UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS

Instituto de Ciências Biológicas

Departamento de Microbiologia
Métodos em Microbiologia (MIC815)

Relatório de Aulas Práticas:

Módulo de Micologia

Alunos:
Alessandra Alexandrino Diniz
Lucas Fernandes
Noêmia Cristina Gama dos Santos
Paula von Randow Cardoso

Professores:
Suzana Johann
Gustavo José Cota de Freitas

Belo Horizonte
2023
Relatório de Aula Prática – Micologia – Leveduras
Primeira parte - Introdução teórica
A aula começou com uma introdução teórica com a exposição das
principais leveduras de importância médica:

 Candida spp. (polimórfico);

 Cryptococcus spp. (leveduriforme);
 Paracoccidioides spp. (dimórfico);
 Sporotrix spp. (dimórfico)

Figura 1: Direita- células ovais de Candida albicans, coloração por imunofluorescência. Esquerda: Células com
pseudo-hifas de Candida spp. Fonte: © Dennis Kunkel Microscopy, Inc; CDC/Maxine Jalbert, Dr. Leo Kaufman.

Figura 2: Células leveduriformes encapsuladas de Cryptococcus neoformans em microscopia eletrônica. Fonte: ©

Dennis Kunkel Microscopy, Inc.
Figura 3: Micrografia de duas espécies de Paracoccidioides spp. e suas formas dimórficas. Fonte: Bocca e
colaboradores, 2013.

Figura 4: Fotomicrografia em 500x de aumento, representa a presença de Sporothrix sp. em amostra de musgo de
turfa. Fonte: CDC

As leveduras dimórficas apresentam-se na forma filamentosa a 28°C e

na forma leveduriforme a 37°C. A diferenciação da espécie C. albicans é
realizada pela formação de tubos germinativos. O meio Chromagar Candida é
um meio cromogênico destinado ao isolamento e diferenciação da maioria das
espécies de Candida.
Segunda parte – prática para pesquisa de Candida spp;
Visualização direta de leveduras da mucosa oral
Materiais:
 Alça de platina;
 Bico de Bunsen;
 Frasco coletor universal;
 Kit coloração de Gram;
 Lâminas de vidro para microscópio.
- Os alunos coletaram amostras de saliva em potes descartáveis;
- As placas com os meios de cultura foram identificados;
- Com a alça de platina devidamente flambada, as amostras de saliva foram
depositadas sobre uma lâmina de microscopia para realização da coloração de
Gram;
- As lâminas coradas por Gram foram observadas em microscópio óptico em
objetiva de 40.

Figura 5 - Esquema das etapas da coloração de Gram

Isolamento em meio diferencial para Candida albicans, C. tropicalis e C. krusei

Materiais:
 Bico de Bunsen;
 Placa com meio Chromagar (meio cromogênico seletivo para identificação
de Candida);
 Swab.

- Placas com meio CHROMagar foram identificadas;

- Foi realizada coleta de amostra de mucosa oral com um swab;
- A amostra foi depositada em meio de cultura chromagar e espalhada por
estriamento simples;
- As placas foram incubadas em estufa a 37°C por 36 - 48h.
Observação da formação de tubos germinativos em C. albicans
Materiais:
 Estufa;
 Placa com meio CLED;
 Lactofenol;
 Lâmina de microscopia;
 Lamínula;
 Suspensão salina previamente preparada com as leveduras C. albicans, C.
glabrata e Candida sp. recuperada de cavidade oral.
As suspensões com leveduras foram preparadas antes da aula para que
tivessem um tempo de incubação de 3 a 4 horas a 37°C. Esse período de
incubação é o suficiente para a formação de tubos germinativos na espécie
Candida albicans, tornando possível a diferenciação dessa espécie de outras
espécies de Candida.
- Com uma alça de platina previamente flambada, uma alíquota da
suspensão é disposta sobre o meio CLED.
- Colocar a lamínula por cima do meio para que as leveduras fiquem
aderidas;
-Após o período de incubação de 3 a 4 horas a 37°C, pingar uma gota de
lactofenol sobre uma lâmina de microscopia e colocar a lamínula, com a face
que estava no meio, sobre a lâmina para observação da formação de tubos
germinativos.
Terceira parte - Pesquisa de Cryptococcus spp. em amostra de líquor
Materiais:
 Amostra do líquor com suspeita da infecção;
 Câmara de fluxo laminar;
 Eppendorf;
 Lamínulas;
 Lâminas de vidro para microscópio;
 Micropipeta;
 PBS;
 Ponteiras;
 Tinta Nanquim;
 Vortex.

- Uma parte da amostra não foi centrifugada e 2 mL da amostra foram

centrifugados a 1200 rpm por 10 minutos para concentração e facilitar a
visualização da levedura. Da amostra centrifugada, o sobrenadante foi
descartado e os 500 µL restantes foram homogeneizados;
- Homogeneizar a amostra de líquor em vórtex e aliquotar 10 µL com
micropipeta em Cabine de Segurança Biológica (CSB);
- Depositar os 10 µL em uma lâmina de microscopia e, sobre a amostra, aplicar
10 µL, aproximadamente, de nanquim. Com a ponta da ponteira, homogeneizar
a amostra com o nanquim, cobrir com lamínula e visualizar em microscópio
óptico.
Isolamento de Cryptococcus spp. em meio seletivo e diferencial
Materiais:
 Alças de drigalski;
 Amostra do líquor com suspeita da infecção;
 Câmara de fluxo laminar;
 Micropipeta;
 Placas com meio ágar Niger;
 Placas com meio ágar Sabouraud Dextrose (ASD);
 Ponteiras.
A amostra foi plaqueada (100 µL) pela técnica de spread plate com alça de
drigalski autoclavada em ágar SDA (Ágar Sabouraud Dextrose) e em ágar
Níger, um meio seletivo e diferencial utilizado para identificação de
Cryptococcus sp. Em meio Niger, a levedura C. neoformans se melaniza e é
possível fazer a sua identificação pela cor marrom das colônias.
Quarta parte: MIC – Minimum inhibitory concentration
Materiais:
 Anfotericina B 1mg/mL;
 Câmara de fluxo laminar;
 Fluconazol 1mg/mL;
 Meio RPMI;
 Micropipeta multicanal;
 Placa de 96 poços;
 Ponteiras;
 Reservatório (barquinho).

- Foi preparada uma placa de 96 poços para a realização do MIC

(Concentração mínima inibitória, do inglês Minimum inhibitory concentration)
para os fármacos Fluconazol e Anfotericina B. As soluções-estoque dos
fármacos estavam na concentração 1 mg/L;
- Para identificação das placas, as extremidades foram identificadas como CC
(controle de crescimento); com meio RPMI e inóculos e CE (controle de
esterilidade); contendo apenas o meio RPMI. Para a placa de Anfotericina B
serão testadas as concentrações 8, 4, 2, 1, 0,5, 0,25, 0,12, 0,06, 0,03 e 0,015
μg/mL e, para a placa de Fluconazol serão testadas as concentrações 16, 8, 4,
2, 1, 0,5, 0,25, 0,12, 0,06 e 0,03 μg/mL. Considerou-se que o volume final de
cada poço de 200 μL, sendo 100 μL do meio RPMI com antibiótico e 100 μL do
inóculo.
- Para o volume utilizado na placa, foram preparadas as soluções nas
concentrações de 32 mg/L e 16 mg/L respectivamente uma vez que, no
momento do plaqueamento do inóculo (100 µL), essas concentrações serão
diluídas 1:2, começando, dessa forma, com 16 e 8 mg/L.
 CE 16 8 4 2 1 0,50 0,25 0,12 0,06 0,03 CC
5

Figura 6: Placa do fármaco Fluconazol. As cores azul, rosa, bege e vermelho indicam espécies diferentes de leveduras:
Cryptococcus gattii, Cryptococcus neoformans, Candida albicans e Candida glabrata, respectivamente. A cor laranja indica
os poços de controle de esterilidade e a coluna 12, corresponde ao controle de crescimento de cada uma das espécies.
Todas as amostras em duplicata.

CE 8 4 2 0,5 0,25 0,12 0,06 0,03 0,01 CC

5 5

Figura 7: Placa do fármaco Anfotericina B. As cores azul, rosa, bege e vermelho indicam espécies diferentes de
leveduras: Cryptococcus gattii, Cryptococcus neoformans, Candida albicans e Candida glabrata, respectivamente. A cor
laranja indica os poços de controle de esterilidade e a coluna 12, corresponde ao controle de crescimento de cada uma
das espécies. Todas as amostras em duplicata.

Para o cálculo do volume necessário: 8 poços/coluna x 100μL x 2 =

1.600μL (multiplica por 2 porque metade do volume da primeira coluna será
transferida para a coluna seguinte). Foram preparados 3 mL do fármaco em
meio.
 Cálculo para a quantidade de antifúngico necessário:
Anfotericina B: A primeira concentração necessária é de 16 μg/mL, pois ao
colocar o mesmo volume de inóculo a concentração cai para metade, tendo
uma concentração final de 8 μg/mL.
Portando, utilizando a fórmula C1.V1 = C2.V2:
1 mg/mL x V = 16 μg/mL x 3 mL
V= 48μL da solução-estoque de Anfotericina B a 1 mg/mL
+ 2.952 μL de meio RPMI
Fluconazol: A primeira concentração será de 32 μg/mL, neste também será
adicionado o mesmo volume de inóculo, para concentração final de 16 μg/mL.
Portando, utilizando a fórmula C1.V1 = C2.V2:
1 mg/mL x V = 32 μg/mL x 3 mL
V= 96 μL da solução-estoque de Fluconazol a 1 mg/mL
+ 2.904 μL de meio RPMI
Foram montadas 2 placas, uma para cada antifúngico. A partir da
segunda concentração, foram adicionados 100 μL do meio RPMI em cada um
dos poços das amostras e do controle de crescimento. Foram pipetados 200 μL
de meio RPMI nos poços de controle de esterilidade. Na primeira coluna, da
primeira concentração, foram adicionados 200 μL de cada um dos antifúngicos
nas maiores concentrações. Dessa forma, foi realizada uma diluição seriada na
placa com pipeta multicanal homogeneizando a cada passagem. As placas
foram embrulhadas com papel alumínio e congeladas.
Preparo do inóculo para o MIC
Materiais:
 Alças descartáveis;
 Câmara de fluxo laminar;
 Espectrofotômetro;
 Meio RPMI;
 Micropipeta;
 Placas com C. gattii;
 Placas com C. neoformans;
 Placas com C. albicans ATCC;
 Placas com C. glabrata;
 Ponteiras;
 Solução salina 0,85%;
 Tubo de ensaio com tampa;
 Vortex.
Em CSB foi preparado um inóculo de cada uma das espécies com 1x 106
cel/mL por meio da leitura da transmitância a 530 nm em espectrofotômetro:
- Foram adicionados 3 mL de solução salina 0,85% em tubo de ensaio como
branco, com 100% de transmitância no espectrofotômetro.
- Em um tubo de ensaio foram colocados 3 mL de solução salina 0,85%, e, com
o auxílio de uma alça descartável, uma porção da colônia da placa do isolado
de C. gattii foi adicionada ao tubo;
- Após homogeneização em vórtex, foi realizada a leitura da transmitância a
530 nm. A leitura deve estar entre 75 - 77%, o que corresponde a 106 cel/mL.
- O procedimento foi repetido para as demais leveduras: Crypyococcus
neoformans, Candida albicans ATCC e Candida glabrata.
Resultados obtidos das transmitâncias:
 C. gattii – 75,9%;
 C. neformans – 75%;
 C. albicans – 75,9%;
 C. glabrata – 77%
A concentração final do inóculo deve ser de 103 cel/mL, por isso, após
realizada a leitura no espectrofotômetro, foi feita uma diluição de 1:20 seguida
de uma diluição 1:50. Os inóculos preparados foram plaqueados nas placas
com os antifúngicos. Foram adicionados 100 μL dos inóculos nos poços das
diferentes concentrações de Fluconazol e Anfotericina B os poços de controle
de crescimento como ilustrado pelas Figuras 6 e 7, respectivamente. As placas
foram incubadas por 72 horas a 37°C.

Resultados
Segunda parte – prática para pesquisa de Candida spp;
Visualização direta de leveduras da mucosa oral
Após realização da coloração de Gram, foi possível identificar as leveduras
presentes na mucosa oral pela coloração roxa e características morfológicas:
tamanho e presença de brotamento.
Isolamento em meio diferencial para C.albicans, C. tropicalis e C. krusei
Após plaqueamento e incubação das placas com meio Chromagar a 37°C por
36 - 48h foi possível identificar as diferentes espécies de Candida:
 Coloração verde – Candida albicans
 Coloração azul – Candida tropicalis
 Coloração rosa brilhante – Candida glabrata
 Coloração rosa opaco – Candida kruzei

Figura 8: Resultado da pesquisa de Candida em cavidade oral

 Como é possível observar na Figura 8, não houve recuperação de Candida
na mucosa oral amostrada dos membros do grupo em meio Chromagar. No
entanto, uma placa havia sido previamente preparada para demonstração das
diferentes colorações das espécies nesse meio de cultura:

Figura 9: Coloração adquirida pelas colônias de Candida albicans e Candida kruzei em meio Chromagar

O meio Chromagar detecta enzimas específicas de cada espécie como

fosfatase, glicosidase, galactosidase e aminopeptidase.

Figura 10: Representação de três espécies de Candida em CHROMágar. Fonte: BD DIFCO™

Observação da formação de tubos germinativos em C. albicans
Após o período de incubação de 3 a 4 horas a 37°C as suspensões de
leveduras previamente plaqueadas em meio CLED foram observadas ao
microscópio para avaliação da formação de tubos germinativos.

Figura 11: Formação de tubos germinativos em Candida albicans. Fonte: Alessandra Alexandrino, 2023.

Figura 12: Outras leveduras do gênero Candida após incubação em meio CLED que não apresentam a formação de
tubos germinativos

Terceira parte - Pesquisa de Cryptococcus spp. em amostra de líquor

Apesar de a imagem estar com baixa resolução, foi possível identificar,
mesmo que com um halo reduzido, a presença da cápsula polissacarídica e o
corpo celular em brotamento. Como o nanquim estava muito concentrado, uma
segunda lâmina foi preparada com 20 µL de amostra e 10 µL de nanquim para
diluir o corante.
Figura 13: Imagem de Cryptococcus em microscopia óptica com coloração de nanquim. Á esquerda, cápsula
polissacarídica pouco desenvolvida. À direita, cápsula bem desenvolvida.

Como a cápsula polissacarídica não estava grande o suficiente, uma

outra amostra foi preparada para que os alunos pudessem visualizar uma
amostra com a cápsula bem formada. É possível observar, ao comparar as
fotos da Figura 13 o aumento considerável da cápsula polissacarídica.
Isolamento de Cryptococcus spp. em meio seletivo e diferencial
O ágar Níger é um meio seletivo e diferencial utilizado para identificação de
Cryptococcus sp. Em meio Niger, a levedura C. neoformans se melaniza e é
possível fazer a sua identificação pela cor castanha das colônias.

Figura 14: Cryptococcus neoformans em meio Niger.

Além do meio Niger, o meio CGB também é um meio utilizado para

diferenciação das espécies de Cryptococcus gattii e C. neoformans. Algumas
características importantes diferenciam as infecções causadas por C.
neoformans das causadas por C. gattii. Apesar de C. gattii acometer
principalmente indivíduos imunocompetentes, nos quadros de criptococose
causados por esta espécie, é mais comum ocorrerem lesões mais extensas e
sequelas neurológicas mais graves. Além disso, C. gattii apresenta uma
resposta mais lenta à ação dos antifúngicos do que C. neoformans. As
infecções causadas por C. gattii apresentam pior prognóstico em relação às
causadas por C. neoformans. É mais comum na infecção por C. gattii o
envolvimento pulmonar do que na causada por C. neoformans, bem como a
infecção ter acometimento cerebral e pulmonar ao mesmo tempo. Grandes
lesões maciças, que podem ser confundias com neoplasias, são também mais
frequentes em infecções causadas por C. gattii.
A cultura em um meio de ágar sólido contendo canavanina, glicina e azul
de bromotimol (CGB) é uma das formas de distinguir as espécies C.
neoformans e C. gattii é A cor azul é o resultado de uma mudança de pH
alcalina produzida quando a creatina é degradada em amônia. O sulfato de L-
canavanina permite o isolamento de C. gattii, pois essas leveduras apresentam
resistência natural e são capazes de se multiplicar nesse meio. Adiciona-se
azul de bromotimol para indicar a mudança de pH para 7,0 quando o meio
aparece azul de cobalto. A espécie C. neoformans é sensível a L-
canavaninana.

Quarta parte: MIC – Minimum inhibitory concentration

Houve contaminação das placas, no entanto, a turbidez causada pela

contaminação não impediu a leitura dos resultados. Dessa forma:
Cryptococcus gattii: Essa espécie não cresceu em nenhuma das
concentrações de nenhum dos antifúngicos testados Fluconazol e Anfotericina
B.
Cryptococcus neoformans: a mínima concentração inibitória de Fluconazol para
essa levedura foi de 4 μg/mL. Para a Anfotericina B, a concentração mínima
inibitória foi de 0,125 μg/mL.
Candida albicans: o Fluconazol não apresentou concentração mínima inibitória
para C. albicans e a Anfotericina B apresentou uma CMI de 0,25 μg/mL.
Candida glabrata: o Fluconazol não apresentou concentração mínima inibitória
para C. glabrata e a Anfotericina B apresentou uma CMI de 0,50 μg/mL.