Protocolo para visualizar flagelos SEM

1. Cortar um filtro de porosidade 0,45 micra ou 0,22 micra com dimensões aproximadas
de 2 cm x 2 cm, e proceder a metalização com ouro num sputter,
2. Aplicar uma gota de 20 microlitros de cultura bacteriana no centro do filtro e aplicar o
filtro sobre papel de filtro para absorver o excedente do meio de cultura,
3. Após absorver o meio excedente, substituir o papel de filtro anterior por um novo,
4. Aplicar 100 microlitros de fixador (glutaraldeído 2,5% + formaldeído 1% em tampão
cacodilato de sódio 0,1M), deixar fixar 60 min no interior de uma placa de petri sem
deixar desidratar o fixador, se necessário adicionar mais fixador,
5. Substituir o papel de filtro por um novo e adicionar 200 microlitros de tampão de
cacodilato de sódio 0,1M, repetir este passo 3 x,
6. Desidratar em concentrações sucessivas de etanol 50 a 100%,
a. Aplicar 200 microlitros de etanol a 50% sobre a amostra bacteriana, que deve
estar montada sobre papel de filtro previamente embebido em etanol a 50%,
numa placa de petri. Aguardar 10 min sem nunca deixar desidratar,
b. Repetir o procedimento em a) para cada concentração de etanol, sem nunca
deixar secar,
c. Aplicar uma gota de n-pentano a – 85 ºC (caso o filtro seja resistente), em
contrário, passar directamente para o passo seguinte,
7. Aplicar a amostra no dissecador de vácuo até evaporar todo o solvente,
8. Contrastar a amostra,
9. Montar a amostra num stub de SEM e aplicar ouro,
10. Visualizar.