Universidade Federal de Pernambuco

Centro de Tecnologia e Geociências

Departamento de Engenharia Química
Engenharia Bioquímica 2022.1

Prática 4
Cinética Microbiana

Professor: Pedro Souza

Alunos: Ana Giovana Almeida
Fabian Cavalcanti
João Victor Moraes
Maria Gabriela Nascimento
Mauro Henrique

Recife, 21 de Agosto de 2022.

 SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO 3

2. METODOLOGIA EXPERIMENTAL 3

2.1 MATERIAIS 3
2.2 MÉTODOS 4
2.3 ANÁLISES 4

3. RESULTADOS E DISCUSSÃO 6

4. CONCLUSÃO 12

5. REFERÊNCIAS 12
 1. INTRODUÇÃO

A utilização de leveduras para produção de álcool é datada de desde antes de 6000 AC pelos
sumérios e babilônicos. Desde então o processo de modernizou bastante e atualmente possui uma
grande importância econômica, social e industrial.
No processo fermentativo, os açúcares presentes no caldo fermentativo, como a sacarose, a
glicose e a frutose, são transformados em álcool etílico (ou etanol). Para que isto ocorra, entretanto,
torna-se necessária a ação controlada do processo, devido às diversas variáveis que influenciam
diretamente na fermentação, sendo as principais: temperatura, pH e %ART convertido.
Grande parte dos processos fermentativos industriais é conduzida em batelada alimentada, já
que este é o modo de operação mais efetivo para se lidar com problemas como inibição pelo substrato
e repressão catabólica.
A Sacchromyces cerevisiae é a levedura mais utilizada na fabricação de alimentos
fermentados. É usado na produção de vinhos, pão (levedura de padeiro) e bebidas alcoólicas (levedura
de cerveja).
A reação global da glicólise demonstra que 1 mol de glicose (180 g) produz 2 moles de etanol
(92 g), 2 moles de dióxido de carbono (88 g) e 57 Kcal de energia. Assim, o rendimento teórico
(YP/S) para a produção de etanol é de 0,511 g/g. Na prática, este valor não é observado devido à
utilização de parte da glicose para a produção de glicerol, álcoois superiores e ácidos, substâncias
necessárias para a síntese de material celular e manutenção da levedura, sendo o glicerol o mais
importante do ponto de vista quantitativo.
É muito importante que todo o processo fermentativo seja bem controlado para que se tenha
uma boa produtividade, baixa formação de subprodutos, além de uma redução dos custos
operacionais.
Dessa forma, o objetivo desse relatório foi de acompanhar e estudar o processo de
fermentação da levedura Sacchromyces cerevisiae por 24 horas, tomando amostras a cada 3 horas, e
assim aprender mais sobre a fermentação.

2. METODOLOGIA EXPERIMENTAL

Foram utilizados 2 reatores com a concentração de 50g/L de glicose como substrato e com
volumes úteis de 2,0 L e de 0,5 L.

2.1 MATERIAIS
● Micro-organismos - Saccharomyces cerevisiae
● Meio de cultura
 Tabela 1. Composição do meio de cultura

Nutrientes g/L

Glicose 50

Extrato de levedura 2

Ureia 1

KH2PO4 1

MgSO4.7H2O 0,5

Água 1L

● Outros materiais: geladeira; tubos de ensaio; tubos de Folin-Wu; tubos Falcon;

pipetas; bicos de Bunsen; estufas; ebuliômetro; banho-maria; centrífuga

2.2 MÉTODOS
1. Foi transferido 200 mL do inóculo previamente preparado para um biorreator contendo 2,0 L
de meio estéril (volume total do biorreator 3,0 L) e 50 mL de inóculo para outro biorreator
contendo 0,5 L do mesmo meio estéril (volume total de 1 L). Ambos com concentração inicial
de 2g/L de inóculo
2. Ambos os reatores foram agitados vigorosamente. Do balão de 2 L de meio, foram retiradas
duas amostras, uma de 45 mL e outra de 25 mL, no tempo T0 (ás 8:00 do dia 16/08) . A cada
3 h, essa operação foi repetida, demais amostragens:T1, T2, T3, T4 e T5, de modo a permitir
as análises a cada tempo.
3. O balão menor, após receber o inóculo e ser agitado, foi pesado em balança semi-analítica.
Esse procedimento também foi repetido a cada 3h, nos mesmos horários em que eram
retiradas as amostras do balão maior.
4. Todas as amostragens foram marcadas e guardadas sob refrigeração para a posterior análise de
Glicose, Etanol e Biomassa.

2.3 ANÁLISES
Etanol - Método de Ebuliometria
Calibração
1. 50 mL de água destilada foram transferidos para a caldeira do etilômetro, em seguida, foi
acoplado um condensador e o termômetro e a chama foi acesa.
2. Quando a temperatura estava alta, indicando o estado de equilíbrio, a temperatura foi anotada
e atribuída a esta o teor alcoólico de 0° GL. Assim a régua que acompanha o equipamento
nessa temperatura foi graduada.
Análise das amostras
 1. As amostras de cada tempo foram centrifugadas e, para esta análise, foi utilizado 50 mL do
sobrenadante.
2. O mesmo procedimento de calibração foi repetido para as amostras de cada tempo T e os
resultados, obtidos na régua já calibrada, foram anotados em uma tabela.

Glicose - Método DNSA

1. Foram feitas diluições das amostras para cada um dos tempos T, de forma a se obter um
resultado confiável, dado que a acuidade do espectrofotômetro se dá entre 30% e 70% T.
Tabela 2. Diluições realizadas em cada amostra

T0 T1 T2 T3 T4 T5

1:50 1:50 1:25 1:25 1:10 1:1

2. Em seguida, foram preparados 07 tubos de Folin Wu. No primeiro, foi pipetado 0,5 mL de
água destilada (branco) e nos outros, pipetar 0,5 mL das diluições e adicionado 1,0 mL do
reagente DNS.
3. Os tubos foram aquecidos em banho maria a 100 °C (em ebulição) por 5 minutos. Ao final
dos 5 minutos, os tubos foram resfriados imediatamente em banho de gelo por 2 minutos.
4. Foi acrescentada água destilada até a marca de 12,5 mL em cada tubo após o resfriamento.
5. Os tubos com filme especial e homogeneizados.
6. O tubo branco foi utilizado para calibrar o espectrofotômetro a 540 nm.
7. A partir dos resultados de transmissão e absorbância, foi calculada a concentração de glicose
relativa a cada tubo utilizando a seguinte fórmula
𝑌 = 0, 2983𝑥 − 0, 027
Sendo:
Y = absorbância
x = concentração de glicose
E também o erro calculado R2 = 0,9992

Biomassa - Turbidimetria
As demais análises foram armazenadas na geladeira e as análises foram realizadas um ou dois
dias após a retirada das amostras. A análise da biomassa, para obter um resultado mais preciso, foi
feita imediatamente após a coleta.
1. As amostras foram coletadas em cada tempo T e, logo em seguida, centrifugadas.
2. Com a parte líquida separada, foi feita a medição de transmitância e absorbância e os
resultados calculados a partir da curva de calibração já obtida em outros experimentos.
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO

3.1 Determinação de Etanol

As amostras foram transferidas para o ebuliômetro, e as temperaturas de estabilização

observadas no termômetro foram registradas, bem como os seus respectivos teores alcoólicos,
conforme mostrado na Tabela 4 e exibido graficamente na Figura 1.

Tabela 3. Dados obtidos nas amostragens T0 a T5 no ebuliômetro.

Amostra Tempo (h) Temperatura (°C) Teor alcoólico (%)

T0 0 99,6 0,5

T1 3 99,5 0,9

T2 6 98,9 1,2

T3 9 98,7 1,7

T4 12 97,9 2,3

T5 24 97,7 2,9

Figura 2. Grau alcoólico da amostra em função do tempo.

Pode-se observar que, gradativamente, a temperatura da amostra contendo álcool se estabiliza

a uma temperatura cada vez menor e, assim, o teor alcoólico dessas amostras aumenta com o tempo,
até atingir 2,9 % após 24h.

3.2 Avaliação de crescimento celular

 O tempo de fermentação e a diferença entre a quantidade de células vivas e mortas estão
dispostos na Tabela 4, a seguir:

Tabela 4. Número de células por litro em função do tempo.

Tempo (1/h) X (células/litro)

0 6561181434,60

3 10773056057,87

6 35171790235,08

9 55123568414,71

12 67329716696,81

24 66726943942,13

Figura 3. Concentração celular em função do tempo.

É possível perceber o aumento da concentração das células com o tempo, como é de se esperar,
e além disso, observa-se que depois da medição de 12 horas, foi encontrado um valor ligeiramente
menor de células vivas. Depois desse período, de 12 horas, houve a estabilização da fermentação..

3.3 Determinação de glicose

A concentração de glicose ao longo do tempo foi calculada utilizando a equação da reta (y =

0,2983x - 0,027), obtida através do padrão do DNSA. Onde Y corresponde à absorbância da amostra,
e x à concentração da glicose na amostra. Na Tabela 5, é possível observar os dados obtidos no
experimento.

Tabela 5. Dados da absorbância e concentração de glicose e padrão obtidos no experimento.

 Tempo (h) Absorbância Concentração de glicose (g/L)

0 0,22 0,828

3 0,245 0,912

6 0,307 1,120

9 0,234 0,875

12 0,252 0,935

24 0,178 0,687

Figura 4. Concentração celular em função do tempo.

O gráfico exibe o comportamento já esperado, que a glicose é consumida ao longo do tempo, e

começa a estabilizar sua concentração no meio entre 12h e 24h de fermentação.

3.4 Determinação de CO2

Na Tabela 6 abaixo, é mostrado o peso da amostra a cada período de tempo, onde é

possível observar a diminuição do peso em razão da produção do CO2, que é o processo normal
esperado. A Figura mostra graficamente a diminuição do desprendimento do CO2.

Tabela 6. Peso da amostra ao longo do tempo.

Tempo (h) Peso (g)

0 714,8

3 713,7
 6 712,5

9 710,3

12 707,5

24 704,7

Figura 5. Pesagens do biorreator em função do tempo.

A Figura 5 mostra que o desprendimento do CO2 apresentou um comportamento bem

análogo ao longo do tempo do comportamento do consumo da glicose, o que era de se imaginar,
visto que a glicose consumida é transformada em gás carbônico, que é liberado do reator, fazendo
o peso do mesmo diminuir.

3.5 Parâmetros cinéticos

3.5.1. Velocidade específica máxima de crescimento celular (µmáx)

Nessa etapa da prática se determina o µ max

Onde:
µ= velocidade específica de crescimento celular em h-1;
X= concentração de células em g/L;
µmax= velocidade específica máxima de crescimento celular em h-1;
S= concentração de substrato;
Km= constante de saturação em g/L.

Com isso, para determinar µmax é necessário uma linearização da igualdade plotando um
gráfico contendo 1/µ versus 1/S como mostrado na figura abaixo.
 Figura 6. Gráfico de 1/ μ versus 1/S.

Desta forma, µmax = 0,39 h-1. Sabendo disto, o tempo de geração, definido como o tempo
necessário para duplicar a concentração celular pode ser calculado por:
𝑙𝑛 2 𝑙𝑛 2
𝑔= µ𝑚𝑎𝑥
= 0,39
= 1, 76 ℎ

3.5.2. Fatores de conversão

Os valores X, S e P podem ser relacionados entre si, ao serem obtidos valores de conversão.
Sendo assim abaixo são apresentados os valores de conversão encontrados, para o tempo de
fermentação de 24 horas.

𝑋−𝑋0
𝑌𝑋/𝑆 = 𝑆0−𝑆
= 0, 15

𝑃−𝑃0
𝑌𝑃/𝑋 = 𝑋0−𝑋
= 0, 27

𝑃−𝑃0
𝑌𝑃/𝑆 = 𝑆0−𝑆
= 0, 04

3.5.3. Rendimento e eficiência da produção de etanol

Os dados foram relacionados a partir da reação de fermentação da levedura, descrita abaixo:

C6H12O6 → 2C2H5OH + 2CO2
Logo, o rendimento teórico pode ser calculado utilizando a estequiometria através da equação:
2 × 46
𝑅 = 180
= 0, 511g etanol/g de glicose
Pode-se comparar esse valor com o valor encontrado para o fator de conversão do produto em
substrato, visto que possuem a mesma unidade. Assim, a eficiência de conversão pode ser calculada
dessa forma:
 0,04
ε= 0,511
= 0, 078
Assim, a eficiência de conversão da glicose em etanol foi de 7,8%.

3.5.4. Tempo de residência

Considerando o reator do sistema um reator contínuo, o tempo de residência será dado por:
1
𝑡𝑟 = µ
, ⲙ menor que ⲙmax
Como calculado anteriormente, ⲙmax = 0,39 h-1, então tr = 2,56 h.
Para obter maior fidelidade nos resultados, considera-se o valor de ⲙ anterior ao ⲙmax , de
0,1653. Neste caso o tempo de residência passa a ser de 6,04 horas.

3.5.5. Processo contínuo

A Tabela 7 a seguir apresenta uma visão geral dos dados calculados no experimento:

Tabela 7. Dados referentes à concentração celular.

X S P D(h-1) µ 1/µ 1/s θ(h) 1/x Yx/s
(por ln)

6561181434,5992 45,5079 0,0004

10773056057,8662 45,0888 0,7101 0,1653 0,1653 6,0499 0,0222 6,049881 9,28E-11 6954344
6

35171790235,0814 27,7531 0,9468 0,3944 0,3944 2,5355 0,0360 2,535505 2,84E-11 2,04E+0
8

55123568414,7077 21,9159 1,3413 0,1498 0,1498 6,6766 0,0456 6,676563 1,81E-11 3,1E+08

67329716696,8053 7,1907 1,8147 0,0667 0,0667 14,9982 0,1391 14,99818 1,49E-11 3,49E+0
8

66726943942,1338 0,6856 2,2881 -0,0007 -0,0007 -1334,3910 1,4587 -1334,39 1,5E-11 3,35E+0
8

Com os dados é possível observar que os valores de μ e D são iguais, resultando que o tempo
de residência é dado por 1/D. Para calcular o valor inicial de substrato, usa-se o fator de conversão de
X em S. Foi encontrado um valor inicial de substrato de 50 g/L.

3.5.6 Funcionamento do alcoômetro de Gay-Lussac

O alcoômetro de Gay-Lussac é um instrumento destinado a medir a graduação alcoólica

(álcool etílico) de uma substância de 0 - 100 °GL, baseado na densidade da mistura.

A amostra homogeneizada deve ser colocada em uma proveta e, em seguida, o alcoômetro

pode ser inserido. A leitura deve ser feita com base no menisco e o valor obtido deve ser corrigido
segundo uma tabela de correção, caso a temperatura que a medicação foi feita seja diferente da
temperatura na qual o alcoômetro foi calibrado (geralmente 20 °C).
4. CONCLUSÃO

A partir dos experimentos realizados neste estudo, foi possível estudar e analisar alguns
métodos como o do desprendimento de CO2, concentração de células, concentração de glicose e grau
alcoólico. Pode-se concluir que a levedura Saccharomyces cerevisiae possui boa capacidade
fermentativa.
Os gráficos obtidos apresentaram coerência de resultados. O de desprendimento de CO2 foi
bem análogo ao de consumo de glicose, que mostra uma velocidade da fermentação mais rápida nas
primeiras 10 horas e um começo de estabilização depois das 12.
Foi percebido também que a concentração celular, assim como o grau alcoólico, teve uma
certa estabilização depois das 12 horas.
Além disso, foi possível calcular os parâmetros cinéticos da fermentação a partir dos dados da
reação.

5. REFERÊNCIAS

HISS, H. Cinética de processos fermentativos. in: SCHMIDELL, W. et al. (coords). Biotecnologia

Industrial: engenharia bioquímica. São Paulo: Blucher, 2001. P 93- 112. Cap. 6. V.2.

SACCHAROMYCES CEREVISIAE, QUAL SEU PAPEL NA INDÚSTRIA?. Neoprospecta, 2022.

Disponível em: https://blog.neoprospecta.com/saccharomyces-na-industria/. Acesso em: 20 de Agosto
de 2022.

S. L. Maria . Cinética de processos fermentativos. in: SCHMIDELL, W. et al. (coords). Biotecnologia

Industrial: engenharia bioquímica. São Paulo: Blucher, 2001. P 93- 112. Cap. 6. V.2.

Spini Logato, Maria Clara. Modelo semiempírico identificado de processo fermentativo na indústria
sucroalcooleira. 2019.. TCC – Engenharia Química. Universidade Federal de UberlÂndia. Disponível
em:
https://repositorio.ufu.br/bitstream/123456789/28485/1/ModeloSemiemp%C3%ADricoIdentificado.p
df Acesso em: 20 de Agosto de 2022.