ANÁLISE de Picobirnavírus (PBV) e Rotavírus EM FEZES.

Extração com guanidina / adaptado de Chomczynsky e Sacchi (1987).

PREPARO DAS AMOSTRAS:

1. Diluir aproximadamente 2 gramas de fezes em 4 ml de PBS pH 7,4;
2. Centrifugar por 15 min. a 2000 rpm;
3. Coletar 100 µl do sobrenadante e transferir para eppendorf;
4. Adicionar 10 µl de SDS a 10%;
5. Incubar a 37ºC por 30 min.;
6. Adicionar 400 µl de solução "D";
7. Adicionar 40 µl de acetato de sódio 2M;
8. Adicionar 80 µl de clorofómio;
9. Adicionar 400 µl de fenol (saturado em água);
10. Agitar as amostras durante 1 min. no vortex;
11. Centrifugar por 10 min. a 15000 rpm;
12. Coletar o S/N (aproxim. 400 µl);
13. Adicionar clorofórmio (aproxim. 400 µl);
14. Agitar as amostras durante 1 min. em vortex;
15. Centrifugar por 10 min. a 15000 rpm;
16. Coletar o S/N (aproxim. 300 ml);
17. Adicionar NaCl 20 % (v =10% da amostra);
18. Adicionar Etanol (v =2,5x vol. da amostra);
19. Armazenar as amostras a -20 ºC por 18 hs ou a -70 ºC por 2 hs;
20. Centrifugar por 10 min. a 1500 rpm;
21. Desprezar o S/N;
22. Colocar os eppendorfs invertidos sobre papel absorvente em estufa a 37ºC;
23. Diluir os pellets em água destilada e acrescentar tampão redutor;
24. Aquecer por 15 min. a 56ºC.
25. Colocar no gel em volume apropriado