Universidade Federal Rural do Semi-Árido

Disciplina: Biotecnologia Vegetal

RFLP

Profª. Ioná S. Araújo

 As variações nos nucleotídeos do DNA devido a
mutação, deleção, inserção e inversão, podem ser
detectadas se ocorrerem num sítio de corte das
enzimas de restrição.

 Se o DNA diferindo num ou vários desses

nucleotídeos forem expostos à essas enzimas,
fragmentos de diferentes tamanhos, portanto
polimórficos, são gerados e podem ser identificados
e clonados.
 Tais fragmentos são denominados de RFLPs
('Restriction Fragment Length Polymorphims';
fragmentos polimórficos de DNA) e foram
desenvolvidos por Botstein et al. (1980).

 Os polimorfismos de comprimento de
fragmentos de restrição ou polimorfismo de
tamanho de fragmento são locos no DNA que
podem ser identificados e mapeados.
•Base genética

*A base genética do polimorfismo observado resulta de mutações nos sítios de

restrição ou de inserções, deleções e rearranjos entre estes sítios.

RFLP: Polimorfismo no tamanho de Fragmento de Restrição

1 DNA 1 2 3 4 5
2
DNA
3
4 DNA
5
DNA

DNA

Sítio de restrição
*Os fragmentos de DNA podem, então, ser separados segundo seu
comprimento por eletroforese em gel de agarose.

*Os fragmentos separados, são transferidos para um suporte sólido

(membrana de nitrocelulose) e hibridizados com sondas, que são fragmentos
de DNA de seqüência única marcados por radioatividade.

*O fragmento de DNA que se hibridizar com a sonda pode, então, ser

visualizado na auto-radiografia e revelado como uma banda no filme.
 RFLP: Análise de DNA
Digestion Restriction

Apply to
Gel
DNA Electrophoresis
Fragments

Southern
Fragmentos de DNA na Blotting
Membrana

Fragmentos Autoradiografia
Hibridizados
*Vantagens
-Codominância
-Cobrem todo o genoma do organismo,
-Aumenta, portanto, a probabilidade de se encontrar associações
significativas entre marcadores e genes.
-O número de marcadores RFLP é praticamente ilimitado

*Marcadores baseados em DNA tem alta estabilidade,

podendo ser extraído e conservado e reutilizadospor longos
períodos de tempo.
*Desvantagens
-Requerer grande quantidade de DNA relativamente puro,
-Sondas específicas de DNA
-Marcação por radioatividade no sistema de detecção.
*Inexistência de uma biblioteca de sondas disponível, ou seja
somente depois da obtenção das sondas adequadas , possível iniciar
qualquer tipo de análise genética.

*O uso de RFLP requer pessoal técnico especializado na manipulação

de DNA recombinante, e no caso do uso de 32P, instalações adequadas
ao manuseio de material radioativo.
APLICAÇÕES DOS MARCADORES RFLP

-Análise forense para testar se uma amostra

do tecido obtida em uma cena de crime
(sangue, pele, esperma, etc..) poderia ter
vindo do suspeito.
 Outras Aplicações de marcadores RFLP
*Os RFLPs ainda têm outras utilidades como:

A identificação de germoplasma,

A identificação de variedades,

O controle de qualidade na produção de sementes

híbridas,

A caracterização genética de populações,

O monitoramento nos retrocruzamentos e auxílio na

identificação e clonagem de genes,