25/07/2017 Revisão da Práticas

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL

INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS

DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA MOLECULAR E BIOTECNOLOGIA

REVISÃO DAS AULAS PRÁTICAS

· Clonagem do gene gfp (Green Fluorescent Protein) de Aequorea victoria água-viva (celenterado, jellyfish)
em E. coli (LE392)

GFP é utilizado como repórter em estudos de expressão gênica e na localização de proteínas em uma grande
variedade de organismos.

A proteína GFP espécie selvagem (uma única cadeia polipeptídica de 238 aa)

A proteína GFP tem dois picos de absorbância máxima: 395nm e 475nm

Excitação a 395nm resulta na fluorescência a 508nm (verde)

· A cepa LE392 é uma E. coli de laboratório auxotrófica, isto é, depende de metabólitos complexos para
sobreviver e, portanto, dificilmente sobrevive fora dos meios de cultura.

1) Extração de DNA total de E. coli

O DNA total de E. coli foi extraído como exemplo pois, em uma situação real, o DNA total de Aequorea
victoria deve ser obtido.

A bactéria E. coli foi crescida em meio de cultivo rico e recuperada por centrifugação.

A escolha da técnica a ser utilizada para romper as bactérias é ditada por 3 fatores: o tamanho do DNA, a
natureza da parede bacteriana e as técnicas a serem utilizadas subsequentemente.

Fragmentos longos de DNA (como o DNA total de E. coli) são facilmente fragmentados e devem ser
liberados das células por um processo brando. As bactérias são ressuspendidas em uma solução de NaCl e
EDTA que deve ter pH 8 [0,9% NaCl (154mM) solução isotônica; EDTA só é solubilizado a pHs >7).

EDTA (ácido etilenodiaminotetracético) inibe a atividade de desoxirribonucleases (DNases) pois atua como
agente quelante de íons essenciais para a atividade destas enzimas (Mg2+)

SDS: é um agente detergente que solubiliza lipídeos. É um desnaturante de proteínas e também rompe
ligações não-covalentes inter-subunidades de proteínas oligoméricas. Também é utilizado para se certificar
que nenhuma nuclease que não depende de Mg2+, cause qualquer degradação.

NaCl: íons no meio aquoso podem romper ligações iônicas de cadeias polipeptídicas. Também auxiliam na
dissociação das proteínas ligadas aos ácidos nucléicos.

Solventes orgânicos: que têm uma porção hidrofóbica (lipofílica) e uma porção polar são agentes de
precipitação de macromoléculas. Os grupos polares interagem com grupos polares protéicos em competição
com moléculas de água. Os grupos hidrofóbicos podem romper interações intramoleculares estabilizantes da
estrutura da proteína. Um volume elevado de solvente orgânico reduz a concentração efetiva da água,
deixando menos moléculas de água para hidratação da proteína. Isto é, modificam a camada de solvatação
das proteínas.

Fenol-Clorofórmio: contaminantes protéicos são desnaturados e há partição das mesmas na fase orgânica ou
interface entre as fases orgânica e aquosa, enquanto que ácidos nucléicos permanecem na fase aquosa. A
utilização de fenol-clorofórmio é mais eficiente do que a utilização de somente um deles. Lipídeos, grandes
polissacarídeos e proteínas complexadas ao SDS permanecem na fase fenólica.

Etanol: É utilizado para precipitar

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Etanol: É utilizado para precipitar ácidos nucléicos com mais do que 15 nucleotídeos. Sais e outros solutos
tais como fenol e clorofórmio ficam em solução enquanto que ácidos nucléicos formam um precipitado
branco que pode ser coletado por centrifugação.

Tampões contendo > 1mM fosfato ou > 10mM EDTA não devem ser utilizados para precipitação de etanol
pois estas substâncias co-precipitam com os ácidos nucléicos.

2) Extração de DNA plasmidial

Solução de formação de protoplastos: isotônica (isosmótica) a fim de que não haja o rompimento das
membranas das células bacterianas.

Lisozima: enzima presente nas lágrimas e muco, assim como na clara de ovo. Catalisam a hidrólise da
ligação glicosídica entre N-acetilglucosamina (NAG) e ácido N-acetilmurâmico (NAM). Consequentemente,
tratamento de bactérias Gram(+) com lisozima degrada as suas paredes bacterianas e resulta na lise das
células. Bactérias Gram(-) como E. coli são resistentes à lisozima e ocorre somente o enfraquecimento da
mesma. Peptideoglicano: peptídeo + polissacarídeo b(1---->4) NAG-NAM Peptideoglicano: Gram(+) ~
250Å; Gram(-) ~ 30Å + parede externa complexa

Solução de Lise (NaOH e SDS): saponificação de lipídeos e rompimento da parede bacteriana pela
solubilização da bicamada lipídica.

Acetato de Sódio: utilizado para a precipitação de DNA e RNA. É mais solúvel em etanol do que NaCl.

PLASMÍDEOS: são elementos extracomossomais com capacidade de replicação autônoma.

Características (vetores):

constituídos por uma molécula de DNA de fita dupla circular.

origem de replicação autônoma

possuem genes que conferem resistência à antibióticos.

possuem um sítio de policlonagem.

podem variar de 1000 bp até 200 000 bp.

3) Digestão: enzimas de restrição

Enzimas de restrição são endonucleases que reconhecem e rompem as ligações de fosfato de seqüências
específicas de DNA. Endonucleases de restrição não cortam quando a seqüência específica de DNA for
metilada por uma Metilase. Diferentes espécies e cepas de bactérias contem pares únicos de sistemas de
restrição/metilação. Desta forma, o DNA de outro organismo que invade uma bactéria é rapidamente
degradado enquanto que o DNA do hospedeiro, que é metilado, não é degradado.

Uma unidade enzimática de restrição (1U) é a quantidade de enzima necessária para clivar completamente 1
µg de DNA de bacteriófago l, em 1 hora, na temperatura ótima de atividade (37°C, em geral).

4) Análise eletroforética em gel de agarose

Agarose é um polímero linear extraído de algas marinhas e basicamente se compõe de D-Galactose e L-

Galactose. Quando a agarose é derretida e então deixada para solidificar, ela forma uma matriz que serve
como uma peneira de separação de fragmentos de DNA de tamanhos diferentes. A eletroforese em gel de
agarose é uma técnica simples, fácil e sensível, capaz de separar fragmentos com maior resolução do que
outros métodos como a centrifugação em gradientes de CsCl (cloreto de Césio), por exemplo. Outra
vantagem é que os ácidos nucléicos podem ser visualizados no gel, pelo uso do corante fluorescente Brometo
de Etídeo (lexc ~300nm; l l ~590nm, vermelho-laranja). Este corante se intercala entre os pares de bases
empilhados da molécula de DNA/RNA. A fluorescência do Brometo de Etídeo associado a ácidos nucléicos

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é maior do que livre em solução permitindo, deste modo, que pequenas quantidades de DNA/RNA sejam
detectadas (cerca de 10ng DNA ou RNA por banda).

Fatores que influenciam a migração em gel de agarose:

Concentração

Tamanho dos fragmentos de DNA: fitas lineares duplas passam através da matriz do gel a uma
velocidade inversamente proporcional ao log pb (fragmento menor é mais rápido).

Conformação do DNA: o formato do fragmento de DNA de um determinado tamanho influencia

a velocidade de migração (circular fechado: + rápido; circular aberto: mais lento; linear:
intermediário).

Corrente aplicada: maior voltagem resulta em migração mais rápida. (voltagens muito altas ou
muito baixas não são recomendadas). Voltagem normal: 5-10 V/cm

Direção do campo elétrico: DNA migra em direção ao ânodo (carga positiva) devido aos grupos
fosfatos de carga negativa.

Composição do tampão de eletroforese: Na ausência de íons a condutância elétrica é mínima e o

DNA migra bem devagar. Em tampões de alta força iônica a condutância elétrica é por demais
eficiente e uma grande quantidade de calor é gerada - no pior caso o gel derrete e o DNA
desnatura. Também a carga é função do pH do tampão.

5) Purificação e ligação

O fragmento de DNA clivado será purificado do gel de agarose e ligado a um vetor de super-expressão - que
também foi clivado com as mesmas enzimas de restrição.

6) Transformação

O fragmento de DNA ligado a um vetor de super-expressão será introduzido em células bacterianas

hospedeiras.

Transformação é a introdução de moléculas de DNA em uma célula hospedeira (bactérias são ideais, mas
células eucarióticas são utilizadas em alguns casos). Várias técnicas têm sido descritas para a introdução de
DNA em células bacterianas:

6.1) Choque térmico: incubação de células hospedeiras (preparadas com cloreto de cálcio) com moléculas de
DNA e submetendo a mistura a um choque térmico resulta num aumento da eficiência da transformação. Os
mecanismos envolvidos na transformação de DNA não são completamente conhecidos. Mas os
requerimentos essenciais para uma transformação eficiente são a presença de cátions multi-valentes,
incubação à 0°C, e controle rigoroso do choque térmico à 42°C. A proporção de células que se tornam
"competentes" para transformação é de aproximadamente 10% da população total. Eficiência: 105 - 106
colônias transformadas/µg de DNA plasmidial.

6.2) Eletroporação: É um processo físico que transitoriamente permeabiliza membranas de células

procarióticas e eucarióticas a partir de um pulso elétrico. Eficiência: 109 - 1010 colônias transformadas/mg
de DNA plasmidial. Eletroporação é feita a baixa temperatura (0-4°C) pois a eficiência é reduzida em cerca
de 100 vezes à temperatura ambiente. 6.3) Choque osmótico:

6.4) Micro-injeção de DNA: O DNA é injetado nas células com uma micropipeta de vidro (ponta de 0,1 mm
de diâmetro).

6.5) Balística de Micropartículas: Projéteis de ouro (ou tungstênio) são cobertos com moléculas de DNA e
utilizados para bombardear células hospedeiras.

7) Análise de colônias

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As colônias serão analisadas por algum marcador que permita a identificação de células hospedeiras que
possuam o plasmídeo com o gene clonado.

8) O resultado destas manipulações do gene que codifica a GFP é a transferência do mesmo de um vetor de
clonagem para um vetor de super-expressão (com regiões promotoras e terminadoras da transcrição).

9) REAÇÃO EM CADEIA DA ENZIMA DNA POLIMERASE (PCR)

Introdução:

Em 1985 foi desenvolvida a técnica da Reação em Cadeia da DNA Polimerase (PCR, Polymerase Chain
Reaction). PCR permite a produção de grandes quantidades de um determinado segmento de DNA a partir de
apenas uma molécula de DNA sem haver a necessidade de introduzir esta molécula de DNA em bactérias.

Os dois desenvolvimentos tecnológicos que melhoraram, simplificaram e reduziram o trabalho necessário

para a execução de PCR são:

1) a utilização da DNA Polimerase termoestável isolada de Thermus aquaticus (Taq DNA

Polimerase) em um tampão que permite a síntese de DNA e que permanece enzimaticamente
ativa à temperatura de desnaturação do DNA (meia-vida de 40 minutos à 94 - 95°C). A Taq
DNA Polimerase é formada por uma única cadeia polipeptídica com um peso molecular de 95
kD. Esta enzima tem máxima atividade à temperaturas em torno de 75°C e pH 9. Uma unidade
enzimática é definida como a quantidade de enzima necessária para catalizar a incorporação de
10nmol de dNTP durante 30min à 74°C.

2) o desenvolvimento do termo-ciclador programável permitiu o aquecimento e resfriamento das

amostras automaticamente e, deste modo, eliminou o trabalho tedioso de ter de transferir os
tubos entre blocos de aquecimento de diferentes temperaturas.

Os componentes necessários para a execução de uma reação de PCR são:

· DNA fita molde a ser amplificado (DNA "template")

· DNA Polimerase

· dois oligonucleotídeos (primers) complementares às fitas opostas do DNA molde

· desoxirribonucleotídeos trifosfato (dNTPs: dATP, dCTP, dGTP, dTTP)

· tampão da DNA Polimerase (MgCl2, DTT)

A reação de PCR propriamente dita

A reação de PCR é baseada no fato de oligonucleotídeos (primers) hibridizarem especificamente a uma fita
molde de DNA. As três etapas contituintes de cada ciclo necessárias para a síntese de qualquer DNA por
PCR são:

1) Desnaturação: a fita dupla do DNA molde é termicamente desnaturada em suas fitas simples (94-95°C -
de 15segundos até 2minutos)

2) Anelamento: os primers (oligonucleotídeos) anelam por complementaridade às fitas do DNA molde a uma
temperatura mais baixa do que a utilizada na etapa anterior (40-60°C - de 30 até 60segundos)

3) Extensão (síntese): primers anelados ao DNA molde servem como ponto de partida para a DNA
Polimerase sintetizar uma fita complementar a uma das fitas do DNA molde incorporando os dNTPs da
mistura de reação. Ao término desta etapa são geradas cópias adicionais da seqüência do DNA molde situada
entre os dois primers. A temperatura para extensão é geralmente de 72°C (1-2minutos)

Estes 3 ciclos são repetidos várias vezes e ao fim de cada ciclo ocorre a duplicação do número de DNA fita
dupla que havia no ciclo anterior. Isto é, há uma amplificação exponencial da seqüência do DNA alvo: 2n
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(n=número de ciclos). Por exemplo: ao término de 20 ciclos haverá 220 (mais do que 1 milhão) cópias da fita
dupla do DNA molde. As quantidades dos primers são altas (em excesso) o que faz com que a hibridização
dos primers ao DNA molde ocorra em segundos. O ácido nucléico amplificado pode então ser analisado
(tamanho, quantidade, seqüência), ou utilizado em protocolos experimentais posteriores (p.ex., clonagem).

Observação: A DNA Polimerase termo-estável utilizada em PCR utiliza fitas de DNA como molde e,
portanto, esta técnica é limitada à amplificação de DNA. Análises envolvendo a expressão diferencial de
genes durante o desenvolvimento ou a clonagem de cDNA a partir de mensagens raras necessitam que o
RNA seja primeiramente reversamente transcrito em um cDNA a fim de fornecer uma fita molde de DNA
molde necessária para a DNA Polimerase. Este processo é conhecido por transcrição reversa (RT = Reverse
Transcription) e o processo de amplificação conhecido por RT-PCR.

Cuidados para evitar falsos-positivos

Contaminação com amplicons - cópias idênticas da seqüência nucleotídica do DNA molde - é o problema
mais sério e também o mais provável de ocorrer devido ao grande número de moléculas de DNA produzidas
por PCR.

As seguintes precauções devem ser tomadas a fim de evitar contaminação:

· utilizar material descartável

· utilizar reagentes previamente aliquotados em lotes submetidos a um controle de qualidade

· utilizar pipetas automáticas (nunca pipetar com a boca)

· analisar os produtos da amplificação em uma área fisicamente separada da área onde reagentes e amostras
são preparadas.

Exemplos de aplicações

· Estudos básicos de estrutura e função gênica (produtos proteicos e suas funções celulares)

· Estudos genéticos e taxonômicos (marcadores moleculares ----> identificação de indivíduos)

· Controle de qualidade (a presença de um microorganismo que pode contaminar uma população que produz
determinado antibiótico)

· Diagnóstico molecular de doenças infecciosas e genéticas (TB, HIV, etc.)

· Melhoramento genético de animais, plantas e microorganismos

Exemplos práticos:

· Diagnóstico de Mycobacterium tuberculosis: a microscopia de escarro seguido pela cultura é o método

tradicional para o diagnóstico da tuberculose. No entanto, estes métodos bacteriológicos são lentos e caros.
Além disto, estes métodos apresentam baixa sensibilidade quando amostras clínicas têm um pequeno número
de organismos patogênicos. A seqüência de inserção IS6110 é específica do complexo M. tuberculosis e está
presente em diversas cópias tornansdo a IS6110 um alvo excelente para a utilização da amplificação por PCR
como método de diagnóstico. Análise do produto de PCR por gel de agarose indica a presença deste
patógeno. (IS são elementos genéticos transponíveis que carregam apenas a informação genética essencial
para transposição: seqüências terminais de DNA específicas e a região codificante da transposase que
reconhece tais seqüências.)

· Diagnóstico do vírus da AIDS (Human Immunodeficiency Virus type 1 - HIV-1) que é um dos agentes
etiológicos desta doença viral.

· Identificação de cepas de Staphylococcus aureus (Gram+) resistentes à meticilina é baseada na

amplificação por PCR do gene mecA que codifica a PBP-2' (Penicillin-Binding Protein) que não está

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presente em cepas sensíveis aos antibióticos b-lactâmicos. PBPs são transpeptidases ou carboxcipeptidases
que participam da síntese de peptideoglicanos da parede celular.

Otimização da PCR

· [MgCl2+]

DNA "template", agentes quelantes na amostra (ex. EDTA), dNTPs e proteínas alteram a [Mg2+] livre.

Ausência de [Mg2+] adequada: Taq DNA Polimerase é inativa.

Excesso de Mg2+ livre: redução da fidelidade enzimática e aumento de produtos não específicos.

Importante: determinar empiricamente [Mg2+] ótima para cada reação.

· Tampão

Ausência de Triton X-100: pouca ou nenhuma atividade da Taq DNA Polimerase.

· [Enzima]

Recomendado: 1,25U da Taq DNA Polimerase em 50 µl de reação. Adicionando mais enzima não altera o
produto da PCR. Rastro de DNA em gel ("smearing")de agarose: tempo de extensão muito longo e excesso
de enzima ocasionam o aumento da probabilidade da atividade exonucleásica 5'---->3' da Taq DNA
Polimerase.

Desenho dos "primers"

Tamanho: 15 - 30 bases

Deve conter: ~ 40 - 60% G+C

Evitar: seqüências que produzam estruturas secundárias ex:

5' CCCCATTGGGG 3'

3'-ends não devem ser complementares a fim de evitar primer-dimers na reação de PCR

5' ATCGTAATGCGC 3'

5' CTAATTGCGCA 3'

____________________________________

5'ATCGTAATGCGC 3'

3'ACGCGTTAATC 5'

Tm similares dos primers: a temperatura de anelamento depende do primer com menor Tm.

·Solução do DNA "template"

Ao purificar DNA deve-se evitar os seguintes compostos pois são fortes inibidores da Taq DNA Polimerase:
sais, guanidina, proteases, solventes orgânicos e SDS.

· Quantidade de DNA

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Dois erros muito comuns:

muito DNA plasmidial

muito pouco DNA genômico

Aconselha-se iniciar com mais do que 104 cópias do DNA "template"

(mas manter [DNA] < 10 ng/µl)

(1 µg de 1kb dsDNA = 9,12 x 1011 moléculas)

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