Anlise do polimorfismo dos fragmentos de restrio do DNA genmico (RFLP'S)

DOGMA CENTRAL DA BIOLOGIA MOLECULAR

ENZIMAS DE RESTRIO

As enzimas de restrio ou tambm denominadas de endonucleases de restrio, so as ferramentas bsicas da engenharia gentica, desempenhando funo de clivagem (corte) da molcula de DNA em pontos especficos, em reconhecimento a determinadas seqncias de nucleotdeos.

Endonuclease de restrio ou enzima de restrio(ER) Endo = dentro Nuclease = quebra

Cliva ou corta cidos nuclicos (DNA)

Enzimas que catalisam a clivagem de ligaes fosfato dentro da molcula de DNA.

Foram descobertas em clulas bacterianas

Mecanismo de defesa contra DNA exgeno.

Hoje em dia, a biologia molecular utiliza centenas de endonucleases capazes de seccionar o duplo filamento polinucleotdico da molcula de DNA em lugares determinados.

Algumas enzimas restritivas com indicao da sequncia de reconhecimento de bases nitrogenadas e o ponto de corte.
Enzima Bam HI Eco RI Hind III Seqncia de corte no DNA G GATC C C CTCG G G AATT C C TTAA G A AGCT T T TCGA A

Stio normalmente uma palndromo

Socorram-me, subi no nibus em Marrocos 5'-GAATTC-3' 3'-CTTAAG-5' Sitio de ligao da EcoRI

Nomenclatura das Enzimas de Restrio

Primeira letra maiscula = gnero Segunda e terceira letras = espcie Letra adicional = cepa da bactria se no for tipo selvagem Nmero em algarismo romano = nmero da enzima descoberta

Ex.: a enzima EcoRI foi descoberta em Escherichia coli, cpa RY13, e foi a primeira enzima de restrio identificada naquela espcie.

RFLP (Restriction Fragment Length Polymorfism)

Polimorfismo de tamanho devido as diferenas nos stios para enzimas de restrio.

Por RFLP entende-se, em uma traduo livre do termo, o polimorfismo no comprimento de fragmentos obtidos por corte da fita dupla de DNA.

Tal polimorfismo evidenciado pela fragmentao do DNA atravs do uso de enzimas de restrio e observado por hibridizao destes fragmentos com sequncias homlogas de DNA marcadas com radioatividade ou compostos que desencadeiam uma reao de luminescncia.

Para que polimorfismo seja detectado, necessrio que as sequncias de nucleotdeos nas fitas de DNA de dois ou mais indivduos comparados sejam distintas.

O polimorfismo observado na tcnica de RFLP ocorre porque o DNA de indivduos geneticamente distintos difere na seqncia de nucleotdeos ao longo da fita. A presena ou ausncia de seqncias especificas de 4 a 8 pares de bases, reconhecidas e clivadas pelas enzimas de restrio, pode variar entre diferentes indivduos, gerando polimorfismo.

Diferenas na seqncia de DNA dos individuos podem tambm resultar de inseres, delees ou outros rearranjos (translocaes, inverses) que alterem a distncia entre pares de stios de restrio.

Fragmentos de diferentes tamanhos.

A base gentica do polimorfismo observado resulta assim de mutaes nos stios de restries ou de inseres, delees e rearranjos entre estes stios.

COMO OCORRE O RFLP

Extrao de DNA dos indivduos analisados.

Aps a extrao, o DNA dos indivduos tratado com enzimas de restrio, que o corta em um grande numero de pontos (stios de restrio), gerando uma enorme quantidade de fragmentos.

As diferenas na seqncia de DNA dos indivduos resulta na clivagem de fragmentos de tamanhos distintos, que so separados atravs de eletroforese em gel de agarose.

As diferenas nos tamanhos dos fragmentos no podem ser visualizadas diretamente no gel, uma vez que os inmeros fragmentos que resultam do tratamento com enzimas de restrio ao serem separados pela eletrolise produzem o efeito de um arraste continuo no gel.

Para efetuar a deteco dos marcadores RFLP, os fragmentos separados no gel de agarose pela eletroforese so transferidos para uma membrana de nylon (ou nitrocelulose) por capilaridade ou vcuo atravs de um processo denominado Southern Blot. Como a membrana de nylon colocada sobre o gel, a ordem dos fragmentos separados por eletroforese mantida na transferncia.

A seguir, os fragmentos so fixados covalentemente na membrana atravs de alta temperatura em forno a vcuo ou com luz ultra-violeta.

Por fim, a visualizao de fragmentos polimrficos entre os inmeros fragmentos transferidos para a membrana feita atravs da hibridizao de pequenos fragmentos clonados de DNA denominados sondas, com seqncias homologas do DNA imobilizado na membrana.

Assim, somente os fragmentos fixados na membrana que so homlogos ao DNA da sonda sero visualizados entre os milhares de fragmentos resultantes do corte com enzima de restrio.

Aps a hibridizao com as sondas, a membrana exposta a filme de raio X em um processo chamado autoradiografia, revelando bandas que constituem os marcadores RFLP.

RESUMO:

Algumas aplicaes dos macadores RFLP

Taxonomia; mapas de ligao; Estudo das bases genticas de resistncia a patgenos;

Estudos de filogenia;
Patogenicidade; Ecologia; Mutaes; Interao patgeno-hospedeiro.

Obrigado!!

A mente que se abre a uma nova idia jamais voltar ao seu tamanho original.
Albert Einstein