Biologia Molecular e Métodos analíticos

Doutoranda Elizandra B. Buzanello

Artigo
 Introdução
DSBs (danos)

Instabilidade
Formação genômica
de tumores
Rearranjos cromossômicos

Fonte: www.icr.org/mutation-buildup; www.hemocentro.fmrp.usp.br.html

 Ciclo
Celular

DNA-PKcs são recrutadas

DNA-PKcs é ativada pela formação

do complexo → autofosforilação

Extremidades são processadas

Complexo formado Ku, ligase,

DNA-PKcs e DNA polimerase,
alinham, unem e ligam as
extremidades → molécula de DNA.

Fonte: www.teses.usp.br
 Fases S
e G2
(ativa)

Proteínas → reconhecimento e o intercâmbio entre as

DSB para
fitas é areconhecida
junção entre apor proteínas
cromátide (ATM,
lesada MRN eintacta.
e a cromátide CtIP) →
processamento das fitas quebradas resultando em ssDNA associados
Polimerases e ligases que preenchem essas quebras restaurando
à proteína RPA.
a molécula.

Fonte: www.teses.usp.br
 Introdução

RPA foci, Rad51 foci ou detecção de

BrdU → ssDNA.

Protocolo de imunofluorescência e
anticorpo (não comprimento da
ressecção).

Fonte: Gospodinov et al. (2009); www.lifelength.com/ptg/importance-of-telomeres.html

 Objetivos

Ensaio → qPCR
(medir diretamente os intermediários).

Em contraste analisam ssDNA gerado

(detectar indiretamente).

Determinar o comprimento da
ressecção → sítio DSB específico
(novo ensaio).
 Ressecção de DSBs demonstrada por ser eficiente nas fases S e G2
do ciclo celular → limitado na fase G1.

 Níveis mensuráveis de ressecção → culturas predominantemente em

fase G1.

 Sugerindo que o processamento de DNA final em ssDNA ocorre em

células na fase G1, embora de forma menos eficiente.

 Enzimas MRN, Exo1, CtIP, SOSS1 → agindo diretamente no nível do

processamento final e valida este método (estudos anteriores).
 Metodologia

Empacotamento do retrovírus ER-AsiSI

 ER-AsiSI U2OS

 ER-AsiSI 293T

 Células controle

Fonte: www.ufrgs.br/labvir.pdf
 Metodologia

Empacotamento do retrovírus ER-AsiSI

Retrovírus ER-AsiSI U2OS

siRNA
(Lipofectamine 2000)

Fonte: www.snipview.com/q/Lipofectamine
 Metodologia

RNA de interferência

siControl: AAUUCUCCGAACGUGUCACGUdTdT;

siCtIP: GCUAAAACAGGAACGAAUCdTdT;

siMre11: ACAGGAGAAGAGAUCAACUdTdT;

siSOSS-A:CGUGAUGGCAUGAAUAUUGdTdT;

siExo1: UAGUGUUUCAGGAUCAACAUCAUCUdTdT;

siDNA-PKcs: CUUUAUGGUGGCCAUGGAGdTdT;

siBRCA1: GGAACCUGUCTCCACAAAGdTdT;

si53BP1: GGACUCCAGUGUUGUCAUUdTdT.
 Metodologia

Empacotamento do retrovírus ER-AsiSI

Retrovírus ER-AsiSI 293T

Células divididas (placas) → 24 h

1°

Vetor co-transfectado
2° Filtrado

3° Sobrenadante, aliquotado
pCS2-mGP pMD2G e armazenado a -80°C.

Fonte: www.ufrgs.br/labvir.pdf
 Metodologia

Cultura celular, transfecção e sorção

Retrovírus ER-AsiSI U2OS

qPCR Citometria
de fluxo

WT (wild type)célula ER-AsiSI 293T

Transfecção

Purificação G1 e S/G2/M

Fonte: http://www.clontech.com/US/Products/Fluorescent
 Metodologia

Extração do DNA genômico

Suspensão celular
50 µL
ER-AsiSI U2OS

ER-AsiSI 293T
bola de agar
gDNA solidificado

1 mL tampão de ESP →
lavada e eluída 1 mL fosfato.

Fundida a 70°C (10 min) e tampão

da enzima de restrição;
4°C para uso futuro.

Fonte: www.bio-rad.com/en-us/product/singleshot-cell-lysis-rt-qpcr-kits
 Metodologia

Reagentes, anticorpos e Western blotting

Membrana PVDF

Digitalizadas usando scanner Licor Odyssey.

Fonte: https://scykness.wordpress.com/western-blot; www.mscience.com/licor-biosciences

 Metodologia

Anticorpos para Western blotting

PARP-1 (Genetex)
CtIP (Active Motif)
Mre11 (Genetex)
SSB1 (Bethyl)
Exo1 (Genetex)
BRCA1 (Santa Cruz)
53BP1 (Cell Signaling)
DNA-PKcs (Abcam)
HA Tag (Bethyl)
phospho-(Ser) CDKs substrate (Cell Signaling)
Ku86 (Santa Cruz)
RPA (Genetex) e RAD51 (custom)
 Metodologia

Imunodetecção
1° Fixadas → formaldeído 4% por 20 min;
Para avaliar a técnica de coloração RPA foci e Rad51 foci → etapa
2° Permeabilizaram com metanol por 5 min;
foi realizada após permeabilização em metanol.
 3° Bloqueadas → 8% de BSA por 1 h;
4° Anticorpos primários por 1 h.
Anticorpos secundários
(donkey anti-rabbit lgG e donkey anti-mouse lgG) por 30 min;

Células

Fonte: diagnosticolaboratorial.com
 Metodologia

Imunoprecipitação da cromatina (ChIP)

Identificar sequências
200 µg de cromatina específicas de DNA ligadas a proteínas de
→ imunoprecipitada
interesse.
(2 µg de anticorpo phospho-DNA-PKcs S2056 ou sem anticorpo).

Fonte: Liu, et al. (2006); http://www.lookfordiagnosis.com/mesh_info.php

 Resultados

Pares de primers para 'DSB1' e

Desenho de primers e sondas qPCR
'DSB2' (entre os locais de restrição
para a medição do DSB% em dois
BsrGI e BamHI, respectivamente.
locaisSistema:
AsiSI e retrovírus
medição ER-AsiSI.
de ressecção
em locais adjacentes.
Par de primers para 'No DSB’ é
através de um sítio de restrição
HindIII.
Enzima AsiSI → entrar no núcleo
Os primers no cromossomo 22 ('No DSB ").
e gerar DSBs em sítios específicos.
 Resultados
Células ER-Asisi U2OS

Quando não tem o tratamento

tem menos quebra.

4-Hydroxytamoxifeno
(4-OHT).

Trata com 4-OHT e detecta

esses produtos quebrados.
 Resultados

Método: aumento no ssDNA% com

4-OHT foi observado em ambos
sítios DSB; não no local onde falta
uma sequência.

Porcentagem de DNA clivado nos DSB1 e DSB2 foi de 21,0 e 8,8%,

depois de 4 h de 4-OHT.

Considerando-se os níveis de ssDNA gerado em ~ 350 nuc a partir de

DSB1 e DSB2 são ~ 4 e 2%, conclui-se que ~ 20-26% de extremidades do
DNA são realmente sujeitas a ressecção para uma extensão de 350 nt.

Mais ssDNA → observada em sítios próximos de DSBs e a extensão da

ressecção foi 3500 nuc; níveis elevados de ressecção após o mais longo
de 4-OHT.
 Resultados
ER-AsiSI U2OS

Testar
Sendo oassim
Tratamentoensaio
Mimitou comdeCDKi
ressecção
constatou-se
and Symington →
aumentou
que ainibidor de CDK
ligeiramente
ressecção
(2009): de a
ressecção chamado
DSBs
do DSB éroscovitina
percentagem
é mais (CDKi).
de células
eficiente
dependente em
do
na fase
fasescicloG1.
S/G2celular
eficiência dado ciclo
→ fases
ressecçãocelular.
foiSreduzida
e G2 devido a um requerimento
em roscovitina por atividade
→ dose-dependente.
CDK.
 Resultados
ER-AsiSI 293T

Células:
Populações
Citometria:
expressam
de
coloração
célulasde
a G1
PI
proteína
→eram
determinar
menores
fluorescente
a porcentagem
em tamanho
Red emforam
do
G1, que
Squase
e G2.
as
exclusivamente
populações de nacélulas
fase G1,S/G2/M,
enquantoconfirmando
as Green foram
ainda
predominantemente
a precisão da
nas
separação
fases S/G2/M.
de células (FUCCI).
 Resultados

Elevados
Baixos
ssDNA% níveis
de ressecção
em ainda foram
DSB1 →observados
e DSB2 observados
foi medido emem
→G1
células
→ Red
G1 processamento
nae fase S/G2/M
final em
S/G2/M-Green, ée
ineficiente
comparação
comparadoecom resulta
comasa células
cultura
em menores
não triadas.
triada,
ressecção
e ressecção
em células
foi diminuída
G1, em comparação
em células
com→S consistente:
G1 ou G2. efeitos de roscovitina.
 Resultados

Consistente:
Células ER-AsiSI
Complexo de verificou-se
ligaçãoU2OS transfectadas
SOSS1quessDNA
a depleção
→ com siRNA
do complexo
importante controle
para SOSS1(siRNA
ou siRNAs →
a ressecção
dirigido
genes
em envolvidos
contra
células subunidade
humanas noereparo do
SOSS-A)
DNA.a ressecção
por promover levou a ressecção
mediada porreduzida em
Exo1 in vitro.
Ressecção dramaticamente diminuída no bloqueio de CtIP ou Mre11.
células U2OS, assim como a depleção de Exo1 (principais exonucleases
envolvidas na ressecção da extremidade DSB).
 Resultados

Depleção proteína
de BRCA153BP1
nãoresulta
mostrouemefeito
aumento
significativo
da ressecção
na ressecção em
Depleção: resultou num aumento dos níveis de RPA foci e Rad51 foci.
DSB1 ou anteriores).
(estudos DSB2.
 Resultados

Depleção
Expressão:
Sistema parcial
Ku86
ER-AsiSI de Ku
→→ formação
e HA-ER-Asisi
U2OS resolver → de ssDNA
western
depleção em células
blotting
de Ku86 U2OS.na NHEJ).
(fator central
(anticorpos anti-Ku86 e anti-HA; PARP-1 como controle).
 Resultados

Depleção DNA-PKcs
DNA-PKcs se liga a DSBs
diminuiu
→ heterodímero
proteína ATMKu
(necessária
e é um importante
para a ressecção).
fator
de NHEJ clássico.
 Conclusões

 Método → níveis de ssDNA quantitativamente em células de mamíferos

e demonstraram a validade desse método.

 Medição direta de DSBs tem vantagens → métodos indiretos (foci);

limitado pela necessidade de sequência específica do sítio de corte.

 Outros métodos RPA ChIP utilizados → abordar a necessidade de

ensaios de ressecção aleatórios ou sítios de danos no DNA
desconhecidos no genoma de mamífero.

 Combinação → medir quantitativamente ssDNA em sítios inacessíveis

e avaliar a eficiência da ressecção em resposta a diferentes tipos de
danos no DNA.
Muito obrigada!