FISH

Fluorescent In Situ Hybridization → Hibridação Fluorescente In Situ

 É uma técnica que utiliza sondas de DNA marcadas com fluorescência para detectar anomalias
cromossômicas que estão além do poder de resolução da citogenética de rotina, como
microdeleções e rearranjos cromossômicos complexos;
 Avanços na utilização de técnicas moleculares;
 Localização e organização espacial das células;
 Amostra ambiental, biofilmes e lodo granular;
 Identificação e quantificação de grupos microbianos;
 O princípio da técnica se fundamenta nas características moleculares do DNA que é
formado por duas fitas complementares unidas pelo pareamento de bases específico. Estas
fitas complementares podem ser facilmente separadas, por meio de aquecimento ou
tratamento alcalino. As fitas simples podem ser renaturadas, por resfriamento ou
acidificação do meio, voltando à conformação de fita dupla (pela especificidade do
pareamento). Se no momento da renaturação do DNA houver na solução disponibilidade
de moléculas complementares marcadas (sondas), estas competirão com as fitas de DNA
cromossômico e poderão ser hibridizadas ao DNA alvo, ao invés da fita complementar
original, e detectadas seletivamente.
SONDAS
As sondas são sequências de nucleotídeos complementares desenvolvidas a partir de segmentos
conhecidos do DNA ou RNA que se deseja identificar, ligados a um marcador fluorescente ou
radioativo, que por sua vez vai detectar anomalias cromossômicas que estão além do poder de
resolução da citogenética de rotina.

Principais tipos de sondas de DNA utilizadas na técnica de FISH:

 Sondas de sequência de DNA repetitivo;
 Sondas de cromossomos inteiros (WCP – whole chromosome painting);
 Sondas de sequência única.
A técnica é realizada em aproximadamente sete etapas:

a) Preparação da sonda:
 Método direto: ligação com fluorocromo;
 Método indireto: moléculas sinalizadoras conjugam-se
com outra molécula ligada ao fluorocromo.

b) Preparação das lâminas:

 Descoloração
 Fixação
 Desidratação
 Secagem

c) Desnaturação da sonda

d) Desnaturação do DNA cromossomal:

 Em altas temperaturas ou pH extremos o DNA sofre
desnaturação. Ou seja, as duas fitas de DNA se
separam.
e) Hibridização in situ:
 Quando a renaturação ocorre, as duas fitas de DNA
espontaneamente se enrolam formando novamente o
DNA dupla fita, agora com a marcação da sonda.

f) Detecção da sonda

g) Visualização:
 É realizada no microscópio de fluorescência com
conjuntos de filtros adequados. A detecção dos sinais
fluorescentes indica a presença do DNA
complementar, e sua ausência indica a ausência de
DNA complementar
APLICAÇÕES TÉCNICAS
 Doenças cromossômicas;
 Diagnóstico pré-natal;
 Reconhecimento de doenças virais;
 Monitoramento pós-transplante;
 Diagnósticos de leucemias;
 Diagnósticos de doenças neuronais, como Alzheimer precoce;
 Análise de diversas síndromes;
 Pesquisa;

VANTAGENS
 Técnica rápida;
 Alta eficácia de hibridização e detecção;
 Sensibilidade e especificidade elevadas;
 Permite correlação direta dos aspectos citogenéticos e morfológicos, possibilitando a
diferenciação entre condições malignas e benignas em casos duvidosos;
LIMITAÇÕES TÉCNICAS
 Restrita às anormalidades que possuem sondas disponíveis;
 Apenas uma ou poucas anormalidades podem ser acessadas simultaneamente;
 Os dados citogenéticos podem ser obtidos apenas para cromossomas- alvo; portanto não é um
método de “screening”;
 Altamente sensitivo para ganhos, mas menos sensitivo para detecção de perda cromossômica ou
deleção;
 Requer microscopia de fluorescência e um sistema de análise de imagem;