CURSO DE MEDICINA - ROTEIRO DE PRÁTICAS

CRONOGRAMA DA UC: ORGANIZAÇÃO MOLECULAR E CELULAR SEMESTRE:2021.2

PROFESSOR(ES) RESPONSÁVEL(IS): Albert Martins / Artur Clarck/ Luciana Teixeira/ TURMA: P1A

ROTEIRO LABORATÓRIO MORFOFUNCIONAL (LMF)

11 PRÁTICA: Técnica de diagnóstico em biologia molecular – Hibridização.

ROTEIRO DE ESTUDO

❖ Objetivos a Serem Estudados Previamente:

1 – Citar as etapas da técnica de biologia celular e molecular do DNA (HIBRIDIZAÇÃO) e sua

aplicabilidade.

2 - Determinar a aplicabilidade das técnica em biologia molecular (Northern Blot, Western

Blot e Southern Blot).

❖ Objetivos a Serem Desenvolvidos na Sessão:

1 – Acessar a plataforma virtual e visualizar a sequência de um gene no Genbank gerado por

sequenciamento de DNA e seguir as instruções corretamente.
2 – Identificar os resultados dos testes de diagnóstico: Southern blotting, Western blotting, Northern
blotting.
3 – Identificação do genótipo pela análise do painel de hibridização.
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PRÁTICA 1 – DETECÇÃO DE MUTAÇÃO/POLIMORFISMO ATRAVÉS DE HIBRIDAÇÃO DE

DNA - (SOUTHERN BLOTTING ).
Princípio da Técnica.
➢ Inicialmente o DNA foi extraído.
➢ O DNA foi tratado com enzimas de restrição (Eco Ri/ BstUI) pela técnica RFLP (Restriction
Fragment Length Polymorphism) de apresentado no esquema abaixo.
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➢ Amostra submetida a eletroforese em gel para separação

dos fragmentos gerados.
➢ Uma membrana de nitrocelulose (ou, alternativamente,
nylon) é posta sobre o gel. Uma pressão é aplicada
uniformemente sobre o gel (tanto usando-se sucção, ou
pondo-se sobre a membrana uma pilha de toalhas de
papel com um peso em cima). Isso faz com que o DNA
passe do gel para a membrana, onde ele se adere.
➢ A membrana é então aquecida (no caso da nitrocelulose)
ou exposta a radiação ultravioleta (no caso do nylon)
para permanentemente ligar o ADN à membrana.
➢ A hibridização foi realizada com sondas moleculares
correspondentes.
➢ A membrana agora tratada com uma sonda
hibridizadora - que é uma molécula (Sonda Molecular)
de DNA isolada cuja sequência é conhecida e é idêntica,
➢ A formação de híbridos é detectado colorimetricamente
ou de forma contrastada.
➢ Essa sonda irá parear com qualquer sequência de ADN
complementar a ela.
➢ Portanto se a sequência procurada não estiver presente
na amostra não haverá o pareamento.

O excesso de sonda é lavado da membrana, e toda a sonda não

hibridizada (não pareada) será removida.

➢ Cartografia por meio de RFLP. Representada a capacidade genética (azul) em um indivíduo

homozigoto (A) e outro heterozigoto (B) para um marcador. Depois de se hibridizar com uma
sonda específica (rosa) observa-se o resultado do Southern Blot à direita.
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PROCEDIMENTOS:
1.1 – Observe a sequência de 120 pb de DNA extraída como sendo o alelo selvagem de um gene X de
um organismo diploide.
1.2- Determine as variações de sequências de DNA, reconhecidas por enzimas de restrição, capazes de
clivar sequências específicas do DNA (sítios de restrição) com posterior visualização em gel de
eletroforese dos fragmentos obtidos após digestão.
1.3 – O outro alelo deste gene X possui uma mutação de G>A na posição 32.

3’- CTGGCCTCAA TCTCACAGTC TGCCTGCATC CGCGTACTCT GCCCTCATTC CGCGTGCAGG

ACTATGACGT AGCAGCAGGT GACCTTTACG GAGGATAAGA GCAATGCGCT TATTACAGTG -5’

1.4 - Determine os tamanhos dos fragmentos obtidos após digestão pela enzima BstUI (sítio de restrição
5’-CG▼CG-3’) no gel de eletroforese abaixo.
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68 pb, 52pb, 32 pb e 20 pb.

A

5’- CTGGCCTCAA TCTCACAGTC TGCCTGCATC CGCGTACTCT GCCCTCATTC CGCGTGCAGG

ACTATGACGT AGCAGCAGGT GACCTTTACG GAGGATAAGA GCAATGCGCT TATTACAGTG -3’

5’- CTGGCCTCAA TCTCACAGTC TGCCTGCATC CGCGTACTCT GCCCTCATTC CGCGTGCAGG

ACTATGACGT AGCAGCAGGT GACCTTTACG GAGGATAAGA GCAATGCGCT TATTACAGTG -3’

1.5 – Determine a sonda para hibridização e identificação da região mutante.

_CACGTACTCT
__________________________________________

__GTGCATGAGA_____________________________________
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1.6 – Observe a formação de híbridos de sequências polimórficas detectados abaixo. Determine o

resultado do genótipo em relação aos alelos através de hibridação de DNA.
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PRÁTICA 2 – Paciente é dominante homozigoto para uma determinada doença. Determine o

resultado do genótipo em relação aos alelos através de hibridação de DNA para cada paciente e qual
dos paciente apresenta a doença.

Paciente 1:____________________________________________
Paciente 2:____________________________________________
Paciente 3:____________________________________________

1 - Se uma pessoa tem duas cópias do mesmo alelo (é homozigótica), apenas uma banda será
(aa) – Alelo homozigótica recessiva.

2 – Heterozigoto (Aa)
3 – Homozigoto ( AA)
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PRÁTICA 3 - DASAFIO DO GRUPO - DIAGNOSTICO MOLECULAR

IDENTIFICAR A SEQUÊNCIA DE UM GENE NO GENBANK.
PROCEDIMENTOS:
Observe o resultado do teste molecular do paciente e verifique o gene utilizado para identificação do
genoma viral.
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Para a localização do gene proceda com as instruções.

3.1. Clicar no seguinte endereço eletrônico https://www.ncbi.nlm.nih.gov/
3.2. No site, procurar a palavra “GENE” no menu do lado direito da tela e clicar
3.3. No campo pesquisar digite o nome do gene a ser pesquisado: SARS-CoV-2. Clique em “search” ou
procurar.
3.4. Clique no link relacionado a “ ORF1ab”
3.5. Na tela seguinte procurar um local com as seguintes palavras:
Go to nucleotide: Graphics FASTA GenBank.
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Clicar na palavra “FASTA”. Essa ação direcionará para a página de visualização da sequência de bases
nitrogenadas do gene.
3.6. Encontrar o local de ligação na sequência gênica com a sonda de hibridização. Obs: Pode ser
encontrado copiando a sequência e buscando no texto utilizando a ferramenta “localizar” ou ctrl+F.
TGGCTACCCTCTTGAGTGCATTA- Após encontrá-lo, determine a possível sequência viral
encontrada com a sonda de hibridização.

_____________________________________________________________________________________

3.7 – Determine a técnicas em biologia molecular aplicada no teste: _________________________________

⎫ Southern-blot: Análise do DNA transferido para a membrana. ⎫ Northern-blot: Análise do RNA

transferido para a membrana.

TAACAACTTCTGTGGCC
ATTGTTGAAGACACCGG