Microbiologia Industrial CEFET-PE Tcnicas de Laboratrio

CULTIVO DE MICRORGANISMOS EM LABORATRIO 1. INOCULAO E ISOLAMENTO

1.1 INOCULAO
Semear ou inocular significa introduzir artificialmente uma quantidade de amostra (inoculo) em um meio de cultura adequado, com a finalidade de iniciar um cultivo microbiano. Aps a inoculao, o meio de cultura incubado a uma temperatura adequada para o crescimento. A inoculao pode ser realizada em meio l quido, slido ou semi!slido, utilizando! se uma ala ou pipeta estril. "ultivo em meio l quido #abitualmente se realiza em tubos ou em frascos de laboratrio (erlenme$ers, p. e%.). & crescimento da populao microbiana evidenciado pela turvao do meio, por formao de pel cula ou por formao de sedimento.

Fig. 1 Tubo direita, meio BHI sem semeadura; tubo esquerda, meio BHI aps crescimento bacteriano. Observar turva o indicativa de mu!tip!ica o microbiana.

"ultivo em meio slido 'ode ser conduzido em tubos ou em placas.

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a) )ubos com *gar inclinado + 'ara inoculao, move!se suavemente a ponta da ala sobre a superficie do *gar com um movimento em zig!zag do fundo at a parte superior, com cuidado para no danificar (ferir) a superf cie do meio. b) )ubos com *gar no inclinado + ,nocula!se introduzindo a ponta de uma ala em agul-a no centro do meio. c) ,noculao em placas de 'etri + 'ode ser em superficie ou em profundidade. A inoculao em superf cie pode ser realizada de duas formas. () Adiciona!se /.( m0 de uma diluio da amostra com pipeta estril no centro da placa e espal-a!se com o au% lio de uma ala de 1rigals2i estril. 3) ,nocula!se com a ala de platina, conforme ser* e%plicado mais adiante. 4o item tcnica de semeadura. ,noculao em profundidade. Adiciona!se ( m0 da amostra ou uma de suas dilui5es no centro de uma placa de 'etri vazia. 6erter sobre o inculo 3/ m0 de meio de cultura fundido e aquecido a 789". Agitar a placa realizando movimentos circulares no sentido -or*rio e no sentido anti!-or*rio ou realizando movimentos em oito. ,ncubar as placas na posio invertida, uma vez que a elevada concentrao de *gua no meio pode provocar condensao durante a incubao. 4o meio slido, cada clula vi*vel dar* origem a uma col:nia, portanto a inoculao em placas pode ser utilizada, no somente para cultivar microrganismos, como tambm para contar e isolar. ;m geral quando se dese<a obter col:nias isoladas a partir de um determinado material, necess*rio diluir a amostra em tubos com *gua destilada estril.

TCNICA DE SEMEADURA
Alguns procedimentos so indispens*veis para deteco e quantificao de diferentes microrganismos. ;stas tcnicas consistem de regras de assepsia e segurana para evitar a contaminao dos meios de cultura com microrganismos do ambiente= para obter culturas puras= para evitar acidentes laboratoriais. (. A ala de platina deve ser flambada antes e depois de qualquer operao de semeadura. 'ara tanto, devem ser aquecidos ao rubro e a parte inferior do cabo deve ser passada na c-ama de 3 a > vezes. A posio correta para a flambagem da ala que a mesma faa um ?ngulo de 78 em relao @ mesa de trabal-o. 3

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3. Antes de retirar o material para a elaborao do esfregao ou para semeadura deve! se esfriar a ala na parede interna do tubo ou na tampa da placa de 'etri. >. 'ara a semeadura em tubos de ensaio, deve!se flambar rapidamente a boca dos mesmos logo aps a retira a ! ta"p#! e a$%! #! . ;ste dever* ser mantido seguro pelo dedo m nimo da mo que est* segurando a ala. Aps a retirada do material com a ala, flambar novamente a boca do tubo e recolocar o tampo de algodo. Alambar a ala aps o uso. N#! p!&sar !s ta"p'es s!(re a (a)*a a. 7. As pipetas utilizadas em Bicrobiologia so previamente embrul-adas em papel e esterilizadas. 'ara uso, torcer o papel na regio central da pipeta, retirar primeiramente o papel na parte superior e depois a inferior (correspondente @ ponta da pipeta). ;sta seqCDncia evita que a pipeta se<a contaminada pelas mos do operador. Ema vez usada, a pipeta deve ser colocada dentro de uma cuba de vidro ou pl*stico, contendo desinfetante. 8. As placas de 'etri devero ser abertas pr%ima ao bico de Funsen para evitar contaminao com germes do ar. Ema vez semeadas as placas devem ser incubadas em estufas com tampa voltada para bai%o. T+*)i*a e se"ea &ra e" p$a*a e ,etri a partir e *&$t&ra e (a*t+ria.

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,r!*e i"e)t!/ a.) flambar a ala= b.) remover o tampo de algodo= c.) introduzir a ala na cultura de bactria= d.) com a ala, delicadamente, semear na placa de 'etri= e.) flambar novamente a ala= f.) a partir de um ponto <* semeado, distribuir o material na placa, fazendo estrias no restante da placa.

1.0. ISOLAMENTO
Isolar significa separar um tipo de microorganismo a partir de uma populao que o contm. ;m -abitats naturais, raramente encontramos os microrganismos em cultura pura (um Gnico tipo de microrganismo), portanto faz!se necess*rio um procedimento de isolamento para separar e identificar os distintos tipos de microrganismos presentes. & isolamento pode ser feito diretamente a partir de uma amostra quando os microorganismos esto numa proporo adequada. Huando o microrganismo que se dese<a isolar se encontra em pequena quantidade, realizado o procedimento c-amado enriquecimento que significa elevar a quantidade do microrganismo de interesse com relao ao restante da populao. A seguir se isola empregando o mtodo de isolamento por estrias ou por diluio, para posterior identificao. 'rocedimentos empregados no isolamento de microrganismos. a) isolamento por estrias b) isolamento por diluio ,solamento em placas por estrias
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;%istem diversas tcnicas, todas com o ob<etivo de obter col:nias isoladas. Tcnica # "onsiste em carregar a ala de platina em $ com a amostra e fazer estrias paralelas na quarta parte da superficie da placa= flambar a ala, esfriar, girar a placa I/9 e continuar fazendo estrias recobrindo outro quarto da placa, aps tocar > ou 7 vezes a *rea semeada inicialmente. 'or Gltimo, sem flambar novamente, fazer estrias no restante da superf cie da placa. Tcnica % "om a ala de platina carregada fazer > ou 7 estrias= flambar e fazer mais > ou 7 estrias perpendiculares @s anteriores, flambar novamente e repetir o procedimento at esgotar a superficie da placa. ,solamento por diluio em meio slido J usando tanto o mtodo de inoculao em profundidade como o mtodo de inoculao em superficie. Apenas necess*ria a diluio da amostra. 'ara tanto pode!se preparar dilui5es decimais utilizando!se *gua estril ou outro diluente. A inoculao em profundidade pode ser realizada tal como descrita anteriormente. Ema outra forma preparar as dilui5es diretamente em tubos de *gar fundido e aquecido (3/ m0), agitar por rotao do tubo entre as mos e verter o meio em placas de 'etri estreis.

CULTURA ,URA
Ema cultura pura pode ser observada a partir de col:nias isoladas em meio no seletivo, atravs de um e%ame microscpico que deve apresentar clulas morfologicamente semel-antes e com mesmo resultado para a colorao de Kram. 'ara facilitar a identificao, deve!se descrever as col:nias macroscopicamente em funo do taman-o, forma, borda, elevao, transparDncia e cor. Huando so obtidas col:nias isoladas em meios seletivos, deve!se proceder a um novo isolamento em meio no seletivo utilizando!se o mtodo de estrias. ;ste procedimento con-ecido como re!isolamento.

,ES2UISA DE MICROORGANISMOS/
Huando se dese<a saber se um determinado tipo de microorganismo est* presente ou ausente numa amostra, deve!se realizar as seguintes etapas. a) enriquecimento b) isolamento por estrias em meios de cultura seletivos ou diferenciais. c) re!isolamento (meio de cultura no seletivo) d) identificao
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A etapa de enriquecimento pode subdividir!se em duas. pr!enriquecimento e enriquecimento seletivo. & &r-enri'ueci"ento ou enri'ueci"ento n(o seletivo deve ser realizado somente quando os microrganismos esto debilitados ou sofreram danos, sendo empregados apenas meios nutrientes l quidos, no seletivos. & enri'ueci"ento seletivo realizado incubando!se a amostra em meios l quidos seletivos, ou se<a, em presena de agentes qu micos ou biolgicos que favorecem o desenvolvimento em particular dos microrganismos pesquisados. Ema vez cumprida a etapa de enriquecimento, procede!se ao isolamento, empregando a tcnica de estrias em superf cie, utilizando!se meios de cultura seletivos e diferenciais. & re!isolamento em meios no seletivos, para obteno de culturas puras e identificao das mesmas, a etapa final. & resultado da pesquisa se d* sempre e%pressando 'L;S;4MA ou AESN4",A por grama ou m0 de amostra inoculada na primeira etapa do procedimento (enriquecimento).

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