Título: Aula Laboratorial no Laboratório Aberto do IPATIMUP: Cancro hereditário da

mama e do ovário
Data: 20 de fevereiro de 2024
Identificação dos autores: Ana Vilas Boas nº1, Rodrigo Ramos nº16 e Sara Senra nº19

Resumo:
Nesta atividade os participantes terão a oportunidade de identificar famílias com maior
propensão para o cancro hereditário através da análise de árvores genéticas.
Posteriormente, ocorrerá a deteção de uma mutação no gene BRCA1 aplicando técnicas
de biologia molecular para confirmar o diagnóstico em laboratório. As técnicas a realizar
englobam a utilização de micropipetas para a digestão enzimática e posterior eletroforese.

No final espera-se ser possível compreender como se identifica um caso de cancro da

mama hereditário e quais as implicações deste tipo de cancro.

Introdução:
A atividade realizada enquadra-se no tema do cancro hereditário da mama e do ovário,
com foco no seu diagnóstico. Para tal é preciso entender como este se desenvolve.

Cancro é uma massa de células que se propagam e multiplicam de forma descontrolada e

anormal e que invadem as outras células e impedem o normal funcionamento do
organismo, devido a uma alteração que acontece nos genes supressores de tumores,
impedindo-os de funcionar normalmente, o que faz com que os oncogenes se multipliquem
descontroladamente sem nenhum tipo de “travão”.
Genes supressores do tumor são genes que controlam e retardam a divisão celular,
reparam erros do DNA ou indicam quando as células devem morrer (processo conhecido
como apoptose ou morte celular programada). Por outro lado, oncogenes são
proto-oncogenes (genes que promovem o crescimento celular) que sofreram diversas
mutações, multiplicando-se de forma desmedida.

O equilíbrio entre estes dois tipos de genes é fundamental para a homeostasia celular e a
prevenção do cancro.
Nos casos de cancro hereditário, a mutação é herdada dos progenitores e confere um
aumento no risco do desenvolvimento tumoral. No caso do cancro hereditário da mama e
do ovário, os genes que frequentemente sofrem mutações são os genes BRCA1 e BRCA2,
acontecendo a sua não expressão. Neste caso, a proteína estudada foi a BRCA1.

As enzimas de restrição são ferramentas essenciais em biologia molecular e engenharia

genética, permitindo aos cientistas cortar o DNA em locais precisos. Esse corte controlado
é utilizado para vários fins, sendo nesta situação, para posterior identificação de possível
cancro da mama e do ovário.

Sendo assim, a enzima de restrição utilizada foi a Mly I. Esta só consegue realizar a sua
função se BRCA1 funcionar normalmente, se tudo se desenvolver como previsto, a Mly I
dividir-se-á em duas secções mais pequenas que serão separadas na eletroforese.
Esta é uma técnica essencial em biologia molecular e bioquímica, utilizada para fracionar
moléculas com base na carga elétrica e no tamanho possibilitando a quantificação relativa,
dado ao número de cópias de mais de 50 sequências de ácidos nucléicos num único
experimento, tornando capaz de detectar deleções e duplicações.

As moléculas são colocadas num gel de agarose (extraído de Rhodophyta (Alga

Vermelha)) e sob um campo elétrico, onde migram de acordo com a sua carga e tamanho,
amplamente utilizada na análise de ácidos nucleicos.

O aconselhamento genético é recomendado para famílias com histórico hereditário de

cancro, especialmente quando uma mutação genética já foi identificada e para indivíduos
com histórico familiar sugestivo de predisposição hereditária para a doença, especialmente
em parentes próximos da mesma linha familiar.

Como o cancro da mama e do ovário é uma doença com herança autossômica dominante,
são empregadas técnicas como a eletroforese para separar e analisar o DNA, permitindo a
identificação do genótipo do indivíduo. Se o indivíduo for homozigoto positivo ou
heterozigoto para a mutação, ele pode estar em risco de desenvolver a doença, enquanto
os homozigotos negativos não carregam a mutação genética associada à mesma.
Procedimento experimental:
Material:
Um tubo de cor verde - Controlo Homozigótico Positivo (+/+)

Um tudo de cor azul - Controlo Homozigoto Negativo (-/-)

Um tubo de cor laranja - Amostra 1

Um tubo de cor roxo -Amostra 2

Um tubo de cor rosa - Amostra 3

Um tubo de cor amarelo - Amostra 4

Suporte para os microtubos

Gel de agarose

Tina de eletroforese

Corante de carregamento de agarose (Loading Dye)

Solução de Fast Blast DNA Stain (100x)

Micropipeta

Métodos:
Primeira etapa
1. Disponibilizou-se microtubos coloridos, frascos com ADN do controlo ou amostra e
frascos com a enzima MlyI.

2. Colocou-se 20μl de cada amostra de ADN para o respetivo microtubo colorido.

3. Adicionou-se 20μl da enzima MlyI a cada microtubo colorido.

4. Posicionou-se os microtubos na estufa a 37ºC, durante 45 minutos.

5. Retirou-se os microtubos da estufa e procedeu-se à etapa seguinte.

Segunda etapa
1. No gel de agarose (1%), que se encontra na tina de eletroforese, carregar as amostras
pela seguinte ordem (as amostras já possuem o corante de carregamento de agarose
(Loading Dye):

2. Fechou-se a tina de eletroforese e ligou-se a fonte de alimentação.

3. Programou-se a fonte para 100V durante 30 minutos.

4. Desligou-se de seguida a fonte de alimentação e procedeu-se à coloração/revelação do

gel de agarose com solução de Fast Blast DNA Stain (100x).

Resultados:

Enunciado
Considera-se que se trata de cancro hereditário da mama e do ovário quando se deteta
numa família (em alternativa):

A. 3 casos de cancro da mama em familiares de 1ª grau do mesmo ramo da família, sendo

um deles diagnosticado antes dos 50 anos

B. 2 casos de cancro da mama e 1 caso de cancro do ovário no mesmo ramo da família

C. 1 caso de cancro da mama antes dos 45 anos e 1 caso de cancro do ovário em

qualquer idade

D. 1 caso de cancro da mama ou do ovário antes dos 30 anos

E. 1 caso de cancro da mama num homem

 Tabela 1: Identificação de casos hereditários de cancro da mama e do ovário

critério caso #1 caso #2 caso #3 caso #4 caso #5 caso #6

A - - X - - -
B - - - - - -
C - - - - - -
D - - - - - -
E - - - - X -

Caso #3

Indivíduo Genótipo Caso #5

7 Homozigótico positivo Indivíduo Genótipo

9 Heterozigótico 4 Homozigótico positivo

10 Homozigótico negativo 5 Homogigótico negativo

11 Heterozigótico 6 Heterozigótico

12 Homozigótico negativo 8 Heterozigótico

Tabela 4: Diagnóstico genético da eletroforese

Caso #3 Caso #5

7 9 10 11 12 4 5 6 8
+
= - - = - - 608 pb

- = - = - - - 413 pb

- = - = - - - 197 pb
-

Figura 2: Esquema da eletroforese

Discussão dos resultados:
Os resultados obtidos na atividade experimental corroboram as expectativas teóricas
estabelecidas.

A identificação das famílias com maior propensão para o cancro hereditário através da
análise de árvores genéticas apresentadas na Figura 1 e posterior identificação do
genótipo com risco de desenvolver cancro hereditário da mama e do ovário nos casos
identificados constituiu o ponto de partida para os subsequentes resultados.

A utilização da enzima de restrição Mly I permitiu analisar o DNA das amostras,

especificamente o gene BRCA1, em relação à presença de mutações.

Na primeira parte da experiência, a incubação das amostras de DNA com a enzima Mly I,
seguida pela eletroforese no gel de agarose, mostrou uma separação clara dos fragmentos
de DNA de acordo com sua carga elétrica e tamanho, tal como podemos evidenciar na
tabela 4, referente aos indivíduos do caso #3 e #5.

Ao analisar o gel de agarose, as amostras homozigóticas positivas (+/+) mostram dois

fragmentos de DNA da mesma extensão: 608 pares de bases, que corresponde aos
fragmentos de maiores dimensões, pelo que deduzimos que a enzima de restrição não se
expressou, revelando que não existem mutações no gene BRCA1.

Por outro lado, as amostras homozigóticas negativas (-/-) apresentam um padrão diferente,
com dois fragmentos de duas dimensões diferentes, 413 e 197 pares de bases, pelo que
inferimos que a enzima de restrição realizou o seu papel, o que indica que não existem
mutações no gene BRCA1.

Por fim, as amostras heterozigóticas (+/-) apresentam um padrão diferente, com

segmentos de dimensões variadas, apresentando todos os 3 diferentes comprimento (608,
413 e 197 pares de bases). Isto porque a enzima Mly I, expressou-se em apenas um dos
alelos. Após estes resultados, podemos depreender que num dos alelos não existem
mutações no gene BRCA1 (alelo negativo), acontecendo o contrário no outro alelo, o que
significa que existem mutações no gene BRCA1 (alelo positivo).
Não obstante de que, mesmo que, o indivíduo não apresente mutações no gene BRCA 1,
este pode sofrer de mutações noutros genes como, por exemplo, o BRCA2 e desenvolver
cancro hereditário da mama e do ovário. Também é importante referir que mesmo não
apresentando qualquer disformidade genética, o indivíduo pode desenvolver cancro,
devido a maus cuidados de saúde.

Conclusão:
Através do histórico familiar, podemos avaliar a prospeção de desenvolver cancro
hereditário da mama e do ovário, assim como é possível observar por intermédio das
tabelas 2 e 3. Um caso trata-se de cancro hereditário da mama e do ovário quando são
detetadas, numa família, determinados critérios que levam à suspeita de predisposição
hereditária para o cancro.

A eletroforese, representada na tabela 4, surge como um método de diagnóstico genético,

permitindo o reconhecimento de genes mutados e, desta forma, agir de maneira a reduzir o
risco associado.

A identificação dos indivíduos afetados com cancro hereditário é fundamental para

prevenção e detecção precoce da doença, portanto, é também muito importante a
identificação dos familiares em risco para que possam ser adequadamente aconselhados e
que medidas apropriadas sejam tomadas.

Não obstante de que, mesmo que, o indivíduo não apresente mutações no gene BRCA 1,
este pode sofrer de mutações noutros genes como, por exemplo, o BRCA 2 e desenvolver
cancro hereditário da mama e do ovário. Também é importante referir que mesmo não
apresentando qualquer disformidade genética, o indivíduo pode desenvolver cancro,
devido a maus cuidados de saúde.

Bibliografia:
https://accamargo.phlnet.com.br/Doutorado/2014/MarciaCPFigueiredo/MarciaCPFigueiredo.pdf
https://cienciaetal.i3s.up.pt/?page_id=9232
https://www.oncoguia.org.br/conteudo/oncogenes-e-genes-supressores-do-tumor/8161/73/