar

Classificamos um fixador por: qual é o melhor para os ácidos nucleicos, qual o melhor
para os lípidos … etc.

• Ácidos Nucleicos: como queremos evidenciar

DNA, RNA, proteínas e histonas que estão no
núcleo o fixador ideal é acido acético (a
permanência do ácido acético ótima faz com que
a coloração fique mais brilhante, já uma
permanência prolongada leva à hidrólise ácida) e
a solução de Carnoy.
• Lípidos: o Tetróxido de ósmio (cor preta) permite
insolubilizar alguns lípidos.
• Glícidos: solução Carnoy (solução alcoólica muito
boa para o glicogénio presente no endométrio)
• Proteínas

Ácidos Nucleicos
• DNA +RNA + proteínas → núcleo.
• Maioria dos fixadores parecem não reagir com o DNA e RNA.
• Fixadores ideais: Álcool acético e a solução de Carnoy.
• Fixador + utilizado: formalina → só reage com o DNA a 65℃ e com RNA a 45℃.
• A fixação ocorre habitualmente para a estabilização das proteínas nucleares.

Lípidos
• Vários fixadores preservam os lípidos.
• Fixadores ideais impedem a sua remoção durante fases posteriores da técnica
histológica: Formalina tamponada 10%; Tetróxido de ósmio e o ácido crómio.

Glícidos
• Vários glícidos perdem-se durante a fixação e alguns deles quando preservados
(glicogénio, glucose) tornam-se num fator que dificulta a fixação de proteínas.
• Fixadores ideais: Carnoy’s, Gendre’s, formalina alcoólica ácida, álcool absoluto,
Metacarn.

Proteínas
 • Estrutura primária → é determinada pelo arranjo de ligações covalentes entre os
aminoácidos.
• Estrutura secundária → é determinada por pontes de hidrogénio entre várias
componentes da cadeia peptídica.
• Estrutura terciária → pontes de hidrogénio, ligações iónicas e ligações hidrofóbicas =
estrutura frágil e muito reativa com fixadores aditivos.
• Fixadores aditivos → alteraram a estrutura das proteínas terciárias por alterarem cargas
elétricas no ponto onde vão estabelecer ligação.
• Fixadores não aditivos coagulantes → proteína terciária insolúvel.
• Fixadores ideais para uma proteína secundária podem não o ser para estruturas
terciárias (ex.: metanol e o etanol).
• Fixador ideal: Clark-Carnoy, Carnoy, Metacarn.

Fixadores
3 fixadores mais utilizados de maneira geral em AP (os anteriores são usados de maneira
particular):

• Formaldeído
• Líquido de Bouin
• Etanol

Formaldeído
• É um gás, é utilizado em solução aquosa para podermos fazer fixação dos tecidos – aqui
já falamos de formalina.
• É o aldeído mais simples.
• Forma molecular H2CO.
• Nome oficial IUPAC –Metanal.
• Fixador aditivo, não coagulante.
• Une cadeias proteicas (polimerização), formando pontes entre as proteínas.
• É o fixador universal em Histopatologia.
• Como foi referido anteriormente o formaldeído é um gás obtido a partir do
Paraformaldeído que é: sólido estável, insolúvel em água, constituído por polímeros de
alto peso molecular (polioximetilenoglicol).
• A forma sólida é dissociada em água a em condições ligeiramente alcalinas (adicionar
NaOH até pH=7.2).
• Quando aquecido (60℃), em solução aquosa em condições ligeiramente alcalinas
(NaOH até pH=7.2), gera um gás – o Formaldeído.
• Formaldeído: é o fixador, gás incolor, caracterizado pelo seu cheiro muito forte,
inflamável.
• Formol ou Formalina: solução aquosa de Formaldeído, sendo solúvel em água até 40%
(máximo).
• Como fixador de tecidos, a formalina é usada a uma concentração de 10%
em solução aquosa (formaldeído a 4%).
• As soluções comerciais (37-40%) – formalina absoluta em laboratório –
contêm cerca de 10% de metanol, que tem como função evitar a
polimerização do metilenoglicol.
 • Em solução aquosa coexiste com a sua forma hidratada (metilenoglicol), podendo
polimerizar sob a forma de um precipitado branco (polioximetilenoglicol).
• Segundo a reação de Cannizzaro, quando 2 moléculas de formaldeído interagem, 1 é
reduzida a metanol e a outra oxidada a Ácido fórmico (iões formato).
• Fosfato monobásico e dibásico – Formalina Tamponada ou Formalina Neutra.

• Penetra rapidamente e de forma uniforme nos tecidos.

• Endurece moderadamente os tecidos.
• Provoca pouca retração.
• Fixador lento: fixa entre 6 e 48h (8h:1mm).
• Não precipita proteínas.
• Preservar o tecido adiposo.
• Fixar lípidos complexos (fosfolípidos).
• Não atua em gorduras neutras.
• Tempo máximo de fixação: indeterminado, após alguns
meses as colorações tornam-se difusas.
• Formaldeído o fixador de eleição em AP.
• IARC Grupo 1: o formaldeído é considerado uma substância carcinogénica, ligada ao
cancro da nasofaringe e em alguns estudos está associado a leucemia. É necessário que
a exposição com formaldeído seja controlada para evitar que se esteja tão facilmente
exposto e, portanto, trabalha-se com ele na hotte.

Nota: BPA-bisfenol A composto muito utilizado para fazer plásticos e enlatados. É um disruptor
endócrino que vai interagir com as nossas hormonas e mimetizar encaixes que temos nos nossos
recetores hormonais.

Líquido de Bouin
• Constituído por: Ácido pícrico, Formaldeído a 37-40% e Ácido acético.
• Fixador mais indicado para alguns exames histoquímicos como é o caso do tricrómio de
masson.
• Preserva bem os aspetos gerais da célula com um bom detalhe nuclear.
• Utilizado em gânglios: aspeto fluorescente VS tamanho reduzido.
• A coloração amarela conferida pelo Ácido pícrico pode ser removida com etanol 50% ou
a 70% ou etanol 70% saturado com Carbonato de lítio.
 • Fixador rápido: fixa entre 4 e 24 h (4h:1mm).
• Tempo de fixação máximo: 8 dias, após este tempo os fragmentos endurecem
excessivamente, dificultando o corte.

Etanol
• Líquido incolor, inflamável.
• Fixador coagulante, não aditivo – desnatura e coagula todas as proteínas do tecido
exceto das nucleoproteínas.
• Utilizado preferencialmente para a preservação de componentes do tecido solúveis em
água (ex.: glicogénio).
• Dissolve os lípidos.
• Torna o fragmento duro e quebradiço.
• Faz desaparecer todos os grânulos e pigmentos acidófilos.

Receção e Registo Macroscópico

Receção de Amostras – Tipos de Amostras (Circular
Normativa nº 21 de 2013 ACSS)
O laboratório de AP recebe vários tipos de material biológico, provenientes:

• Patologia Cirúrgica
 Peças cirúrgicas e Biópsias.
 Exames extemporâneos – exames de urgência, onde a pessoa está no bloco
operatório e é retirada uma amostra de forma rápida, depois é feito um corte
de congelação e uma coloração rápida de hematoxilina-eosina, o patologista a
partir deste momento pondera se vai fazer uma cirurgia mais conservativa ou
não.
• Necrópsia
• Amostras citológicas (consultas, exames especiais, cirurgia)
 Consultas – exemplo: Para uma consulta de ginecologia, a fim de fazer o rastreio
do cancro do colo do útero, é retirado uma amostra para fazer-se citologia em
meio líquido ou em esfregaço (cada vez mais em meio líquido por causa da
genotipagem para o HPV)
 Exames especiais – exemplo: punções por agulha fina, que são amostras
também provenientes da citologia, seja da medula óssea, da tiroide, da mama,
etc.

Peça Cirúrgica
• É obtida por cirurgia (internamento ou ambulatório).
• Objetivo: promover o tratamento de uma patologia ou efetuar uma terapia paliativa.
• Incluí, frequentemente, toda a lesão (retira-se todo o tumor).
 Órgãos, partes de órgãos.
• Maior dimensão que a biópsia.
• 31077 (códigos de faturação) – Exame macroscópico e histológico de peça de resseção
cirúrgica ou de feto com 11 semanas ou menos.
 • 31097 – Exame macroscópico e histológico de peça de resseção cirúrgica com disseção
ganglionar e/ou avaliação da margem circunferencial e/ou mapeamento – servem para
estudar se os gânglios estão comprometidos e se há metastização.

Peças Cirúrgicas Simples (c.f. 31077) – Exemplos:

• Apendicectomia (remoção de apêndice ileocecal)
• Amigdalectomia por tumor (remoção da amígdala palatina)
• Esplenectomia (remoção do baço)
• Hepatectomia parcial/ segmentar (remoção do fígado)
• Mamoplastia (redução mamária)
• Ooforectomia ou salpingo-ooforectomia (remoção de ovário, ovário e trompa)
• Nefrectomia (remoção do rim)
• Orquidectomia (remoção do testículo)
• Histerectomia (remoção de útero)
• Colecistectomia (remoção da vesícula biliar)

Peças Cirúrgicas Complexas / Patologia Neoplásica (c.f.

31097) – Exemplos:
• Apendicectomia por tumor
• Cistectomia por tumor (bexiga)
• Colectomia segmentar ou hemicolectomia (cólon), Colectomia total (cólon)
• Esofagectomia (esófago)
• Gastrectomia parcial ou total, por tumor (estômago)
• Laringectomia parcial ou total, por tumor (laringe)
• Glossectomia ou hemiglossectomia, por tumor (língua)
• Mastectomia parcial ou quadratectomia (mama), Mastectomia radical (mama)
• Prostatectomia radical (próstata) – toda a próstata tem de ser estudada e um caso chega
a levar cerca de 60 cassetes, e para perceber de que zona são os tecidos na próstata
marca-se por quadrantes com tintas diferentes os locais.
• Nefrectomia parcial ou radical, por tumor (rim)
• Conização (colo uterino)

Biópsia
• Porção de tecido obtida para estudo anatomopatológico.
• Objetivo: obter um diagnóstico de uma lesão que não foi possível obter por métodos
clínicos, definição terapêutica (e.g. biópsia da mama).
• Tamanho reduzido (temos de ter o maior cuidado para não a perder).
• Pode ou não incluir toda a lesão (excisional ou incisional), normalmente não inclui, mas
há uma exceção, por exemplo, para um nevo – neste caso remove-se na sua totalidade,
tratamos a lesão como biópsia de tamanho reduzido.

Biópsias – Exemplos: (quase todos os órgãos podem ser biopsados)

• Biopsia de amígdala, bexiga, brônquio, cólon, duodeno, esófago, estômago, mama,
próstata, uretra, útero, etc.
• Biopsia de baço, fígado, coração, gânglio linfático, medula óssea, nervo, osso, rim, etc.
• Biopsia de transplante cardíaco, renal ou hepático.
 • Restos ovulares, resseção transuretral (vesical e prostática), canais deferentes,
polipectomia (pólipo no trato gastrointestinal), biopsia incisional ou excisional de
tecidos moles (inclui lipoma, até 3 cm), pele e anexos cutâneos (incisional ou excisional,
até 3 cm), etc.

Nota: Por exemplo, no exame da próstata chega-se a uma certa idade e não se vai fazer um
exame prostático, em vez disso, prescreve-se umas análises clínicas para o PSA (antigénio
específico para a próstata) e verifica-se se este valor está ou não aumentado. Se estiver
aumentado a segunda coisa que se faz, por palpação, é o toque retal para saber se há uma
hiperplasia ou hipertrofia. Só após termos feito estes passos todos é que realizamos um exame
de biópsia prostática (feito com agulha fina).

Meios de Obtenção de Biópsias

• Punção (renal, hepática, mamária, prostática, quistos, nódulos solitários).
• Cirúrgica (pequeno ato cirúrgico, p.e. cutânea - punch).
• Por endoscopia (exame da superfície interior do órgão, e.g. fibrobroncoscopia,
endoscopia alta ou baixa).

Necrópsia
• Objetivo: conhecer a causa da morte através da investigação dos órgãos e outras
estruturas.
• A necrópsia pode ser: Clínica ou Médico-Legal/Forense.

Necrópsia Clínica (contexto hospitalar)

• Objetivo: conhecer a causa da morte, não sendo tão importante salientar as
circunstâncias da morte.
• Retrospetiva anatomopatológica recorrendo à análise de todas as lesões encontradas.
• Relacionar as lesões encontradas e interligá-las.
• Conhecer a história natural da doença que provocou a morte.

Necrópsia Médico-legal ou Forense

• Objetivo: investigar a origem e circunstâncias da morte.
• Realizada quando existem implicações penais ou civis.
• Efetuada por um médico forense por uma ordem judicial.

Nota: Chega ao laboratório 3 biópsias, 5 peças cirúrgicas e 4 necrópsias. As primeiras a ser

trabalhadas por grau de urgência vão ser as biópsias, depois as peças cirúrgicas e por fim as
necrópsias.

Receção de Amostras
A receção das amostras que chegam ao laboratório de AP pode ser efetuada pelo técnico
que procede ao registo e deve fazer corresponder a amostra biológica à requisição.

As amostras, habitualmente, não chegam a fresco, mas num recipiente com líquido
fixador.

Requisição
 • Deve sempre acompanhar o material recebido e o seu preenchimento é um ato quase
tão importante quanto a colheita do material.
• Em papel ou digital (de acordo com a aplicação informática disponível).

Requisição (que veio com a amostra deve ter estes requisitos preenchidos) –
Requisitos:
• Identificação do utente (nome, idade, sexo, profissão, nº de processo).
• Natureza do material.
• Informações clínicas necessárias (diagnóstico clínico, terapêutica, etc.).
• Nome do médico e serviço requisitante.
• Data da colheita. (!!!)
• Agente fixador adicionado à amostra.

Requisição – Registos Técnicos (preenchido pelo técnico):

• Data da receção.
• Nome do técnico que recebeu.
• Nome do médico para quem fica o exame.
• Confirmação da codificação adequada (biopsia/peça cirúrgica).
• Outros aspetos que considere importante salientar (informação inexistente, biópsia
muito fina ou mucoide – devemos referir que a biópsia é muito fina, porque com o
processamento histológico ela pode desaparecer).
• Amostras não conformes (ex.: não veio o nome da pessoa, com a natureza da amostra,
ou veio trocado, etc.) → Devolver ao serviço requisitante.

Receção de Amostras:
Recipientes:
• Identificação do Utente (nome completo, idade, nº de processo)
 • Agente fixador em volume adequado (consoante o tipo de amostra), se a amostra não
estiver totalmente submersa eu perfaço com o fixador.
• Recipiente estanque (impedir derrames)

Integração em Sistema Informático:

• Registo informático
• Atribuição de nº interno
• Impressão de etiqueta com nome completo, nº de processo e nº interno para colar na
requisição e recipientes correspondentes

Exame Macroscópico – Material e Equipamento

Mesa de entradas Material cirúrgico

• Iluminação
• Ponto de água
• Recipiente de fixador
• Gravador de voz
• Pinças (com e sem dentes)
• Bisturi
• Facas
• Tesoura e Enterótemo
• Estilete e sonda

Material adicional Material Técnico

• Régua • Cassetes
• Balança • Fixador
• Tinta da China • Recipiente para a fixação (caixas de
• Gazes plástico com tampa)
• Papel absorvente (metástases de bancada)
• Tábua de plástico Papel absorvente usado para evitar metástases de
bancada: é a contaminação celular de uma amostra
para a seguinte; após usar um papel deita-se fora e
usa-se outro.

Muito importante a utilização de EPI (Equipamento de proteção individual).

Nota: Não se faz macroscopia, ou seja, dar entradas de dois órgãos da mesma natureza seguidos.
Por exemplo, se eu tiver um carcinoma num fígado e depois temos outro fígado normal, tal
consiste num problema, pois será difícil verificar qual é o normal ou não para um diagnóstico.

Descrição Macroscópica
Consiste na descrição das amostras biológicas, bem como na retirada e
acondicionamento dos fragmentos de tecido destinados ao exame macroscópico ou
histopatológico.

Objetivos:
• Confirmação do diagnóstico clínico.
• Estudo de adenopatias (tem haver com os gânglios – metastização).
• Verificação do grau de malignidade/grau de invasão/margens cirúrgicas.
 • Estadiamento oncológico.
• Definição do prognóstico e tratamento pós-operatório.

Descrição Macroscópica de Peças Cirúrgicas – Aspetos a

salientar:
• Tipo de peça
• Estruturas constituintes
• Dimensões (c x l x a)
• Forma
• Cor
• Brilho
• Consistência
• Identificação de zonas normais e das aparentemente patológicas
• Estudo dos limites de resseção cirúrgica para um prognóstico e terapêutica – utilização
da tinta da China como ponto de referência

Orientação do Corte das Peças

• Secionar as peças de um só golpe do cabo para a ponta da faca.
• Órgãos de superfície (pele e mucosas) ou órgãos cavitários (estômago, intestino, bexiga,
etc.), a secção deverá ser feita perpendicularmente à sua superfície.
• Órgão muscular (ex.: coração), a secção deverá preferencialmente, ser paralela à
direção das fibras.
• Peça sólida, a secção deverá acompanhar o maior diâmetro (as faces das peças assim
seccionadas devem ser planas e paralelas).
• Órgãos ocos devem ser analisados em toda a espessura da parede.
• As seções devem ser as mais representativas – sendo nos tumores a zona central.
• Secionar zonas próximas da lesão, outras zonas de interesse e tecido aparentemente
não patológico.

Parâmetros dos Fragmentos Retirados das Peças

• Fragmentos com espessura inferior a 5 mm (3 a 4 mm), tendo em conta a configuração
anatómica.
• Fragmentos com comprimento de 3 cm e largura 2,5 cm.
• Estes parâmetros baseiam-se nas dimensões das cassetes (recipiente onde os
fragmentos são acondicionados) e numa fixação eficiente.
 O tempo de fixação recomendado é variável e depende da dimensão da amostra
e da sua composição – normalmente amostras com elevada quantidade de
tecido adiposo requerem uma fixação mais prolongada do que as restantes.
 Assim deve ser respeitado o tempo mínimo de fixação de 24 horas para peças
cirúrgicas e de 6 horas para biopsias – para a formalina de 10%.

Tipo de Material
• Consistência mole: deve-se primeiro proceder à fixação e, mais tarde, secionar. A
fixação torna o material mais duro e resistente às manipulações.
 • Material acompanhado de coágulos sanguíneos (ex.: raspagens uterinas): separar
estes, a menos que se proceda à sua análise, uma vez que dificultam a execução dos
cortes histológicos.
• Peças cirúrgicas com fios de sutura: indicativos ou não de pontos de reparo para a
macroscopia (marcar por quadrantes), deverão ser retirados por meio de uma tesoura
de ponta fina, uma vez que a sua dureza dificulta a execução dos cortes histológicos.

Descrição Macroscópica Terminologia

Forma:

• Oval, esférica, cónica, cuneiforme, achatada, discóide, nodular, fusiforme, laminada,

filiforme, papiliforme, confluente ou coalescente (nódulos parcialmente ligados),
fungiforme, bordos rombos.

Cor:
• Utilizar cores primárias (azul, verde, amarelo e vermelho e também, branco, preto e
cinzento)
• Tonalidade (claro, escuro, vivo)
• Evitar termos comparativos
• Líquidos: transparente, translúcido, turvo

Brilho:
• Aprecia-se na superfície externa dos órgãos e na superfície de corte e pode ser:
brilhante; baças ou mate (zonas de necrose)

Consistência / Textura:
• Mole (como os lábios), dura (como a fronte), firme (como o nariz)
• Graduação: ligeira, moderada ou marcada
• Outros termos: flutuante, elástica, friável, mucosa, gelatinosa, seca, caseosa, granulosa,
homogéneo, heterogéneo

Superfície de um Órgão:
• Lisa, rugosa, nodular (macro ou micro), bosselada, vilosa, ulcerada, coberta (p.e. por
fibrina), elevada ou em relevo (hiperplasia nodular hepática), deprimida (enfartes
renais), umbilicada (metástases)

Superfície de Corte:
• Seca, húmida, cor, plana ou difluente (saliência), homogénea, heterogénea, lisa,
granular, fibrosa, zonas de necrose, com ou sem serosidade

Conteúdo:
• Vesical (nos casos de distensão da bexiga)
• Vesícula biliar (distensão)
• Quistos (se muito volumoso)
• Gástrico (consistência pastosa)
Estruturas (órgãos) Tubulares:
• Dilatadas (distendidas), obstruídas (obliteradas), estenosadas (estreitamento), com
divertículos

Descrição Macroscópica
Apêndice
• Seção transversal do terço médio
• Seção transversal próxima aos bordos do tumor
• Seção longitudinal, que reflete o fundo do apêndice

Diagnóstico Provável: Produção anormal de muco em cavidades orgânicas fechadas (mucocelo).

Mama (consoante o tipo de mastectomia)

• Exame externo (cor da pele/ retração do mamilo/
casca de laranja /edema)
• Cortes por quadrante (superior / inferior)
• Procura de gânglios linfáticos e retirar todos
• Estudo de todos os gânglios de forma a retirar dúvidas
de metástases ganglionar

Diagnóstico Provável: Adenocarcinoma da mama.

Exemplo:

• Estrutura nodular, lipomatosa com X/X1/X2 cm, envolta em camada de tecido

conjuntivo.
• A superfície de corte nota-se tecido adiposo que envolve a parte central, irregular.
• Constituído por tecido branco-rosado, brilhante, irregular e de superfície lisa,
consistência macia e elástica.

Diagnóstico Provável:
Fibroadenoma com
estroma adiposo?
Carcinoma??
 Útero
• Peça de Histerectomia total (útero e anexos), de
dimensões X/X1/X2 cm, onde se observa uma lesão que
lembra “cacho de uvas”.

Diagnóstico Provável:

• Tumor benigno
• Mola Hidatiforme / Tumor trofoblástico gestacional (só
se desenvolveu o saco no trofoblasto)

Ovário
• Observa-se ovário com o peso de X g, cor escura, superfície sólida que contém ao corte
... massa, cabelos, dentes, calcificação.

Diagnóstico Provável: Cistadenoma mucoso ou pseudo mucinoso do ovário

Estômago

• Peça cirúrgica aberta longitudinalmente pela grande

curvatura, de X tamanho, cor habituais, representando corpo
e antro gástrico.
• Nota-se pregueamento mucoso preservado e presença de
superfície mucosa, mantendo as características (bordos a
pique – regulares).

Diagnóstico Provável: Úlcera péptica crónica

• Peça de estômago aberto pela grande curvatura. Nota-se

mucosa acinzentada.
• Tumor com infiltração na parede gástrica, de bordos
elevados irregulares, nodular e de fundo necrótico.
• Porção central deprimida devido a necrose de ulceração.

Diagnóstico Provável: Carcinoma gástrico expansivo e ulcerado

Cólon
• Órgão não fixado. Nota-se intensa dilação de todo o cólon.
• Consistência aumentada nas áreas em que há espessamento
da camada muscular (hipertrofia).
• A coloração esverdeada ou negra deve-se ao fenómeno
cadavérico de impregnação pelo gás sulfídrico, produzido pós-
morte pelas bactérias do intestino.

Diagnóstico Provável: Megacólon

Intestino Grosso

• Peça de hemicolestomia D/E ou ressecção de intestino distal com X

cm de comprimento
• A X cm de uma das margens de ressecção identifica-se um tumor
vegetante/ulcerado/ polipoide com X cm de superfície que envolve
1/2 ou 1/3 da circunferência do órgão.
• Restante mucosa sem alteração.
• Identifica-se pólipos pediculares

Diagnóstico Provável: Polipose intestinal

• Produto de colectomia total.

• Mucosa difusamente alterada pela presença de milhares de
pólipos pediculados de diâmetros variados.
• Pólipos – pequena massa vermelha de consistência mole
com 1 / 2 cm de diâmetro, ligado ao cólon por um pedículo.

Diagnóstico Provável: Polipose familiar (pode malignizar, condição

hereditária).

Pâncreas
• Observa-se cavidade aproximadamente ovóide de paredes irregulares.
• O conteúdo, parte líquida e parte de restos de necrose extravasaram ao corte.
• A necrose ocorreu após processo inflamatório extremamente destrutivo.

Diagnóstico Provável: Pancreatite crónica

Vesícula Biliar
• Órgão aberto pelo seu maior eixo.
• Parede da vesícula apresenta-se com espessamento
moderado devido a neoformação conjuntiva que acompanha
o processo inflamatório crónico do órgão.
• No interior nota-se inúmeros pequenos corpos
multifacetados, endurecidos de coloração amarelada ou negro
azulado. Os cálculos podem ser usados para saber a sua
origem (normalmente relacionado com a alimentação).

Diagnóstico Provável: Calculose

Pulmão
• Pulmão que à superfície de corte apresenta inúmeras áreas mais
claras, pouco delimitada, friáveis de coloração acinzentada ou
branco-amarelado.
• No centro das lesões pode-se verificar excesso de pigmento de
coloração negra.
• Paredes irregulares e áreas de necrose.
• Na porção superior “caverna” recente com paredes irregulares.

Diagnóstico Provável: Tuberculose secundária/necrose caseosa

Trompa
• Dependendo de suspeita patológica realiza-se, corte em três secções: zona proximal,
média e distal.
• Quando se suspeita de produto de conceção, realizam-se vários cortes perto da área de
hemorragia.

Diagnóstico Provável: Gravidez tubária

Após Descrição Macroscópica:

• Os fragmentos selecionados são colocados em cassetes devidamente identificadas.
• Os restantes fragmentos devem ser armazenados como material de reserva até à saída
do diagnóstico.
Descrição Macroscópica de Biópsias
• Confirmar os dados do utente (requisição)
• Confirmar a informação clínica (requisição)
• Identificar a amostra (número interno)
• Efetuar descrição macroscópica
• Recolher amostras (cassetes identificadas)
• Garantir a adequada fixação
• Garantir descalcificação (nos casos aplicáveis)

Pólipo
• Dependendo do tamanho tratamo-los de maneira diferente
• Realizar corte longitudinal, onde incluem a margem do tumor do pólipo com ou sem
pedúnculo
• Corte longitudinal e uma secção transversal na base, quando esta é larga (pelo maior
eixo)
• A descrição macroscópica deve referir as medidas, diâmetro e comprimento (mesmo
que seja um pequeno fragmento)

Pele, consoante o seu tamanho:

• Amostras com 3 mm, incluem-se na totalidade
• Entre 4/6 mm, secção pelo diâmetro
• Com 7 mm ou mais, secção central
• Divisão em duas partes simétricas, pelo diâmetro, desde a epiderme até à zona mais
basal – Incluir na totalidade pela parte do tumor.

Exame Microscópico
 • O exame macroscópico (feito pelo técnico de AP com uma pós-graduação em
Macroscopia) é uma etapa fundamental para um bom exame microscópico.
• Este é realizado pelo patologista através da visualização das lâminas ao microscópio
ótico após processamento técnico.
• Tem como objetivo final um diagnóstico que pode ser obtido através de:
 Lâminas histológicas – Constituídas por fragmento(s) de tecido de espessura
muito fina que após a aplicação de um conjunto de procedimentos torna(m)- se
visível, por meio de corantes, ao microscópico ótico.
 Imprint – Em órgãos hematopoiéticos é possível obter uma camada unicelular
pressionando levemente a lâmina sobre a superfície de secção desses órgãos
(no entanto há sempre algumas células que descamam).
Costumam-se fazer imprints a nível do olho.

Processamento Histológico
O processamento histológico é
constituído por um conjunto de 3
etapas:

● Desidratação: realizada pelo etanol,

sendo que este tem concentrações a
70%, 96% e 100%, pois queremos que
exista uma remoção progressiva da
água e não uma retirada abrupta da
mesma, senão ocorrem distorções.

● Diafanização ou Clarificação:
realizada pelo xileno, sendo que este só tem uma concentração.

● Impregnação: realizada pela parafina, sendo que esta à temperatura ambiente é solida e,
primeiramente, precisamos de aquecê-la para que esta possa penetrar nos tecidos. O meio de
impregnação deve ser o mesmo que o de inclusão.

As etapas mencionadas anteriormente vão permitir dar ao fragmento suportes interno

e externo resistentes às manipulações futuras e, também, permitir, posteriormente, a
visualização ao M.O.C.

O processamento histológico é das etapas mais longas da técnica histológica, durando

entre 10 a 12horas e, normalmente, ocorre overnight. A parafina não é solúvel na formalina e,
portanto, estas são imiscíveis, logo temos uma série de etapas intermediarias até passarmos da
fixação para um suporte interno do tecido. Assim, queremos que o tecido fique sólido para que
dê o suporte interno (tal ocorre na impregnação), já na inclusão vamos dar um suporte externo.
 Em suma, remove-se a água com etanol, e, posteriormente, este último é removido com
o xileno, porque o álcool não é compatível com a parafina.

Na última etapa da desidratação utilizamos o etanol a 100%, pois é este que em teoria
não tem água nenhuma e após esta utilização conseguimos trabalhar o tecido com o xileno, mas
não conseguiríamos anteriormente, porque onde estiver água presente não é possível o xileno
entrar. Por fim, retiramos o xileno para que entre a parafina.

Logo, o processamento histológico é sempre uma entrada e saída de reagentes: sai a

formalina (constituída por água) entra o etanol, sai o etanol para entrar o xileno e sai o xileno
para entrar a parafina.

Desidratação
• Na desidratação utilizamos concentrações crescentes de etanol (70, 96 e 100%).
• Etapa que sucede a fixação.
• Primeira etapa do processamento histológico, se a fixação for considerada como
processo de conservação.
Nota: Há autores que consideram que a fixação está inserida no processamento
histológico.
• Objetivo: retirar a água existente nos tecidos (água da solução aquosa de formalina),
pois a água é incompatível com a parafina que é o agente final deste processo.

Nota: No laboratório temos o recipiente de formaldeído num aparelho de processador de

tecidos por conveniência, pois prefere-se que um fragmento que não esteja totalmente fixado
seja colocado num aparelho fixador x horas no recipiente de fixação antes de começar o
processamento.

Método Químico
Na desidratação, o método químico trata-se da utilização de solventes orgânicos que
apresentam uma grande solubilidade com a água, permitindo a extração e substituição desta.

O desidratante ideal é:

• Solúvel em água.
• Solúvel em parafina.

Se fosse possível termos um desidratante simultaneamente solúvel em água e em

parafina, ou seja, um desidratante ideal, fazia-se a passagem direta da desidratação para a
impregnação.

Exemplos de agentes desidratantes:

• Etanol
• Isopropanol (álcool com maior estabilidade)
• Acetona (ação rápida e evapora rapidamente)
• Dioxano
• Tetrahidrofurano

Etanol
• C2H6O
 • Forma “pura” – etanol/álcool absoluto (a 100%). No entanto, normalmente, pede-se
etanol 99,5% no limite 99,8% para os laboratórios, o que não é na verdade
completamente álcool absoluto.
• Muito solúvel em água.
• O mais utilizado em AP como agente desidratante.
• Etanol “industrial” possui elevado grau de impurezas – mas é considerado 100% puro
para AP.
• Inflamável e volátil.
• Provoca uma retração no tecido e endurecimento (rápido), especialmente o mais puro
(a 100%).
• Não é miscível com a parafina (e por isso é que precisamos depois do xileno).
• Etanol 70% - provoca menor retração – os fragmentos podem permanecer durante mais
tempo.
Nota: Existem 12 etapas e a etapa onde podemos deixar os fragmentos permanecer
mais tempo é no etanol a 70%, porque este tem ainda uma boa quantidade de água,
não ocorrendo efeitos nefastos para os tecidos.
• Etanol 95% devolve as cores dos tecidos, anteriormente à fixação – bom para tirar
fotografias.

Isopropanol
• C3H8O
• Álcool isopropílico (tipo de álcool mais puro que o normal)
• Inflamável
• Ação mais lenta e tolerante que o etanol – menor retração dos tecidos (sendo, por isso,
um reagente mais estável).
• Não dissolve os corantes solúveis em etanol.
• Não é miscível com a parafina.
• Não dissolve a celoidina (meio de impregnação/inclusão).

Acetona
• CH3(CO)CH3
• Propanona.
• Pode utilizar-se como agente desidratante quando a rapidez é um fator importante. No
entanto, uma desidratação muito rápida leva a que as desvantagens apareçam também
muito rápido, logo a acetona não é muito utilizada pela razão apresentada no último
ponto*.
• Inflamável.
• Muito volátil.
• Mais rápida que o etanol.
• Não é miscível com a parafina.
• *Tem tendência a endurecer os tecidos, se a desidratação for longa.

De forma geral, quer na fixação como no processo histológico, devemos contar os

tempos ótimos, ou seja, o tempo em que conseguimos ter um expoente máximo que aquele
reagente pode oferecer e a partir dai terminamos o processo, porque senão uma permanência
longa pode, por exemplo, endurecer os tecidos e dificultar-nos o corte.
Dioxano
• C4H8O2
• 1, 4-Dióxido de dietileno
• Agente desidratante ideal, sendo solúvel tanto na água como
na parafina.
• Altamente inflamável.
• Perigo de explosão (peróxidos). Apesar de ser um desidratante ideal não é muito
• Muito tóxico por inalação e via cutânea. utilizado por causa destas 2 razões.
• Preço muito elevado.

Tetrahidrofurano
• OC4H8
• Óxido de dietileno, Óxido de tetrametileno ou THF.
• Agente desidratante ideal, sendo solúvel tanto na água como na parafina.
• Altamente inflamável.
Apesar de ser um desidratante ideal não é muito
• Perigo de explosão (peróxidos).
utilizado por causa desta razão.
• Menos tóxico que o dioxano.
• Ação muito rápida.
• Danifica pouco os tecidos.

Diafanização (Transparência)
• De onde surgiu o nome diáfano? Se tivéssemos um processamento manual, nesta etapa
os fragmentos iriam ficar translúcidos, sendo que apenas quando vão para a parafina é
que recuperam novamente as suas cores.
• Consiste na substituição do agente desidratante no tecido, normalmente etanol, por um
solvente da parafina.
• É um processo de clarificação, uma vez que após a sua ação os tecidos ficam
transparentes (provocado pelo elevado índice de refração).

Características Comuns dos Agentes Diafanizadores:

• Muito tóxicos Assegurar uma boa ventilação
• Inflamáveis
• Não são miscíveis em água e nota-se macroscopicamente a sua contaminação
• Miscíveis na parafina
• Mais densos que o etanol (sendo que o etanol é menos denso que o xileno)
• Possuem pouca compatibilidade com o tecido
• Normalmente são hidrocarbonetos

Principais Agentes Diafanizadores:

• Xileno ou xilol
Mais usados
• Tolueno (mais estável)
• Benzeno (carcinogénico)

Xileno
• C6H4(CH3)2
• Dimetil benzeno.
 • A solução comercial é constituída por uma mistura de orto-, meta- e para-
xilol.
• Diafanizador mais utilizado no processamento e coloração.

Vantagens
• É o mais rápido (30 min. a 1h).
• Endurece pouco os tecidos.
• Eliminação fácil dos tecidos.
• Fácil observação do fim do processo (manualmente).
• Não dissolve a celoidina.

As cassetes têm tecidos que têm uma espessura máxima para conseguirem serem
colocados lá dentro, sendo esta espessura muito importante para todas as trocas que existem.
Todas estas reações estão a ser feitas da superfície de contacto para dentro, por isso, é
importante o poder de penetração dos reagentes, que está também relacionado nos tecidos
com as densidades: há tecidos difíceis de penetrar como o caso do tecido adiposo
(processadores automáticos tem tempos mais longos para estes).

Desvantagens
• Aclara os tecidos somente a partir do etanol absoluto (pois este não é miscível em água).
• Endurece os tecidos por exposição longa.
• Tendência para endurecer tecidos fibrosos, musculares e cartilagíneos.
• Torna os tecidos quebradiços.
• Tendência para acidificar. Por este motivo só colocamos o fragmento até ao tempo
estritamente necessário.

Tolueno
• C6H5CH3
• Metil benzeno
• Considerado o diafanizador ideal por muitos técnicos.

Vantagens
• É rápido (1 a 2h).
• Endurece menos os tecidos que o xilol.
• Não torna os tecidos quebradiços.
• Tolerância de mais de 12h para os tecidos.
• Fácil observação do fim do processo.
• É mais volátil que o xileno, sendo esta uma forma de ser eliminado depois da parafina.
• É mais tolerante à contaminação da água.

Desvantagens
• Aclara os tecidos somente a partir do etanol absoluto.
• Tendência para acidificar, no entanto, tem maior tolerância à água do que o xileno.

Benzeno
• C6H8

Vantagens
 • É relativamente rápido (1 a 3h).
• Endurece muito pouco os tecidos.
• Não torna os tecidos quebradiços.
• Provoca pouca retração.
• É muito volátil, evapora-se rapidamente do banho de parafina,
diminuindo a frequência de mudança desta.

Desvantagens
• É cancerígeno, afeta sobretudo sangue e medula óssea, podendo a longo prazo
desenvolverem-se anemias.
• Endurece tecidos fibrosos, músculo e tendões.
• Difícil manutenção do nível de volume nos processadores abertos.
• Não é muito utilizado.

Fatores que Influenciam a Desidratação e a

Diafanização
• Concentração do agente desidratante
• Volume dos agentes desidratantes e diafanizadores
• Tamanho e consistência do fragmento
• Duração
• Temperatura
• Vácuo
• Agitação

Concentração do Desidratante
Para uma desidratação o mais completa possível é necessário:

• Imersões com concentrações crescentes – método gradual (70, 96 e 100), para evitar
retração.
• Últimas imersões com a substância no estado puro, sendo que, assim, nos certificamos
que vamos remover toda a água.
• Mudança periódica: a água retirada dos fragmentos vai diminuir a concentração.

Temos 3 recipientes a 100%, pois é o reagente no estado mais puro. O primeiro

recipiente a 100% retira a água que resta dos fragmentos, o seguinte ainda retira alguma água
do fragmento e o último é aquele que retira completamente a água que ainda possa existir.
Assim, queremos assegurar-nos que não existe água em nenhuma zona, senão o xileno não
conseguirá penetrar nessa zona, ficando lá um buraco.

Volume dos Agentes Desidratantes e Diafanizadores

• Quanto maior a quantidade de fragmentos, maior será a quantidade de substância a ser
utilizada.
• Quanto maior o número de imersões → maior eficácia.
 • Imersão de grande volume VS imersões de volumes pequenos.

Várias imersões em vez de uma só são mais eficazes.

A água é mais densa que o etanol, portanto no caso do recipiente maior, como não
haverá agitação por 3 horas as cassetes que estão no fundo vão estar em contacto com água
esse tempo todo e, em consequência, vão estar sempre hidratadas.

Logo, é preferível passar de volume pequeno em volume pequeno do que ter apenas
uma imersão única num grande volume.

Já no caso da diafanização (onde se tira etanol e se coloca xileno), o xileno é mais denso
que o etanol. Não é benéfico ter agitação, porque o que se deseja é que o xileno esteja sempre
em contacto com as cassetes e que o etanol esteja mais no topo do recipiente.

Tamanho e Consistência dos Fragmentos

• Fragmentos maiores – difusão dos reagentes mais difícil.
• Maior quantidade de água/etanol.
• Lípidos: maior dificuldade de penetração dos reagentes.
• Tecidos fibrosos e densos são mais difíceis.

Duração
• Duração: o tempo necessário até equilibrar as proporções água/etanol ou etanol/xileno.
• Quando o equilíbrio é atingido (proporção igual) retiram-se os fragmentos de forma a
minimizar a retração e o endurecimento.
• Etanol 100% – fragmentos quebradiços.

Nota: Dentro do processamento histológico é preferível deixar os nossos fragmentos em etanol

a 70% que é o que tem mais água, sendo esta o componente natural dos tecidos.

Temperatura
• Aumento da temperatura acelera as reações.
• Aumenta os efeitos negativos: retração e endurecimento.
• Aumenta o perigo de incêndio.
• A evaporação do agente desidratante, mais volátil que a água, leva à hidratação.

Vácuo
• Não tem efeitos na duração das etapas.
• Ajuda a retirar o ar dos tecidos.

Agitação
• Influencia a desidratação, sendo benéfico.
• Agitação constante: desidratação mais rápida e eficiente.
 • Sem agitação: a água é mais densa deposita-se no fundo do recipiente – fragmentos
hidratados.
• A agitação durante a diafanização possui efeitos negativos.
• O xilol é mais denso que o etanol.
• Não agitar permite que o diafanizador fique separado do etanol.

Desidratação e Diafanização Incorretas

Podem ocorrer por:

• Permanência longa: endurece excessivamente o tecido (verificamos que está duro

durante a microtomia).
• Permanência curta: os efeitos fazem-se sentir nas etapas seguintes a curto ou a longo
prazo (verificamos durante a microtomia e no arquivo).

Efeitos a Curto Prazo

• Fragmento com consistência heterogénea (sem suporte interno), dificultando o corte.
• A água/etanol restante no tecido, devido à sua incompatibilidade com o meio de
impregnação, não permite que este entre no mesmo.

Efeitos a Longo Prazo

• É possível o corte, num fragmento de consistência reduzida.
• Em contacto com o ar, a água/etanol evapora, o tecido retrai e separa-se da parafina
envolvente (bloco).

Se, por exemplo, houver um problema com a desidratação onde esta foi mal feita
retiramos a parafina e depois colocamos o bloco no xileno para tirar a parafina presente lá de
dentro. Tecidos de dentro ficam com xileno e depois passamos para o etanol a 100% (pois tem
0% de água), deixamos ficar uma horas e, por fim, voltamos a fazer o processamento todo outra
vez.

Impregnação
• Consiste no preenchimento dos espaços vazios, anteriormente ocupados por xileno, por
substâncias que irão proporcionar uma consistência firme.
• O meio utilizado na impregnação deve ser igual ao meio utilizado na inclusão.
• A substância mais utilizada na impregnação é a parafina.
• Existem outros meios de impregnação, tais como: celoidina (é um meio solúvel em
solventes e não é necessária fonte de calor), gelatina, ceras esterificadas e polietileno.

Parafina
• CnCH2n+2
• Sólida à temperatura ambiente.
• Substância branca cristalizada e gordurosa (nós temos em forma de pallage).
• Constituída por carbonetos saturados que se encontram nos resíduos de destilação do
petróleo.
• Insolúvel na água e no etanol.
• Solúvel nos agentes diafanizadores (único em que esta é solúvel).
• Pontos de fusão variáveis, no entanto, devem ter um ponto de fusão de cerca de 35℃
superior à TA.
 • Funde quando colocada a temperatura superior ao seu ponto de fusão, não superior a
60℃.
Não regular os banhos-maria para 60℃, porque é onde ocorre a extensão e isto pode
retirar parafina do nosso tecido e o tecido começa a encolher.

PF 46-55℃ → Parafina mole PF 56-58℃ → Parafina dura

Utilizada em tecidos moles, Utilizada em tecidos duros,
conjuntivos e conjuntivo fetal. fibrosos e densos, ósseo.

Nota: A parafina mais útil é a dura, pois, ao usar parafina dura funciona tanto para os tecidos
que utilizamos a parafina mole como para os que utilizamos a parafina dura, mas o inverso não
já não iria acontecer, pois a parafina mole só pode ser utilizada especificamente para os tecidos
onde atua.

Boa Qualidade:
• Homogénea
• Compacta
• Opalina – sem pontos, manchas brancas compactas
• Amolece pouco a pouco
• Fusão iniciada pelos bordos (visualizado quando estamos a incluir)

Má Qualidade:
• Granulosa
• Manchas compactas
• Liquefaz-se desigualmente
• Fusão aleatória

Aditivos
• A parafina utilizada em AP não é pura.
• A parafina pura tem tendência para secar, tornando a longo prazo os blocos difíceis de
cortar.
• Não é suficientemente elástica, estalando e dificultando o corte.

Aditivos para melhorar a sua eficácia:

• Polímeros plásticos
• Borracha
• Cera de abelhas

Polímeros Plásticos
• Aumentam a consistência e elasticidade.
• Aumentam a flexibilidade.
• Aumentam a durabilidade.
• Permitem cortes finos uniformes e em série.

Borracha
• Aumenta a elasticidade.
• Aumenta a sustentação da amostra.
 • Impede a formação de rugas.

Cera de Abelhas
• Propriedades físicas semelhantes às da parafina
• Recurso renovável
• Fornece consistência para um corte uniforme
• Aumenta a elasticidade
• Evita rugas nos cortes

Celoidina
• É constituída por nitrocelulose.
• É utilizada dissolvida em éter + etanol. (Éter causa desmaios e ambos, o éter e o etanol,
são inflamáveis.)
• Esta técnica não utiliza calor, pois consiste na evaporação do solvente.
• Diminui a retração.
• Ideal para órgãos inteiros, osso descalcificado, olhos (a parafina descola a retina) e
tecido nervoso.
• A técnica é muito lenta (várias semanas).
• Cortes com espessura superior a 10-15 mm. (cortes para impregnação)
• Arquivo dos blocos em etanol – pouco prático, pois o arquivo é feito com etanol, mas
este evapora.
• Celoidina + solventes = inflamabilidade.

Gelatina
• Substância derivada da hidrólise do colagénio (é um glícido, logo quando o bloco é
arquivado, como ela tem a sua componente de açúcares, pode existir a contaminação
por microrganismos).
• Dá suporte a tecidos delicados e fragmentos muito pequenos
• Gelatina a 25%
• Endurece-se o bloco em formaldeído a 10% antes do corte
• Corte difícil

Ceras Esterificadas
• Ponto fusão inferior à parafina.
• Permitem um corte mais fino.
• Endurecimento deve ser feito progressivamente – retração do tecido.
• Custo elevado.

Polietileno
• Polímero simples e inerte.
• Ceras hidrossolúveis. Trata-se de uma cera solúvel em água que seria algo ótimo, porque
não precisaríamos de processamento histológico, logo seria mais rápido, mas não são
usadas porque não dão bons resultados.
• Carbowax (mais conhecida).
• Passagem direta da fixação para a impregnação (1 Carbowax 4000: 9 Carbowax 1500).
 • Com este método é possível preservar substâncias solúveis nos solventes orgânicos. Por
exemplo: os lípidos que são muito bem fixados com formalina, mas removidos pelos
solventes orgânicos etanol e xileno.

Fatores que Influenciam a Impregnação

• Agente diafanizador – relacionado com a volatilidade
• Temperatura
• Vácuo

Agente Diafanizador
• A solubilidade com a parafina condiciona a rapidez da sua eliminação.
• A volatilidade do diafanizador, faz com que este desapareça mais lenta ou rapidamente
do banho de parafina.
• Temos o benzeno que desaparece mais rapidamente, mas não é usado por ser
carcinogénico, por outro lado, o xileno e o tolueno ao desaparecerem fazem com que
parafina fique menos contaminada.

Temperatura
A temperatura da parafina é muito importante porque:

• Temperatura alta – provoca retração e dureza dos fragmentos, dificultando o corte

• Temperatura baixa – não se dá a impregnação (parafina está solida)
• Durante a impregnação: 60 ℃.

Vácuo
• Eliminação de bolhas de ar.
• Eliminação do agente diafanizador.
• Facilita a penetração da parafina.

Efeitos de uma Má Impregnação

• Demasiado longa – Retração e endurecimento dos fragmentos.
• Demasiado curta – Fragmentos com consistência heterogénea → dificuldade no corte
(há zonas que ficam esbranquiçadas).

Tipos de Processamento
O processamento mais comum em AP, atualmente pode ser realizado de 3 formas:

• Manual
• Automático
• Microondas

Manual
Vantagens
• Os fragmentos podem variam de tamanho.
• Controlo da diafanização (só é possível neste tipo de processamento)
• Não há problemas com avarias e falta de energia elétrica.
Desvantagens
• Moroso.
• O técnico fica sujeito a maior contacto com os agentes químicos prejudiciais.
• Não realiza programas de fim de semana e outros especiais.
• Não realiza vácuo, agitação, etc.
• Erro humano.

Automático
• Tamanho standard das cassetes.
• A maioria dos laboratórios de Histopatologia possuem processadores automáticos de
tecidos.
• Necessidade com o crescimento do volume de trabalho e preocupações com saúde do
trabalhador.
• Não há controlo visual por parte do técnico.

Vantagens
• Rápido.
• Agitação, vácuo, aquecimento.
• Tratamento homogéneo (passam todos pelas mesmas condições).
• Programas ao fim de semana, feriados, overnight.
• Diminui o erro humano.
• Diminui a exposição do técnico a agentes químicos perigosos.
• Tempo investido noutras atividades laborais.

Desvantagens
• Falta de energia elétrica.
• Anomalias nos aparelhos.
• Não há um controlo visual por parte do técnico, ex.: fim da diafanização.
• Homogeneidade das amostras requerida para estarem adaptadas ao programa.

Microondas
• Fontes de calor.
• Estudos efetuados associam as MW à aceleração da difusão dos reagentes utilizados na
Histopatologia sem danos morfológicos.

No processamento histológico por MW é constituído por 4 passos e utiliza 3 reagentes:

1. Etanol absoluto
2. Isopropanol
3. Parafina líquida a 67 ℃ (parafina tem óleos minerais – colmatar a ação que o xileno iria
ter)
4. Parafina líquida a 82 ℃

Tudo está dentro de um sistema fechado, com mw e a vácuo.

O processamento em MW tem 2 grandes vantagens:

 • Redução de tempo (biópsias em 30’ e fragmentos com espessura <2 mm em menos de
1h).
• Eliminação da manipulação do xileno, pois só utilizamos etanol, isopropanol e parafina.
• Dinâmica de trabalho é muito diferente, porque se está sempre a ter trabalho pois o
tempo é reduzido.

Mesmo que as coisas do fixador venham em formalina é depois colocado em fixador

molecular para se passar para este programa.

Inclusão
• É a etapa que se segue ao processamento.
• Consiste em incluir o fragmento impregnado num bloco.
• O bloco é constituído por meio de inclusão.
• O meio de inclusão deve ser o mesmo da impregnação.

Finalidades de formar 1 bloco:

• Suporte externo ao fragmento. → cria-se, assim, um molde para colocar o bloco no
porta-objetos ou porta-blocos, para ser mais fácil de manipulá-lo e, posteriormente,
cortá-lo.
• Mais fácil de manipular.
• Prender-se ao porta-blocos do micrótomo.
• É possível inscrever o nº de identificação (na base da cassete).
• Permite o arquivo (através da criação do suporte externo).
 A parafina no estado sólido é
comercializada sobre a forma de pallage.

O paraplasto é usado em
laboratório e trata-se da parafina com
todos os aditivos já falados.

Meios de Inclusão
Os meios de inclusão podem ser divididos, na generalidade, em 2 grupos:

• Solúveis em solventes
• Fundidos

Solúveis em Solvente:
• Não exige calor.
• Impregnação dos tecidos em soluções crescentes de meio de inclusão.
• Quando a concentração máxima é atingida, o tecido é colocado num molde e deixa-se
endurecer/solidificar o bloco.
• O bloco endurece pela evaporação do solvente ou pela polimerização.
• Exemplo comum: celoidina.

A Celoidina está dissolvida numa

solução de éter-álcool. Esta vai estar envolvida
em soluções crescentes, passando de, por
exemplo, de uma solução 2% celoidina, 4%
celoidina ... até atingir os 12% que será a
concentração máxima.

Fundidos:
• Exige calor.
• Coloca-se o meio de inclusão no molde
e deixa-se solidificar.
• Solidifica à temperatura ambiente.
• É o meio mais utilizado, sendo o principal meio de inclusão fundido utilizado a parafina.
• De forma a assegurar a qualidade da inclusão, a penetração do meio deve ser feita em
meio líquido e de forma progressiva.

Materiais e Equipamentos Utilizados na Inclusão

Para a realização de uma boa inclusão é necessário que esteja disponível todo o material
fundamental para a execução desta etapa, tal como:

• Moldes de inclusão
• Pinças
• Aparelho de inclusão
Moldes
Placas de Leuckart
Podem em situações excecionais serem
utilizadas. Consistem em duas peças em forma
de L e com uma base metálica. Nós através da
manipulação dessas duas peças conseguimos,
quisermos obter blocos maiores. Assim, as placas
são movidas de forma a obterem-se blocos de
diversos tamanhos.

Moldes de Inox
Mais utilizados, são reutilizáveis, funcionais e
com grande versatilidade de tamanhos.

Se tivermos de optar por um tamanho e não

temos muita opção optamos sempre pelo molde de
inox de maior tamanho, porque nos permite incluir
tudo quer biópsias, quer fragmentos.

Pinças
Permitem o manuseamento e orientação do fragmento.

Podem ser:

• passadas pelo calor; Para retirar os restos de parafina e

• passadas pela lamparina; de fragmentos
• aquecidas no aparelho de inclusão.

As pinças passadas pela lamparina ficam muito quentes e isto faz com que se formos
logo agarrar o fragmento este fique queimado. Inicialmente não conseguimos visualizar isto, no
entanto, tal pode ser verificado no microscópio.

Não devem:

• ter dentes → Para não macerar/danificar os fragmentos

As pinças que utilizamos devem ser pinças de pontas normais, pinças

curvas também dão muito jeito para segurarmos um fragmento ou mais que um,
para passar para a superfície fina. Pinças com dentes só se usam na macroscopia e
para manipular os fragmentos que vamos usar e não os fragmentos que vamos
depois estudar.

Aparelho de Inclusão
O aparelho de inclusão é constituído por:
Notas:

✓ Deve-se sempre verificar antes de começar a inclusão o depósito de parafina, a fim de

confirmar o nível de parafina.
✓ Se a parafina estiver sólida vamos ter de aguardar até que ela aqueça.
✓ É na placa aquecida que orientamos o fragmento.
✓ Quando se inclui dá para ver perfeitamente a parafina a solidificar das bordas para o
centro, o que é um sinal de parafina de boa qualidade.

Depósito de Parafina
• Local onde se coloca a parafina que irá servir como suporte externo ao fragmento
impregnado.
• Deve estar quente o suficiente para estar líquida (60℃).

Depósito (de parafina) para Cassetes

• Pode estar com parafina de forma a amolecer os fragmentos.
• Quente (60℃) de forma a parafina existente nos fragmentos não arrefeça e solidifique.

Depósito de Moldes
• A condição indispensável neste local é que a temperatura esteja a 60℃, de forma que
não existam restos de parafina sólida nos moldes.

Placa Quente
• Mantém a temperatura da parafina e do molde.
• Permite trabalhar com comodidade e orientar corretamente o fragmento.

Pequena Superfície Fria

• Após a peça estar orientada, para ser fixada no molde, transporta-se o molde para a
placa fria que vai arrefecer a parafina e permitir a fixação do fragmento ao molde. (aqui
é onde o fragmento é calcado, logo esta etapa é de alta relevância)

Placa Fria
• Temperatura de pelo menos 0℃.
• Solidifica a parafina para posteriormente ser retirado do molde.

Pontos de Aquecimento para Pinças

 • Estes pontos existentes no aparelho de inclusão permitem manter as pinças quentes,
logo, sem resíduos de parafina.

Na fotografia temos o nosso aparelho de inclusão:

Técnica de Inclusão
Atenção: a Parafina não deve apresentar indícios de agente clarificador (xileno), ou seja, não
deve estar contaminada, deve estar homogénea e sem impurezas.

Deve-se ter também atenção aos timings, uma vez que os compassos de espera devem
ser o menor possível para que não ocorram diferentes pontos de solidificação.

• Verificar tipo de fragmento. Para tal, abrimos a cassete e visualizamos o seu conteúdo.
• Escolher o molde mais adequado (sobretudo de acordo com o tamanho do fragmento).
• Encher o molde (até ao topo) com parafina em cima da placa quente.
• Colocar o fragmento dentro do molde com a orientação mais adequada.
o Neste ponto ter em conta que a superfície de corte melhor é a que fica para
baixo na cassete e no molde e o fragmento deve ser colocado de acordo com as
suas características e com a estrutura tecidular a observar.
• Centrar o mais possível o fragmento para melhor obtenção de corte.
• Colocar o molde em cima da pequena superfície fria e calcar fragmento (de forma a ficar
todo no mesmo plano).
• Colocar a base da cassete (com o registo do fragmento) em cima do molde (e bater
suavemente, para tirar as bolhas de ar).
• Colocar resultado na placa fria.
• Aguardar que solidifique.
• Retirar o bloco do molde.
• O bloco com o fragmento estabiliza à temperatura do laboratório.
• Retirar o excesso de parafina anexado à base da cassete para melhor aderência ao porta-
blocos do micrótomo.

Aspetos importantes após inclusão:

• Depois do corte, os blocos são arquivados.

• Caso, numa fase posterior, mais cortes sejam necessários, estes blocos são recuperados
do arquivo e preparam-se novos cortes.

Nota: A inclusão deve ser efetuada no tempo menor possível, de forma a não existirem
diferentes tempos de solidificação.

Orientação de Fragmentos
 • O(s) fragmento(s) deve(m) ser incluído(s) horizontalmente para obtenção de cortes
completos dos fragmentos.
• O tecido deve ser orientado de forma que ofereça uma resistência crescente ao longo
do corte, assim previne-se a compressão de zonas mais moles por zonas mais duras.
• Fragmentos incluídos tendo em conta o modo como foram colocados na cassete durante
a macroscopia.
• Todos os tecidos serão posicionados com a superfície de corte para baixo.

A orientação terá de atender aos respetivos aspetos:

• Estruturas Tubulares → devem ser incluídas de maneira que o corte seja transversal ao
seu lúmen.
• Estruturas Epiteliais → devem ser incluídas de maneira a ser transversal a todas a
camadas, para que todas possam ser visualizadas.
• Fragmentos grandes e densos.
• Múltiplos fragmentos no mesmo bloco → devem ser orientados da mesma forma.

Estruturas Tubulares
• Incluídos de forma que o corte pelo micrótomo seja transversal ao seu
lúmen.
• Ex: Veias, Artérias, Trompas, Apêndice.

Estruturas Epiteliais
• Incluídas de forma que o corte seja transversal a todas as suas camadas.
• Quando vários fragmentos no mesmo bloco colocá-los com a camada
serosa voltada sempre para o mesmo lado.
• Ex: Pele, Intestino, Estômago, Vesícula.
• Vesícula – Não se deve calcar por cima, mas sim pelos lados. (incluída de
parede, fragmentos recolhidos normalmente são retângulos)

Fragmentos Grande e Densos – Fáceis de Incluir

• Incluir com um ligeiro ângulo em relação à faca → a fim de ter uma
resistência crescente.
• Há diminuição da vibração no corte, obtendo-se melhores resultados.

Múltiplos Fragmentos no mesmo Bloco

• Devem ser incluídos lado a lado com espaço entre os fragmentos ao longo do maior eixo
do molde.
• Ter sempre atenção à disposição dos fragmentos atendendo às suas camadas.
 Tipos de Inclusão
Existem três tipos de inclusão na gíria laboratorial:

• Chapa
Ex: Fragmento de Fígado
• Topo
Ex: Artéria Aorta
• Parede Voltamos para o
Ex: Vesícula etanol a 100% (não
voltamos a hidratar
Incidentes e Contratempos da Inclusão o fragmento)
Defeitos Causas prováveis Soluções
Voltar à desidratação e
Fragmento tende a desincluir. O fragmento foi mal desidratado.
diafanização.
A parafina é de má qualidade.
Blocos friáveis, granulosos e com
Parafina saturada. Mistura não Voltar a incluir em outra parafina.
pequenas manchas brancas.
homogénea de várias parafinas.
Fragmento perdido, voltar à
Blocos encurvam-se e fragmentos Má fixação. Agentes desidratantes amostra original se possível.
mirram passadas semanas. e diafanizantes saturados. Retroceder o processamento
histológico.

Erros da Inclusão
Erro Solução
Má orientação dos fragmentos (não permite
Fundir o bloco e re-incluir o(s) fragmento(s).
visualizar ao MOC todas as suas camadas).
Colocar o fragmento no molde antes deste conter a
Avaliar no momento do corte, fazendo um maior
parafina (a adesão do fragmento ao fundo do molde
desbaste. Re-inclusão do(s) fragmento(s).
pode fazer o tecido separa-se da parafina).
Ao MOC o tecido apresenta focos de destruição
Não utilizar pinças muito quentes.
causados pelo calor.
Arrefecimento lento (cristalização irregular – mau
Re-inclusão.
corte).
Arrefecimento rápido (a parafina entre o fragmento e Solucionar se possível um maior desbaste. Re-incluir
o molde retrai e o bloco fica com superfície côncava). novamente.
Espera longa entre a colocação da parafina e do
Diminuir ao máximo o compasso de espera entre
fragmento (formação de uma camada de parafina
etapas na inclusão. Orientar o bloco para obter um
dura que vai dificultar a orientação do fragmento e o
bom corte. Re-incluir.
corte).
Pressionar os fragmentos de forma firme e suave de
Inclusão defeituosa ou incompleta (cortes dilacerados
modo a que estes fiquem completos no corte.
ou seccionados).
Orientar o bloco. Re-incluir
Pode-se dever ao facto de ser
uma má parafina ou o laboratório ter
uma T.A muito alta.

Microtomia
 • O estudo dos tecidos na dimensão celular da vida, requer a preparação de cortes
histológicos de modo que sejam observados ao M.O.C.
• Tecidos e órgãos são opacos à luz devido à sua espessura e densidade.
• Cortes devem ser finos e translúcidos.
• A microtomia consiste em retirar dos blocos cortes finos e regulares (3 μm).
• Microtómos.

Constituição do Micrótomo
Apesar da grande variedade de micrótomos, qualquer um deles apresenta duas partes
integrantes fundamentais:

• Porta-blocos (objetos)
• Porta-facas

Porta-blocos
Constituído por:

• Pinça: responsável pela fixação do bloco.

• 2 Parafusos de regulação: orientação.
• 1 Parafuso travão: suster o bloco na orientação pretendida.

Porta-facas
Constituído por:

• 2 Parafusos de aperto: mantêm a lâmina no lugar.

• Parafusos de fixação: regulação da altura.
• Alavanca graduada: selecionar e medir o ângulo mais adequado ao corte.
• Parafuso travão: bloqueia todo o conjunto.

Principais Tipos de Micrótomos

Dividem-se em 2 grandes categorias:

• Lâmina Móvel: bloco está fixo e a faca é que se desloca (ex.: M. Corrediça).
• Lâmina Fixa: lâmina está fixa e o bloco é que se desloca (ex.: M. Minot).

Micrótomo de Corrediça
• O bloco está fixo no porta-blocos e desloca-se num plano vertical
ascendente em relação à lâmina, em cada corte.
• A faca/lâmina é colocada no porta-facas e movimenta-se num plano
horizontal em relação ao bloco – este movimento é possível devido
ao mecanismo de corrediças deste micrótomo.

Características:
• Aconselhado na execução de cortes de fragmentos incluídos em
celoidina e em blocos de parafina de grande superfície.
• Dificuldade na execução de cortes seriados (“ténias”).
Mícrótomo de Minot
• Micrótomo rotativo.
• Deslocamento vertical do bloco, por ação de uma manivela
adaptada a uma roda que efetua um movimento giratório.
• Um sistema de rodas dentadas assegura um movimento
horizontal e regular do porta-facas condicionando a
homogeneidade de espessura dos cortes.

Características:
• Maior facilidade na realização de cortes seriados.
• Principal tipo utilizado nos crióstatos.
• Não permite um controlo tão pormenorizado dos fatores que influenciam o processo de
corte (ex.: temperatura do bloco).

Tipos de Facas
• A seleção do tipo de faca mais adequado e o seu ângulo de inclinação no porta-facas
dependem da natureza da peça e do meio utilizado na impregnação e inclusão.
• Uma faca afiada com um gume sem defeitos é essencial para obter cortes de qualidade.
• Apesar de um processamento com pouca qualidade, quando se utiliza uma boa faca,
pode ser possível obter cortes.
• Cortes impossíveis de diagnosticar podem resultar de uma faca de má qualidade,
mesmo que o processamento seja bom.

Facas para Micrótomos

Material Utilizado no Corte

Para além do micrótomo e do bloco com o fragmento, existe ainda toda uma variedade
de material necessário para que se possa obter um corte com qualidade:

• Pincel
• Pinças (preferencialmente curvas)
• Agulha histológica
• Tina com água fria
• Banho-maria, termostasticamente controlado
• Lâminas
• Suporte de lâminas
 • Lápis

Pincel, pinças e agulha histológica

• Utilizados para a manipulação dos cortes durante a microtomia e para a remoção das
possíveis pregas, quando se encontram na água fria.

Tina com água fria

• É o local onde se colocam os cortes após serem efetuados.
• O fundo deve ter uma base escura de modo a visualizar e selecionar os cortes.
• É nesta etapa que procede à remoção de pregas, caso existam, e finalmente são
apanhados com a lâmina.

Banho-maria
• Após a passagem pela água fria os cortes são submetidos ao calor
da água quente para que ocorra a sua extensão.
• O aparelho deve apresentar uma base escura de forma a ser mais
fácil a visualização e seleção dos cortes que apresentam maior
qualidade.
• Temperatura da água recomendada: 45-55℃.

Lâminas
• Utilizadas para apanhar o corte na água fria.
• O fragmento segue nas lâminas o resto da técnica histológica.
• Espessura recomendada: 1,0 a 1,2 mm.
• Adaptam-se melhor às ranhuras das caixas de transporte e possuem
resistência suficiente.

Suporte de lâminas
• Local onde se colocam as lâminas para depois irem à estufa.
• Podem ser de vidro ou de plástico.
• Se forem de plástico, deve ser de resistente a temperaturas elevadas.

Lápis
• Identificar as lâminas.
• Coloca-se o n.º no canto fosco das lâminas, n.º que acompanha toda a técnica
histológica.
• No caso de as lâminas não possuírem canto fosco utiliza-se a caneta de ponta de
diamante para se proceder ao registo.
Técnica de Corte
Durante o corte, o técnico deve estar sentado e assumir uma posição confortável, isto
porque não deve descurar da sua saúde física, já que esta técnica pode demorar horas.

• Preparação do micrótomo e do material

• Colocação do bloco no porta-blocos
• Execução de cortes
• Temperatura do bloco e da faca
• Velocidade de corte
• Características especiais
• Formação de cortes seriados

Preparação do Micrómoto e do Material

• No caso do micrótomo de corrediça, verificar se estas estão a trabalhar bem, de outra
forma devem ser bem oleadas.
• Encher uma tina de água fria – destilada ou corrente – onde os cortes vão ser colocados
e retiradas as pregas, caso existam, com o auxílio de um pincel, agulha histológica ou
pinças curvas.
• Verificar a água do banho-maria: deve estar limpa e com temperatura controlada, para
que não aqueça em demasia (situação que pode danificar os cortes).
• A temperatura deve-se situar alguns graus abaixo do ponto de fusão da parafina.
• Colocar a faca no porta-facas de forma segura para evitar possíveis acidentes.
• Apertar bem os parafusos de aperto para evitar a vibração da faca durante o corte, facto
que pode inutilizar os cortes e até mesmo o próprio bloco.
• Escolher um ângulo que permita obter cortes de qualidade de uma forma geral.

Colocação no Bloco no Porta-blocos

• Colocar o bloco na posição que ofereça a menor resistência
possível ao corte.
• Orientá-lo de forma que o fragmento seja apanhado na sua
totalidade, livre de pregas, fendas e distorção celular.

Execução de Cortes
• De forma a remover o excesso de parafina e expor a área
do fragmento adequada para o corte.
• Desbaste: espessura a 30 μm (maior rapidez).
• Selecionar de seguida a espessura de corte mais adequada
ao tipo de tecido (2 a 3 μm).
• Situações especiais:
o Amiloide – 10 μm.
o Mielina – 15 μm.
o Fragmentos neurológicos – 15 a 20 μm.
Temperatura do Bloco e da Faca
• Antes do corte, colocar os blocos numa placa fria para facilitar o processo.
• Após uma série de cortes, quer o bloco como a faca, devido à constante fricção, podem
aquecer em demasia, devendo ser arrefecidos para que os cortes sejam de qualidade.
• Fragmentos de cérebro, medula e gânglios linfáticos – arrefecer apenas a faca.

Velocidade de Corte
• É variável consoante a natureza das peças.
• Quanto mais duro e menor for o fragmento, maior a
velocidade a utilizar.
• Uma velocidade menor deve ser utilizada quando os
tecidos são moles e maiores.

Características Especiais
Fragmentos Hemorrágicos:

• Passar sobre a superfície do bloco uma solução alcalina de hidróxido de amónia a 10% -
amacia o tecido, previne a sua rutura e facilita o corte.

Tecidos Calcificados:

• Se apresentarem depósitos de cálcio que dificultam o corte o bloco pode ser sujeito à breve
ação de um descalcificador (ex.: RDO).

Formação de Cortes Seriados

• A formação de cortes seriados deve ter em conta a velocidade de rotação imposta (ao
micrótomo de Minot), pois quando muito elevada pode causar a formação de uma ténia
com cortes de diferentes espessuras.

Técnica de Corte – Problemas, Causas e Soluções

 Causas Soluções Imagens
• Problemas no micrótomo • Fixar bem a faca e o porta-
• Suporte fixado de forma blocos
Cortes de errada • Arrefecer o bloco
espessuras • Bloco quente
diferentes • Tentativa de corte
demasiado fino
• As arestas do bloco não • Recortar o bloco de forma
são paralelas que as faces sejam
Ténia encurva • Variação na consistência paralelas
(corte) dos tecidos • Mudar zona da faca
• Gume da faca com defeito

• TA baixa • Monitorizar TA do lab.

• Gume da faca com • Fazer cortes mais finos
Os cortes enrolam e impurezas • Limpar o gume da faca
não formam ténias • Ângulo inadequado à faca • Ajustar o ângulo da faca

• Faca com defeitos. • Mudar a zona da faca ou

• TA demasiado elevada. de faca.
• O bloco encontra-se perto • Monitorizar TA do lab.
Os cortes de uma fonte de calor. • Arrefecer o bloco.
comprimidos e • Velocidade do corte muito • Cortar mais devagar.
plissados rápida. • Limpar o gume da faca.
• Restos de parafina no • Repetir a impregnação.
gume da faca.
• Impregnação incompleta.
• Tecido rico em sangue ou • Fazer cortes mais
oxidou excessivamente. espessos.
• Velocidade de corte • Evitar cortar muito
Os cortes quebram-
rápida. rapidamente.
se e pulverizam-se

• Faca com defeitos. • Mudar zona da faca ou

• Calcificações, agrafos,
linhas de sutura.
• Faca com restos de
Cortes rasgados e parafina.
com estrias
faca.
• Utilizar os procedimentos
adequados para eliminar
calcificações, agrafos e
linhas de sutura.
• Entre cada corte limpar a
faca.
 • Processamento histológico • Repetir o processamento
incompleto. histológico até à etapa
Áreas do tecido em realizada de forma
bloco não presentes insuficiente.
no corte

• O bloco não está • Orientar o bloco de forma

perfeitamente alinhado que o fragmento esteja
com a faca. totalmente presente no
Cortes incompletos corte.

A deficiente clarificação
Neste bloco hidratado trata-se de uma zona em que
temos uma consistência não conseguimos ver em
heterogénea – tem um buraco pormenor as células, porque o
no centro. agente diafanizador não entrou
de forma homogénea, não
permitindo a entrada dos
agentes seguintes.

O fenómeno de Chatter ocorre devido à vibração dos componentes do micrótomo ou

variações de temperatura. Já os defeitos no gume da faca (também designados por “bocas”)
tratam-se de defeitos da faca que se manifestam no corte sempre na mesma posição.

Extensão
• Os cortes de parafina têm 2 faces diferentes – uma superior, rugosa e opaca, e outra
inferior, lisa e brilhante.
• Face brilhante virada para a água, porque é aquela que por capilaridade, adere melhor
à lâmina de vidro.
• Ter o cuidado de não deixar bolhas, porque diminuem a adesão à lâmina e poderão
produzir artefactos na coloração, diminuindo a sua qualidade e dificultando a sua
análise ao microscópio.
 • Permanência do corte na água quente apenas o tempo suficiente para permitir a sua
extensão completa.
• Este processo não deve ser demasiado prolongado de forma a evitar a expansão dos
tecidos para além do seu tamanho original e evitar a distorção estrutural.
• Diversos tecidos apresentam zonas (ex.: cartilagem e mucinas) com diferentes
capacidades de distensão, resultando em cortes cuja extensão é pouco uniforme na
água quente.
• Neste caso o processo deve ser mais longo como forma de uniformizar o corte.

Adesão
• Em determinadas situações é exigido, em vez de utilizar apenas água, a utilização de
substâncias que promovam a adesão dos cortes às lâminas.
• Estas substâncias podem ser: gelatina, albumina-ovo, APES-Silane, cargas
electroestáticas.

Incidentes e contratempos da extensão

Defeitos
Cortes com pregas que não saem
Presença de bolhas de ar debaixo
dos cortes
Cortes com pouca aderência à
lâmina e que se descolam com
facilidade
Causas prováveis
• Utilização de uma faca com
defeito
• A água da extensão está
demasiado fria
• A peça é dura e fibrosa
• Cortes apanhados na lâmina de
forma errada
• Ar proveniente da água, retido
durante a extensão e secagem
• Lâminas não limpas.
• A parafina fundiu durante a
extensão.
• Cortes mal apanhados (face
brilhante para cima).
Soluções
• Realizar novos cortes com outra
zona da faca ou mudar de faca
• Controlar a temperatura da água
• Estender bem os cortes antes de
os apanhar na lâmina
• Utilizar lâminas sem qualquer
vestígio de parafina.
• Controlar a temperatura da água.
• Colocar a face brilhante para
baixo na água.

Criotomia
• Para um rápido diagnóstico, realização de técnicas especiais – estudos enzimáticos,
pesquisa de lípidos.
• Usado em cortes de congelação.
• Cortes com espessura inferior a 15-20 μm.
• Micrótomo do tipo Minot + câmara refrigerada estanque (até -30℃)
Criótomo – Recomendações
• A temperaturas específicas os tecidos têm uma firmeza diretamente relacionada com o
seu conteúdo em água e lípidos.
• Para cada tipo de tecido existe uma temperatura ótima de corte.
• Os crióstatos estão habitualmente a -20℃ para a maior parte dos fragmentos.
• Cérebro, gânglios linfáticos, fígado e baço requerem temperaturas ligeiramente
elevadas.
• Lípidos – ambientes muito mais frios.

OCT (o oct é colocado numa peça metálica circular e colocamos também lá o fragmento)
é colocado no aparelho e é como que o nosso molde, é como um meio de inclusão – oct vai
refrigerar.

Os cortes de congelação vão ficar diretamente na lâmina neste caso.

Ultramicrotomia
• Micrótomo + mistura de microscópio.
• A espessura do corte histológico é um fator determinante na resolução obtida no ME.
• Produção de cortes extremamente finos (100 a 120 nm).
• Para obter estes cortes é necessário incluir os fragmentos num material
mais duro que a parafina – resinas epóxi.
• Micrótomo de tipo Minot com algumas modificações.
• 2 oculares para visualizar o processo de corte (os blocos e os cortes são
pequenos).
• Facas de vidro ou diamante.
• O ultramicrótomo deve estar numa bancada própria, livre de vibrações.
• Inclusão na ultramicrotomia é uma etapa irreversível.
Recolha do corte
• Os cortes são posteriormente recolhidos em grades de ouro, cobre ou outros metais.

Coloração Hematoxilina-Eosina
• Este é um método de coloração histológica combinada ou em conjunto – efetuada com
recurso a 2 corantes.
• Existem múltiplas variantes, segundo o tipo de hematoxilina ou de eosina utilizadas. A
mais usada é a hematoxilina de harris.
• Este método consta sempre de uma fase inicial em que se coram os núcleos com
hematoxilina e uma fase posterior de contraste citoplasmático e dos componentes
extracelulares com a eosina.

Coloração H&E
Consiste na utilização conjunta de:

• 1º Corante nuclear – Hematoxilina.

• 2º Corante citoplasmático – Eosina (tem afinidade para várias estruturas, logo é
colocada em segundo lugar para não saturar)
• Boa coloração da arquitetura tecidular geral.
• Condições para uma boa coloração: fragmentos bem processados, corantes de
qualidade e rigor técnico.
• Deve haver um bom contraste em colorações para distinguir bem as cores que vão corar
estruturas distintas.

Protocolo
• Desparafinização (com recurso ao xileno) – 10 min
• Hidratação (passagens com agitação):
 o Álcool 100° (não tem nenhuma água)
o Álcool 95°
o Álcool 70°
• Água
• Hematoxilina (corante aquoso) – 10 min (cora os
núcleos e mais que isso)
• Água – lavagem para retirar excessos
• Diferenciador (álcool clorídrico – constituído pelo
etanol a 70) – 5- 15 segundos—remove o excesso e
ficamos só com os núcleos corados – coloração
regressiva, (coloração progressiva seria se hematoxilina tivesse só, por exemplo, 2 min
e aí não necessitávamos de um diferenciador)
• Água – azular – água corrente – 5 minutos
• Álcool 70° - passagem
• Eosina (alcoólica) – 1 min – diferenciador da eosina é aquoso logo é água a 4%
• Desidratação (passagem com agitação):
o Álcool 95° - não usamos etanol a 70 porque a [ ] da água assim é muito alta
o Álcool 100° - remove totalmente a água
o Álcool 100°
• Clarificação – xileno – 5 minutos
• Montagem

Notas:

✓ Colocar na estufa a 60℃ e o tempo mínimo que as lâminas devem lá estar é 30 minutos,
pode-se ainda regular a estufa para 70℃.
✓ Quando as lâminas vão para a estufa passa a haver adesão do tecido à lâmina. A parafina
encontra-se dentro dos espaços das células.
✓ As lâminas no xileno ficam transparentes.
✓ O Álcool clorídrico está entre 0,5 e 1%. Trata-se de uma concentração baixa para
controlar o processo que é muito rápido.
✓ Xileno no mínimo tem de estar 5 minutos.

Hematoxilina-eosina, Resultados
• Núcleo – Azul a preto
• Citoplasma – várias tonalidades de rosa
• Fibras musculares – vermelho a rosa forte
• Eritrócitos – vermelho a laranja
• Fibrina – rosa forte
Hematoxilina
• É o corante natural mais usado para corar
o núcleo.
• Obtida a partir de uma planta
(Haematoxylon campechium).
• Não é um verdadeiro corante (o seu
produto de oxidação é que é).
• Produto de oxidação: hemateína.

Hemateína
• Corante aniónico fraco (logo não tem grande afinidade para
ácidos nucleicos).
• Fraca afinidade para o tecido, desta forma é inadequada como
coloração nuclear sem a presença de um ião mordente.
• Cora estruturas de natureza ácida.
• Oxidação natural ou química, sendo a química é mais rápida.

Oxidação Natural
• Exposição à luz e ao ar.
• Processo lento (3 a 4 meses).
• Mantém as propriedades corantes durante mais tempo.
• Ex.: Hematoxilina de Delafield, Hematoxilina de Ehrlich.

Oxidação Química
• Utilização de agentes químicos de carácter oxidante como: iodato de sódio, óxido de
mercúrio, permanganato de potássio, etc.
• Oxidação de hematoxilina a hemateína provoca o aparecimento de 1 anel
paraquinónico – atua como cromóforo.
• Hemateína obtida possui carga electroestática fracamente ácida.
• Conversão rápida de hematoxilina em hemateína.
• Perca de propriedade corante mais rapidamente.
• Tempo de oxidação é crucial – leucoderivados.
• Retardar o processo de oxidação – utilizar soluções ácidas.
• Espelhado dourado à superfície da solução – sobre-oxidação.
• No processo de oxidação o pH do solvente utilizado é fundamental:

Mordentes (fazem ligação ao tecido)

As hematoxilinas podem ser classificadas de acordo com os mordentes utilizados:
 • Alumínio – mais usadas
• Ferro – mais usadas
• Chumbo
• Tungsténio
• Molibdénio
• Sem mordente

Convém que as hematoxilinas tenham uma oxidação logo artificial, pois permite que a
hemateína seja produzida.

Hematoxilinas Alumínicas
• Harris – usada em laboratório
• Mayer – usada em imunocitoquimica
• Carazzi
• Cole
• Ehrlich
• Delafield
• Gill – usada em alguns hospitais e laboratórios
• O ião metálico é o alumínio, usualmente sob a forma de sulfato alumínico de potássio
ou sulfato alumínico de amónia.
• Coram o núcleo de vermelho, o qual é convertido numa mescla azul a preta quando a
secção é lavada com uma solução alcalina fraca.
• O tempo para a coloração bem como para uma diferenciação satisfatória é variável de
acordo com o tipo e longevidade da hematoxilina utilizada (e a preferência pessoal do
patologista).
• Na coloração de rotina de HE a hematoxilina mais utilizada é a de Harris.
• A hematoxilina de Carazzi é ocasionalmente utilizada, particularmente para secções
congeladas urgentes.

Hematoxilina de Harris
• Mais utilizada na coloração de rotina
• 5 – 15 min
• Grande estabilidade (6-12 meses)
• Iodato de sódio ou potássio (substituem o óxido de
mercúrio) – agentes oxidantes
• Usada de forma regressiva ou progressiva
• Diferenciadores: álcool acético ou clorídrico

Hematoxilina de Mayer
• Mais utilizada em ICQ – as marcações são
castanhas, núcleos corados e não só, tem de
haver uma boa diferenciação entre núcleo e
citoplasma e um bom contraste no corante.
• 5 – 10 min
• Iodato de potássio
• Progressiva ou regressiva
 • Esta hematoxilina é amadurecida quimicamente com iodato de sódio.
• Pode ser utilizada como corante regressivo e progressivo, nesta última situação pode
ser verificada quando existe a necessidade de dar ênfase a um componente
citoplasmático.
• É utilizada como coloração de contraste nuclear para demonstração de glicogénio em
várias técnicas histológicas enzimáticas.
• Este corante é aplicado durante 5 a 10 minutos.

Hematoxilina de Carazzi
• Esta hematoxilina é igualmente utilizada, tal como a de Mayer, para contraste nuclear
progressivo durante um período curto de tempo.
• Utilizada em secções congeladas nos exames extemporâneos.
• 45 seg.
• Iodato de potássio
• Progressiva

Hematoxilina de Cole
• Iodina alcoólica (agente oxidante)
• 20 – 40 min. Devido a este elevado tempo de atuação não é muito utilizada.

Hematoxilina de Ehrlich
• Iodato de potássio (2 meses de amadurecimento).
• Propriedades ácidas, sendo, por isso, a coloração nuclear menos intensa.
• Coloração nuclear menos intensa (pois os núcleos já são ácidos).
• Modo de atuação mais lento (20-45 min.).
• Tecidos expostos a substâncias ácidas ou fixados durante muito tempo.
• Coloração excelente para o núcleo, capacidade de corar mucinas, incluindo
mucopolissacáridos cartilagíneos.
• É recomendada para corar osso e cartilagem, uma vez que se liga às mucinas.

Hematoxilina de Delafield (bom substituto para a hematoxilina de mayer)

• Esta hematoxilina com amadurecimento natural das hematoxilinas com ião metálico
alumínio possui uma longevidade semelhante à hematoxilina de Ehrlich.
• Esta hematoxilina cora os núcleos celulares de azul celestial e é ideal para realizar
contraste em técnicas histoquímicas e de carácter imunológico.

Hematoxilina de Gill
• É utilizada como coloração de rotina
em maior proporção do que a de
Mayer.
• É mais estável que a de Harris, isto
porque a auto-oxidação é inibida
fazendo com que não ocorram reações
durante muitos meses.
• As desvantagens associadas com esta hematoxilina residem no facto
de escurecer alguns mucos em comparação com a de Harris, entre outras...
 • Iodato de sódio.
• 5 – 15 min.
• Muito estável, pouca auto-oxidação.
• Desvantagens: origina manchas em lâminas adesivadas, cora o muco numa tonalidade
muito escura.

Desvantagens das Hematoxilinas Alumínicas

• A maior desvantagem é a sensibilidade à aplicação de substâncias ácidas, como por
exemplo: Van Gieson e tricrómios.
• A aplicação da mistura de ácido pícrico e fucsina ácida ao Van Gieson remove a maioria
da hematoxilina do núcleo.
• Nestes casos, uma coloração satisfatória do núcleo pode ser conseguida com a utilização
da hematoxilina de Weigert, que é resistente ao efeito do ácido pícrico.
• Atualmente, existe também a combinação das hematoxilinas alumínicas com o azul de
celestina.
• O azul de celestina é resistente aos efeitos do ácido.

Hematoxilinas Férricas
• Os sais de ferro são utilizados simultaneamente com agentes oxidantes e como
mordentes.
• A maioria dos sais férricos utilizados são cloreto de ferro e o
sulfato de amónio férrico.
• Problema: forte oxidação destas hematoxilinas.
• Preparação separada do mordente/oxidante e da solução de
hematoxilina e misturá-las imediatamente antes da sua
utilização (ex.: hematoxilina de Weigert).
• Weigert
• Heidenhain
• Loyez
• Verhöeff

Hematoxilina de Weigert
• Esta é uma hematoxilina em que o cloreto de
ferro é utilizado como mordente e oxidante.
• O ferro e a hematoxilina são preparados
separadamente e misturados imediatamente
antes da sua utilização.
• Solução de Hematoxilina + Solução Férrica
(1:1)

Hematoxilina de Heidenhain
• Sulfato de amónio férrico – oxidante e mordente.
• Todos os componentes ficam de cor negra ou verde-escuro.
• A hematoxilina é posteriormente removida das diferentes estruturas tecidulares:
mitocôndrias, estriações musculares, cromatina nuclear e a mielina podem ser
demonstradas por esta respetiva ordem.
 • Uma diferenciação prolongada irá remover o corante de quase todas as estruturas, no
entanto os eritrócitos e a queratina são estruturas que retêm o corante por mais tempo.

Hematoxilina de Loyez
• É uma hematoxilina férrica em que o
sulfato férrico de amónio é utilizado
como mordente.
• É utilizada para demonstrar mielina e
pode ser aplicada a secções em
parafina, congeladas e nitrocelulosicas.

Hematoxilina de Verhöeff
• Esta hematoxilina é utilizada para demonstrar
fibras elásticas corando-as de preto.
• Este contraste é ideal para fotomicrografias.

Hematoxilina com Tungsténio

• Existem variantes da original técnica de Mallory PTAH.
• Técnica de coloração PTAH com hemateína.
• Solução de PTAH – oxidação química com
permanganato de potássio ou natural.

Hematoxilina com Molibdénio

• São raras as hematoxilinas que utilizam o ácido molibdénico como mordente.
• A única técnica aceite é a de Thomas (1941) a qual foi mencionada por McManus &
Mowry (1964).
• Este método é recomendado para a demonstração de colagénio e folhetos de reticulina,
no entanto existem técnicas mais válidas para as fibras de tecido conectivo.

Hematoxilinas com Chumbo

• As hematoxilinas que incorporam sais de chumbo têm sido recentemente utilizadas na
demonstração de grânulos em células endócrinas no trato digestivo e em outras regiões.
• A maior aplicação relativamente a diagnóstico é a de identificação de células
endócrinas em tumores de origem duvidosa, contudo também é utilizada em
procedimentos de investigação tais como a localização de células gástricas no estômago.
Hematoxilinas sem Mordente ou Ião Metálico
• Soluções frescas de hematoxilina, sem mordente, têm sido utilizadas de forma a
demonstrar vários minerais nas secções tecidulares.

Mordente Oxidação Exemplos Aplicações

Alumínio Natural Ehrlich Núcleo + eosina, mucinas
Alumínio Natural Delafield Núcleo + eosina
Núcleo + eosina,
Alumínio Iodina de Sódio Mayer
contraste nuclear
Alumínio Óxido de Mercúrio Harris Núcleo + eosina
Alumínio Iodina de Sódio Cole Núcleo + eosina
Núcleo + eosina (secções
Alumínio Iodato de Potássio Carazzi
congeladas)
Alumínio Iodina de Sódio Gill Núcleo + eosina
Ferro Natural Weigert Núcleo + corantes ácidos
Detalhes intra-nucleares,
Ferro Natural Heidenhain
estriações musculares
Ferro Natural Verhoeff Fibras elásticas
Ferro Natural Loyez Mielina
Fibrina, Estriações
Tungsténio Natural Mallory; PTAH
musculares, fibras gliais
Colagénio, grânulos
Molibdénio Peróxido de Hidrogénio Thomas
endócrinos
Chumbo Solcia Grânulos endócrinos
S/ mordente Mallory Ferro, chumbo

Eosina
• A eosina é o corante mais apropriado para se combinar com a hematoxilina –
demonstra a arquitetura histológica geral, porque:
o Diferencia o citoplasma de diferentes tipos de células.
o Diferencia diferentes tipos de tecido conjuntivo, fibras e matrizes
(tonalidades rosa a vermelho).
• Corante fracamente ácido.
• Pertence ao grupo das fluoresceínas.
• Contém 4 mol de Br.
• Facilmente solúvel na água.
 • Cora o citoplasma, conjuntivo e fibras de colagénio.
• Diferencia-se com água.

Tipos de Eosinas
A diferença está no tipo e n.º de átomos de halogéneos que contém:

• Floxina, 2 átomos de Cl e 4 de Br.

• Eosina Y, 4 átomos de Br.
• Eosina B, 2 átomos de Br.

Eosina Alcoólica
• Eosina Y
• Água destilada
• Etanol a 95%
• Ácido acético glacial

Eosina Aquosa
• Eosina Y 5% em água destilada (sol.
stock).
• Sol de stock / água destilada, 1⁄4
(solução de trabalho).

Eosina Precipitada
• Eosina Y 5% / dH2O, HCl (8mL) pp 24 h, decantar, 1ª imagem: Eosina alcoólica;
lavar o pp dH2O (6X, 500 ml). 2ª imagem: Eosina aquosa;
• Secar o pp 37 ℃. 3ª imagem: Eosina precipitada.
• Dissolver o pp em 800 ml de etanol a 95%.
• Coloração em 30 - 60 segundos.

Algumas Recomendações
• Adicionar 1 gota de ácido acético glacial:
o Favorece o contraste pela interrupção do meio alcalino (azul).
o Evita que a solução volte a alcalina depois de lavado.

Contratempos na Coloração H&E

 Problema
Aparecimento de manchas brancas
nas lâminas após desparafinação.
Formação de pp azul ou negro no
topo dos cortes.
Núcleos demasiado pálidos.
Núcleos demasiado corados e
citoplasma basófilo.
Coloração pálida com a eosina.
Citoplasma demasiado corado.
Coloração difusa e em áreas
irregulares. Núcleos com pouco
detalhe.
Basófila generalizada, muito
acentuada nos núcleos e nos
contornos tecidulares.
Pigmento grosseiro nas lâminas,
castanho ou preto.
Após hidratação, as lâminas e a água
apresentam aspeto leitoso.
As lâminas apresentam aspeto
leitoso na última passagem por xilol.
Causas prováveis
• Secagem inadequada antes da •
desparafinação.
• Clarificação incompleta.
• As lâminas devem voltar ao xilol e
• Oxidação da hematoxilina com •
formação de camada metálica na
superfície da solução.
• Pouco tempo em hematoxilina.
• Corte muito fino.
• Hematoxilina demasiado oxidada.
• Diferenciação longa.
• Demasiado tempo em
hematoxilina.
• Cortes muito grossos.
• Diferenciação curta.
• Muito pouco tempo em eosina.
• pH acima de 5.
• Corte muito fino.
• Demasiada desidratação.
• Eosina muito concentrada.
• Muito tempo na eosina.
• Desidratação insuficiente.
• Má fixação.
• Contaminação da parafina por •
água.
• Possível artefacto causado pelo •
calor.
• Secagem do corte antes da •
aplicação da lamela.
• Xilol não foi completamente •
removido pelos álcoois.
• Desidratação insuficiente.
Soluções
Imergir as lâminas em etanol
100% para remover a água em
excesso.
permanecer imersas durante mais
alguns minutos.
Antes de usar a solução de
hematoxilina, remover a camada
metálica (aspeto espelhado
dourado).
• Voltar a corar aumentando o
tempo na hematoxilina.
• Filtrar ou substituir a
hematoxilina.
• Obter um novo corte.
• Diminuir o tempo no
diferenciador.
• Descorar e ajustar a coloração
e/ou diferenciação.
• Obter novo corte.
• Ajustar o pH para valores entre 4,6
e 5.
• Obter novo corte.
• Assegurar uma perfeita
desidratação, realizando imersões
mais curtas nos álcoois.
• Diluir solução de eosina.
• Diminuir tempo na eosina.
• Assegurar uma perfeita
desidratação, realizando imersões
mais longas nos álcoois.
• Voltar ao fragmento original.
Diminuir a humidade no lab.
Obter novo corte e realizar nova
coloração.
Remover a lamela e o meio de
montagem e re-hidratar, voltar a
desidratar, clarificar e montar.
Substituir os álcoois e,
posteriormente, retornar as
lâminas para o álcool absoluto e
desidratar os cortes.
• Substituir as soluções de etanol e
xilol e, posteriormente, re-
desidratar os cortes e imergi-los
na nova solução de xilol.
 Montagem
A montagem consiste na fixação, através de um meio apropriado, de uma lamela à
lâmina na zona do corte.

Objetivos:

• Proteção mecânica dos cortes (sem a lamela pode haver

danificação do corte aquando da visualização ao microscópio).
• Proteção química dos corantes (pois desta forma não há reações
face exposição ao ar).
• Obtenção de uma amostra com índice de refração homogénea. –
índice tem de ser mais ou menos idêntico, porque na parte da
microscopia precisamos que a lâmina, vidro, lamela e meio de
montagem tenham um índice homogéneo para que quando
passe a luz na microscopia de campo claro se possa ter uma
imagem projetada (de baixo para cima).

Nota: As lamelas permitem o arquivo da lamina, mas tem de estar secas. A sua secagem ocorre
sempre na horizontal, pois, caso contrário, a lamela escorrega.

Tipos de Meios de Montagem

Os meios de montagem podem ser:

• Resinosos (o que geralmente usamos é o xilol e este inclui-se neste grupo)

o Naturais
o Semissintéticos
o Sintéticos
• Hidrossolúveis (solúveis em água, preparações pouco duráveis)

Os meios sintéticos/resinosos são permanentes e práticos, já os meios hidrossolúveis

são utilizados em situações especiais, tais como: quando o corante é solúvel nos álcoois ou xilol,
Imunofluorescência, entre outros.

Os mais utilizados são à base de glicerina.

Não necessitam de lâminas desidratadas e clarificadas, utilizam-se imediatamente a

seguir aos corantes.

Meios de Montagem Naturais

• Glicerina.......................1,470
• Óleo de cedro...............1,510
• Bálsamo do Canadá......1,530 (são os mais vistos na literatura)

Nota: Os números que aparecem à frente dos meios são os índices de refração.
Meios de Montagem Sintéticos
• Clearmount.....................1,515
• HSR..................................1,540
• DPX..................................1,600
• Entellan............................1,650 (mais usado)

Critérios dos Meios de Montagem

• Possuir índice de refração idêntico ao do vidro.
• Ser miscível no agente clarificador, que, normalmente, é o xilol.
• Ser quimicamente estável, não mudando de cor nem de pH. A coloração de
hematoxilina/eosina dá-se por reações ácido base, portanto não queremos alterações
nenhumas.
• Homogéneo.
• Transparente, incolor.
• Inalteráveis com o tempo.
• Endurecer sem distorcer nem retrair o tecido.
• Endurecer sem formar bolhas e rachar.
• Não alterar as cores da coloração.
• Ser suficientemente líquido para permitir a expulsão das bolhas de ar que se acumulam
durante a montagem. As bolhas de ar não devem existir idealmente, mas se existirem
não deve ser nunca em cima do tecido.
• Endurecer rapidamente para permitir a manipulação das lâminas.

Funções dos Meios de Montagem

• Preservar/conservar o material
• Facilitar a sua visualização
• Facilitar o seu transporte
• Facilitar o seu arquivo

Técnica de Montagem
• Escolha da lamela apropriada. Se pudéssemos escolher só um tamanho de
lamela escolhemos a maior.
• Delgada, índice de refração 1,5.
• Superfície plana.
• Formato apropriado ao corte.

Notas: As lamelas mais frequentemente utilizadas são as 24 por 24 (na AP).

O que varia normalmente nas lamelas é o comprimento, existem as de 32,

50 e 60 (comprimento do canto fosco até ao fim são muito utilizadas em citologia,
nos esfregaços, porque estas apanham a lamina toda). As lamelas são escolhidas de acordo com
o tamanho do fragmento.

Na montagem podem ser usados os dedos (com luvas para não ficarem lá impressões
digitais), podem também ser utilizadas as pinças de bico de pato, que têm uma superfície maior
a fim de conseguirem agarrar melhor a lamela.
 • Limpar o excesso de meio.
• Etiquetar convenientemente.
• Informação legível.
• A informação deve estar centrada.

Técnica de Montagem – Lutagem

• A lutagem é um termo que em Histopatologia significa que é além da montagem.
• Colocação de um componente impermeável em torno da lamela (como se fosse um
verniz).
• Impede a evaporação e deterioração dos meios de montagem hidrossolúveis.
• Utilizado para incubações. Temos uma lâmina e um fragmento e queremos ver se um
gene está a transcrever ou não, faz-se para isso uma sonda para ver se o gene que se
quer é responsivo ou não. As incubações são feitas em estufa.

Controlo de Qualidade em Histopatologia

Controlo de Qualidade
• A qualidade num laboratório de Histopatologia é cada vez mais uma meta a ser
cumprida face ao bem-estar do utente e ao mercado competitivo.
• Deve-se assegurar que não existem erros que determinam falsos resultados.
• Controlo interno (intra-laboratorial). Este é
feito por pessoas dentro do laboratório.
• Controlo inter-laboratorial. É realizado entre
laboratórios ou instituições, há casos em que
temos de ver realmente se o trabalho
elaborado por nós está bem feito e, por vezes,
temos de comparar com outros laboratórios
para evitar erros grandes.
• Representações positiva acerca do laboratório.
• Em programa de controlo de qualidade deve
considerar todas as etapas da técnica
histológica.
• Montante: colheita do tecido fresco.
• Jusante: Diagnóstico.
Controlo de Qualidade Interno
• Para atingir estes objetivos deve ser efetuada uma auditoria às atividades que
no seu conjunto permitem um diagnóstico.
• Este processo deve ser contínuo e possibilitar a medição da qualidade de
forma a estimular a incrementar a qualidade.
• Controlo de qualidade deve ser feito pelo:
o Técnico responsável
o Técnico coordenador
o Anátomo-Patologista

Controlo Inter Laboratorial

• Como é que um laboratório “sabe” que efetua os procedimentos mais corretos para a
obtenção de um melhor diagnóstico?
• Comparação com um “padrão” externo.
• Envio de um conjunto de tecidos a fresco que devem acompanhar paralelamente a
rotina do laboratório.
• Posteriormente as lâminas são avaliadas e é “medida” a sua qualidade por um
organismo externo.
• São identificados os pontos a melhorar.

Fatores de Influência
• Procedimentos corretos.
• Equipamento em boas condições.
• Pureza dos reagentes.
• Validade dos produtos a utilizar.
• Padronização correta de reagentes.
• Laminas teste.
o Trata-se de uma lamina que já sabemos o que está lá e, por
isso, sabemos o resultado (serve como controlo). Assim,
para ver se a lamina que a seguir obtemos está bem ou não
usamos esta lamina teste. É controlo positivo, porque tem
algo na lamina.

Critérios Avaliados
• Fixação: adequação e pigmentos.
• Descalcificação: pouco ou muito descalcificado.
• Processamento: adequação.
• Inclusão: orientação, calcamento.
• Microtomia: espessura, cortes pouco fundos, artefactos de vibração, marcas de faca,
defeitos no gume da faca, chatter, entre outros...
• Hematoxilina: intensidade, contraste, detalhe da cromatina, diferenciação.
• Eosina: intensidade, seletividade, diferenciação.
• Outros artefactos: resíduos de parafina.
• Montagem: bolhas de ar, quantidade de meio de montagem.

Metodologia de um Programa de Qualidade

 • Coligir informações e conhecer a prática corrente e real.
• Recolher e conhecer critérios e padrões → indispensáveis
para a comparação e formulação de considerações.
• Comparar a prática real com padrões e identificar
eventuais deficiências.
• Propor mudanças e correções.
• Re-avaliação do ciclo.

Razões para a Implementação da Qualidade

• Elevação dos níveis de qualidade dos laboratórios.
• Ética – valida todos os processos que tendem a aperfeiçoar as atividades da saúde, bem-
estar, vida.
• Segurança – justifica a proteção do doente/utente e a redução de margens de risco.
• Social – Direito à Saúde, Responsabilização, Confiança.
 Histotecnologia – Aulas Práticas
Exercícios
1) Preparar 500ml de álcool clorídrico a 1%. O álcool clorídrico é constituído por HCL e ETOH a 70%

HCl:

Ci × Vi = Cf × Vf ⇔ 100 × Vi = 1 × 500 ⇔ Vi = 5 ml de HCl

500 − 5 = 495 ml
ETOH:

Ci × Vi = Cf × Vf ⇔ 70 × Vi = 70 × 495 ⇔ Vi = 495 ml de ETOH 70%

Materiais para preparar esta solução:

• Proveta de 500 mL para medir 495 mL de ETOH 70%.

• Pipeta mais respetiva pompete para medir 5 mL de HCl. Após as medições colocar tudo
num balão volumétrico de 500 mL e fazer a homogeneização. Posteriormente, colocar
num frasco apropriado com a ajuda do funil e colocar um rótulo que tenha os nomes de
quem preparou (neste caso o turno), data em que a solução foi preparada e
concentração da mesma (o volume não é necessário).

2) Preparar uma solução de 1L de formalina a 10% ou 1L de formaldeído a 3,7%.

Nota: A formalina consideramos que inicialmente está a 100% e o formaldeído a 37%.

Ci × Vi = Cf × Vf ⇔ 100 × Vi = 10 × 1000 ⇔ Vi = 100 ml de 𝐟𝐨𝐫𝐦𝐚𝐥𝐢𝐧𝐚 𝐚 𝟏𝟎%

1000 − 100 = 900 ml de H2 O
ou

Ci × Vi = Cf × Vf ⇔ 37 × Vi = 3,7 × 1000 ⇔ Vi = 100 ml de 𝐟𝐨𝐫𝐦𝐚𝐥𝐝𝐞í𝐝𝐨 𝐚 𝟑𝟕%

1000 − 100 = 900 ml de H2 O
Materiais para preparar esta solução:

• Proveta de 1000 ml para medir 900 ml de água.

• Proveta de 100 ml para medir 100 mL de formaldeído a 37%.
• Balão volumétrico de 1000 ml, funil, rótulo.

Notas:

✓ A formalina a 10% está pronta a ser usada e trata-se da solução aquosa de formaldeído,
sendo que este último pertence aos aldeídos, logo não é tão correto utilizar o termo
formol, pois o ol refere-se, normalmente, a um álcool.
✓ Formaldeído é um gás que pode estar no máximo de 37% a 40% dissolvido em água.
✓ Quando trabalhamos com reações exotérmicas, temos que ter cuidados acrescidos, pois
existe o risco de explosão. Sabendo que reações com ácidos são exotérmicas, o ácido
coloca-se sempre em segundo lugar, após o solvente, gota a gota.

Preparação de Amostras para Fixação (João Palma – vídeo moodle)

 As amostras histológicas, quando chegam a um laboratório (hospitalar, de investigação
ou outro), passam por uma serie de passos associados à receção das amostras e,
posteriormente, estas devem sofrer um passo de preparação para uma adequada fixação. Este
passo de preparação para a fixação é variável de acordo com as dimensões e outras
características das amostras, nomeadamente, as amostras de pequena dimensão têm um
determinado tratamento, enquanto que as amostras que têm cavidades, lúmen ou são de
grandes dimensões têm um tratamento ligeiramente diferente.

Qualquer amostra para estudo histológico de rotina pode chegar ou fresco ou já

acondicionado em formaldeído (mais usado), mas pode ser qualquer outro fixador. Há
laboratórios que optam for efetuar a analise macroscópica da peça/amostra a fresco e, neste
caso, a fixação só decorre depois da análise macroscópica. Para aqueles que optam por fixar a
amostra antes de a analisar irá haver uma série de passos para adequar a fixação aos tecidos e,
posteriormente, fazer a macroscopia. É de salientar que tanto para os laboratórios que optam
por fazer a macroscopia das amostras a fresco como para os que optam por fazer com as
amostras já fixadas, há sempre risco para a saúde do profissional, nomeadamente, risco
biológico para os que optam por fazer com amostras a fresco e essencialmente risco químico
para os que optam por fazer com amostras fixadas. Há equipamentos de proteção individuais e
coletivos tanto para um como para outro.

O tempo de fixação recomendado para peças cirúrgicas é variável e depende

essencialmente da sua composição/densidade – normalmente as amostras com elevada
quantidade de tecido adiposo requerem uma fixação mais prolongada do que as restantes (isto
partindo do princípio de que as amostras já foram previamente preparadas, porque amostras
com dimensões muitos grandes se não forem seccionadas e preparadas para serem fixadas vão
demorar muito mais tempo do que uma amostra de pequenas dimensões).

Deve ser sempre respeitado o tempo mínimo de fixação de 24 horas para peças
cirúrgicas e de 6 horas para biopsias.

Biopsias e Peças de Pequena Dimensão

A forma como se preparam biopsias e peças de pequena dimensão para ocorrer uma
fixação é mais simples. Se for uma biopsia, como na amostra do lado esquerdo, basta
assegurarmo-nos que temos o volume adequado de fixador face ao volume da amostra
(normalmente é recomendado que o volume de fixador seja 15-20x superior ao volume da
amostra), que a amostra fica completamente imersa no fixador e darmos o tempo de fixação
para que a amostra fique fixada. É de salientar que, por vezes, este tipo de amostras, como são
colocadas no frasco antes de ter fixador, podem ficar coladas (porque ainda têm sangue), e ao
chegarem ao laboratório temos que prever que essa situação pode acontecer e descolar as
amostras do fundo ou da parede do recipiente de modo a que toda a superfície da amostra fique
em contacto com o agente fixador (e também para evitar que fique com o formato do
recipiente).

Outro tipo de amostras também de pequenas dimensões (imagem da direita), por vezes,
apesar de terem uma quantidade de agente fixador adequada e suficiente, devido à sua
densidade, ficam a flutuar no agente fixador. Aquilo que podemos fazer é colocar uma
compressa em cima do fragmento, para que esta compressa fique embebida no agente fixador
e cause peso em cima do fragmento, fazendo com que todas as superfícies deste fragmento que
estava a flutuar fiquem cobertas pelo agente fixador.

Amostras de Maiores Dimensões

As amostras de maiores dimensões ou amostras que tenham lúmen, precisam de
procedimentos adicionais e mais complexos do que os referidos anteriormente para biopsias e
peças de pequenas dimensões.

Há vários exemplos deste tipo de peças:

• Baço;
• Cólon;
• Esófago;
• Estômago;
• Fígado;
• Globo ocular;
• Intestino delgado;
• Mama;
• Placenta;
• Pulmão;
• Rim;
• Útero;
• Etc...

As que estão a negrito são as que iremos acompanhar com mais detalhe.

Preparação de Placenta para Fixação

É essencial, para a preparação de uma peça de placenta para fixação, orientar a peça
(aplica-se a esta peça, mas também a qualquer outra que chega ao laboratório). No vídeo a
placenta chegou no recipiente branco, que já continha agente fixador, no entanto, a amostra
não está fixada, portanto o serviço que fez a remoção da placenta para a enviar para o
laboratório enviou a amostra no recipiente com agente fixador, porém temos que fazer uma
série de procedimentos e metodologias para permitir que uma peça daquelas dimensões possa
fixar rápida e uniformemente.
 Convém reconhecer algumas estruturas para podermos orientar a peça e, portanto,
vemos uma porção arredondada, ovalada, que é designada por disco placentar; temos um
cordão umbilical que tem uma inserção central nesse disco placentar; a componente lateralizada
são as membranas que envolviam o bebé quando estava em contacto com essa superfície da
placenta que está para cima, já a oposta, que está para baixo na mesa de macroscopia, é
designada por superfície materna.

Depois, devemos pesar e medir o disco placentar, e isto,

normalmente, faz-se sem membranas e sem cordão. Devemos
efetuar um rolo de membranas com a extremidade de rutura
no interior e colocar a fixar numa cassete. Avaliar a superfície
materna (que está para baixo). Depois, efetuar cortes sagitais
na peça, desde a superfície materna, em intervalos de cerca de
1 cm (mantendo a integridade da superfície fetal). Colocar
compressas em cada secção e fixar a amostra.

Preparação de Útero para Fixação

Como em qualquer a fase inicial, quando temos uma peça de histerectomia, temos de
ter a capacidade de orientar a peça sempre que possível.

Uma peça de histerectomia é relativamente fácil de orientar se vier com os respetivos

anexos uterinos (trompas e ovários). Se visto de um plano superior, para orientarmos
conseguimos perceber que o ligamento redondo é anterior à inserção das trompas de Falópio e
a porção do ligamento do ovário a ambos os dois anteriormente mencionados. Relativamente
ao seu revestimento por serosa, ou seja, à porção que é peritonealizada, na porção anterior do
útero, esse revestimento é mais alto do que na porção posterior (aqui o revestimento peritoneal
cobre uma porção significativa do colo uterino, enquanto que na porção anterior isso não
acontece). Depois devemos pesar e medir a peça e, de seguida devemos pintar a porção do colo
uterino que não é peritonealizada, que é mais significativa na porção anterior. Sempre que a
peça é orientável (quando conseguimos dizer o que é anterior e posterior, direito e esquerdo),
é preferível pintarmos essa porção não peritonealizada de cores diferentes (por exemplo, pintar
de azul o anterior e de preto o posterior) para que, em qualquer necessidade de recorrermos à
peça, nomeadamente, quando fizermos a análise macroscópica, conseguirmos ter sempre uma
orientação topográfica adequada e proporcionada pelas diferentes cores que aplicámos.

Depois, devemos separar os anexos direito e esquerdo, quando presentes, e,

preferencialmente, de forma a distinguirmos qual é qual, colocar um deles numa compressa,
embrulhada e fechada, e mencionar isso na respetiva requisição, para quando formos fazer a
análise macroscópica conseguirmos saber qual é o que está na compressa.

Colher sempre um fragmento correspondente ao istmo (zona de transição entre o corpo

uterino, que está para cima, e contém a cavidade endometrial e o colo uterino, que está para
baixo, e contém o canal endocervical). Esta colheita do istmo, de uma rodela completa do istmo,
é particularmente essencial em patologia neoplásica, sobretudo quando é do colo uterino
porque a invasão do istmo em carcinomas do colo uterino permite fazer o estadiamento tumoral
de acordo com a existência ou não de invasão dessa mesma estrutura.

De seguida, devemos canalizar o canal endocervical e da cavidade endometrial (com

sonda) e a partir dessa canalização tanto do canal endocervical como da cavidade endometrial,
conseguimos criar um plano em que vamos separar, ou seja, abrir
a peça. Esta separação pode ser tanto em anterior-posterior e,
portanto, canalizamos pelo endocérvix e com uma faca vamos
atrás da sonda e dividimos a porção anterior e posterior ou
também podemos canalizar, da mesma forma, mas em vez de ir
num plano coronal, fazemos num plano sagital, separando em
direito-esquerdo. O objetivo major, quer de um procedimento,
quer do outro é abrir a peça e explorar a cavidade endometrial de
forma a que toda essa estrutura, nomeadamente a mucosa de
revestimento e o miométrio, tenha um maior contacto com o
agente fixador para fixar de forma mais adequada, uniforme e
rápida. Este corte, seja separando em anterior-posterior ou
direito-esquerdo, nunca deve ser completo, deve haver sempre
uma ligação na zona do fundo para que a peça seja facilmente reconstruída. Não devemos
apenas seccioná-la e colocá-la em formaldeído, devemos colocar várias compressas entre a
secção que fizemos e permitiu expor a cavidade endometrial e só depois colocar em
formaldeído. Quando temos peças do útero que são de dimensões muito grandes e que uma só
secção não é suficiente para fixar de forma rápida e uniforme a amostra, devemos fazer cortes
paralelos aos primeiros que efetuámos, nunca completos para que possamos colocar
compressas. Por fim, deve ser mantida a fixar durante cerca de 24h para que depois possamos
fazer a análise macroscópica.

Preparação de Estômago para Fixação

Relativamente ao estômago, é essencial orientar a peça, neste caso devemos analisar a
margem cirúrgica e a serosa (a peça em questão chegou ao laboratório por uma neoplasia
maligna, portanto foi uma gastrectomia total). Este tipo de peça tem essencialmente 3 margens
cirúrgicas: 2 delas são muito óbvias, a margem cirúrgica proximal (a esofágica), a margem
cirúrgica distal (com a ligação para o intestino delgado) e a margem cirúrgica radial é a que
envolve toda a peça (se a serosa for invadida por células tumorais, esta margem fica
comprometida).

Devemos efetuar a palpação e analisar a localização do tumor com a peça ainda fechada.

Pintar as margens proximal, distal e evidências tumorais na serosa de cores distintas.

Podemos pitar também as margens cirúrgicas. Sempre que se aplicam as tintas para tecidos,
estas carecem de ser absorvidas com papel absorvente (o excesso).

Em termos de estômago, devemos dar a dimensão da pequena e da grande curvatura.

Tanto na grande como na pequena curvatura temos sempre aderente, às respetivas curvaturas,
parte do epíplon, parte da gordura abdominal. Nessa gordura iremos, posteriormente, isolar
gânglios. Abrir a peça de estômago pela grande curvatura (sempre), com um enterótomo,
através da palpação cuidadosa e gradual da superfície mucosa. Ao abrirmos pela grande
curvatura vamos permitir expor a totalidade da mucosa, mas também porque em termos de
incidência de neoplasias do estômago, a maior parte está na pequena curvatura. Se o tumor
estiver na grande curvatura, não o vamos cortar, vamos contornar o tumor, mesmo que
tenhamos que ir para a pequena curvatura. É por isso que devemos palpar a peça.

De seguida, lavar cuidadosamente a peça de modo a eliminar o muco existente. Se

possível, esticar a peça numa placa rígida com a ajuda de alfinetes/agulhas, para que a peça
possa ficar exposta, permitindo assim uma melhor fixação (isto depende também do tempo em
que a amostra já esteve em formaldeído. Se a amostra estiver a fresco, esta metodologia é muito
fácil de implementar, porque a estrutura muscular que constitui a parede está muito flexível e
maleável, ou seja, conseguimos abrir e esticar muito facilmente. Por outro lado, se a amostra
estiver, mesmo fechada, já há algum tempo em formaldeído, o agente fixador começou a
endurecer a estrutura, podendo ser difícil fazer a extensão).

Depois deixamos a fixar durante 24h.

Passadas 24h, qualquer peça deve seguir para a análise macroscópica. Nessa análise
ocorre a descrição da peça, com detalhe, e a colheita de fragmentos.

Descrição Macroscópica – Exemplo Estômago Tumoral

Tipo de descrição macroscópica adequada para a peça de estômago apresentada no
vídeo:

1. Peça de gastrectomia subtotal/total (se está na íntegra ou veio só uma parte) com X cm
de comprimento na grande curvatura e X cm de comprimento na pequena curvatura.
2. Identifica-se um tumor com X e Y cm de aspeto polipoide/ulcero- vegetante (tumores
com o centro ulcerado e na parte periférico um rebordo vegetante) /plano-
ulcerado/infiltrativo, localizado na pequena/grande curvatura/antro/corpo/incisura
angularis/transição esófago-gástrica (X% o tumor na porção esofágica).
3. Em profundidade, o tumor invade/não invade a muscular/subserosa/serosa e dista X cm
da margem proximal e X cm da margem distal.
4. A restante mucosa não tem alterações/tem áreas hemorrágicas numa extensão de X
cm/tem X pólipos a X cm do tumor, o maior com X cm, etc.
5. Nos pequeno e grande epíplons identificam-se X gânglios linfáticos, o maior com X cm
de diâmetro. Todos os gânglios devem ser submetidos a análise microscópica para se
detetar possíveis metastizações.

Colheita de Fragmentos – Exemplo Estômago Tumoral

1. Colher margens proximal e distal (na íntegra) longitudinalmente.
2. De acordo com a dimensão do tumor, devemos colher 1 fragmento
de tumor por cada cm de maior eixo que este tenha. Essa
amostragem deve ter sempre:
2.1 Relação com a mucosa normal.
2.2 Caso aplicável, colher uma secção de relação tumor + margem
mais próxima.
2.3 Tumor + zona de maior invasão.
3. Colher alterações da restante mucosa (pólipos, erosões).
4. Colher 1 a 2 fragmentos da restante mucosa (incluir alteração, por
exemplo, áreas hemorrágicas).
5. Colher, diferencialmente, todos os gânglios dos epíplons.

Prática 12/10 – Notas

• Num laboratório de anatomia patológica é normal as peças chegarem já fixadas ou em
líquido fixador, sendo o fixador mais típico o formaldeído.
• A fixação ocorre sempre de fora para dentro, sendo que como tal costumamos fazer
cortes que ajudem a acelerar o processo de fixação.
 • Ao chegar ao laboratório uma peça com uma lesão devemos sempre recolher um
fragmento da lesão, um da área que se encontra adjacente à lesão e outro de uma área
normal.
• Terminamos esta aula com 3 cassete: uma contendo uma biópsia e as outras 2 contendo
fragmentos. Devemos sempre marcar as cassetes com a nossa turma, as iniciais do
nosso nome e o órgão de onde provém, para tal usamos lápis, pois a caneta pode sair
com solvente orgânico que será aplicado.
• Existem cassetes distintas entre si, sendo a diferença o tamanho dos orifícios. No caso
de queremos colocar uma biopsia numa cassete, por exemplo, devemos escolher
cassetes que tenham uma malha mais pequena.
• Nas biopsias iremos efetuar uma biópsia punch – utilizada em dermatologia para
remover nevos – sendo que a que a vamos utilizar será a de menor diâmetro.
• Pinças grandes são sobretudo utilizadas para remover, mas também para manipular os
fragmentos e peças que estão em processo de fixação.
• Pinças com “dentes de rato” podem macerar e, consequentemente, danificar o tecido
comprometendo o diagnóstico. No entanto, são muito boas para agarrar fragmentos
grandes, portanto, são utilizadas maioritariamente para agarrar fragmentos que não são
colocados nas cassetes.
• Devemos sempre cortar um órgão do cabo da “faca” para a ponta da mesma.
• As medições dos órgãos são dadas por: c x l x a ou e (o máximo da espessura é 5mm)
• Devemos classificar os órgãos quanto à superfície externa e à superfície de corte.
• A textura dura é equiparada à textura da fonte, a firme ao nariz e a mole aos lábios.
• Medição dor órgãos utilizados na aula:

Prática 19/10 – Notas

• Na aula efetuou-se: Inclusão; Recolha de fragmentos; Processamento histológico
• Na inclusão passamos de fragmentos em cassetes para fragmentos em blocos. Para tal
utiliza-se parafina que à temperatura ambiente é sólida, sendo que para podermos
trabalhar com ela esta tem de estar líquida.
• Para que este processo se dê então, no aparelho de inclusão a temperatura deve estar
entre os 56℃ e os 60℃, de modo a garantir que há a passagem da parafina do estado
sólido para o líquido.

Procedimento:
Passar para o
Colher fragmentos e
Pô-los a fixar processamento
colocá-los em cassetes
histológico

A partir da inclusão temos um

suporte externo e da impregnação temos
um suporte interno.
• A água é incompatível com a parafina, pois esta deriva do petróleo (é uma gordura).
Portanto, antes de colocar os fragmentos em parafina temos de remover a água desses
tecidos através de um processo designado desidratação.
• Para este processo utiliza-se álcool com valores crescentes de concentração: 1 de 70%,
2 de 96% e 3 de 100%.
• O álcool absoluto (100%) é utilizado para retirar totalmente a água, pois esta também é
incompatível com o xileno que se trata de um reagente intermédio que só possui uma
única concentração, e que trabalha a montante com o etanol a 100% e a jusante com a
parafina.
• Assim, devemos remover a água por desidratação → substituir por xileno → colocar a
parafina (damos um suporte interno)
• 1º: Desidratação → 2º: Impregnação → 3º: Inclusão
• Na inclusão devemos ter em conta aquilo que de facto queremos incluir e,
posteriormente, visualizar. O que vamos visualizar será o que fica para baixo.
• Ao incluir é importante destacar que a superfície de interesse deve ficar para baixo;
devemos centrar o fragmento / biópsia o máximo possível; devemos incluir de forma a
não oferecer resistência à faca.
• Ao trabalharmos com o aparelho de inclusão devemos ter o menor compasso de espera
possível.