Subscribe to DeepL Pro to translate larger documents.

Visit www.DeepL.com/pro for more information.

anticorpos
Artigo
As partículas semelhantes ao vírus SARS-CoV-2 (VLPs) detectam
especificamente reacções imunitárias humorais numa plataforma
baseada em ELISA
Stefan Hirschberg 1,*, Hannes Bauer 2, Julian Kamhieh-Milz 1,3,4, Frauke Ringel 3, Christoph Harms 5 ,
Omar Kamal Eddin 3, Axel Pruß 1, Katja Hanack 6 e Kai Schulze-Forster 2

1 Charité-Universitätsmedizin Berlin, Corporate Member of Freie Universität Berlin, Humboldt-Universität

zu Berlin, and Berlin Institute of Health, Institute of Transfusion Medicine, 10117 Berlin, Alemanha
2 CellTrend GmbH, 14943 Luckenwalde, Alemanha
3
Wimedko GmbH, 12101 Berlim, Alemanha
4 DHS-Diagnostic HealthCare Solutions GmbH, 13347 Berlim, Alemanha
5
Charité-Universitätsmedizin Berlin, Corporate Member of Freie Universität Berlin, Humboldt-Universität
zu Berlin, and Berlin Institute of Health, Center for Stroke Research Berlin, Department of Experimental
Neurology, 10117 Berlin, Alemanha
6 Departamento de Bioquímica e Biologia, Universidade de Potsdam, 14476 Potsdam, Alemanha
* Correspondência: stefan.hirschberg@charite.de; Tel: +49-(0)-174-6124122

4.0/).

Citação: Hirschberg, S.; Bauer, H.;

Kamhieh-Milz, J.; Ringel, F.; Harms,
C.; Eddin, O.K.; Pruß, A.; Hanack, K.;
Schulze-Forster, K. SARS-CoV-2
Virus-like Particles (VLPs)
Specifically Detect Humoral Immune
Reactions in an ELISA-Based
Platform. Antibodies 2022, 11, 76.
https://doi.o r g / 1 0 . 3 3 9 0 /
antib11040076

Editor Académico: Michael B. Zwick

Recebido: 2 de novembro de 2022

Aceite: 5 de dezembro de 2022
Publicado: 12 de dezembro de 2022

Nota do Editor: O MDPI mantém-se

neutro no que diz respeito a
reivindicações jurisdicionais em
mapas publicados e a f i l i a ç õ e s
institucionais.

Direitos de autor: © 2022 pelos

autores. Licenciado MDPI, Basileia,
Suíça. Este artigo é um artigo de
acesso aberto distribuído sob os
termos e condições da licença
Creative Commons Attribution (CC
BY) (https://
creativecommons.org/licenses/by/

Resumo: A chave para
controlar a pandemia de
SARS-CoV-2 é a avaliação
do estado imunitário da
população. Explorámos a
utilidade das partículas
semelhantes ao vírus SARS-
CoV-2 (VLPs) como
antigénios para detetar
reacções imunitárias
humorais específicas num
ensaio de imunoabsorção
enzimática (ELISA). Para
este efeito, as VLP do
SARS-CoV-2 foram
produzidas a partir de uma
linha celular modificada e
caracterizadas por Western
blot, ELISA e análise de
rastreio de nanopartículas.
Posteriormente, recolhemos
42 amostras de soro de antes
da pandemia (2014), 89
amostras de indivíduos
saudáveis e 38 amostras de
indivíduos vacinados.
Dezassete amostras foram
recolhidas menos de três
semanas após a infeção e
Antibodies 2022, 11, 76. https://doi.org/10.3390/antib11040076
quarenta e quatro amostras mais de três semanas após a infeção. Todas as amostras de soro foram
caracterizadas quanto à sua reatividade com VLPs e com as proteínas N e S do SARS-CoV-2. Por fim,
comparámos o desempenho do ELISA baseado em VLP com um dispositivo de diagnóstico in vitro
(IVD) certificado. No conjunto de amostras aplicado, determinámos uma sensibilidade de 95,5% e
uma especificidade de 100% para o IVD certificado. Houve sete amostras com um resultado incerto. O
nosso VLP-ELISA demonstrou um desempenho superior, com uma sensibilidade de 97,5%, uma
especificidade de 100% e apenas três resultados incertos. Este resultado justifica mais investigação
para desenvolver um IVD certificado baseado nas VLPs do SARS-CoV-2 como antigénio.
Palavras-chave: partícula semelhante ao vírus (VLP); SARS-CoV-2; dispositivo de diagnóstico in vitro
(IVD); ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA); reação imunitária; anticorpos
1. Introdução
Os primeiros casos de uma nova doença pulmonar foram registados na província de
Wuhan, na China, em 2019. O coronavírus 2 da síndrome respiratória aguda grave
(SARS-CoV-2) causou a doença COVID-19 e a atual pandemia [1,2]. Embora a maioria
das pessoas infectadas desenvolva apenas sintomas ligeiros semelhantes aos da gripe ou
seja assintomática, a doença COVID-19 representa um risco grave de hospitalização ou
morte para os indivíduos susceptíveis [3,4]. Até agora, as medidas mais utilizadas para
conter a propagação do vírus têm-se centrado na deteção direta do vírus através da reação
em cadeia da polimerase (PCR) ou de métodos baseados em antigénios e num regime de
quarentena rigoroso. Com uma diminuição global do número de casos graves e uma
redução do número de testes utilizados para rastrear indivíduos contagiosos, a
determinação serológica do estado imunitário tornar-se-á mais importante na
determinação do risco para um indivíduo ou uma população.
O SARS-CoV-2 é constituído por quatro proteínas estruturais principais. A
glicoproteína spike (S) medeia a internalização e contém um domínio de ligação ao
recetor de alta afinidade (RBD)
https://www.mdpi.com/journal/antibodies
Anticorpos 2022, 11, 76 2 de 15

para a enzima de conversão da angiotensina 2 humana. A nucleoproteína (N) está

envolvida no empacotamento do genoma. A estrutura vesicular viral é formada pelas
proteínas da membrana (M) e do envelope (E) [5,6]. A expressão simultânea das proteínas
estruturais do SARS-CoV-2 leva à montagem espontânea de partículas semelhantes a vírus
(VLPs) [7,8]. As VLPs são estruturas multiproteicas que se assemelham a certos vírus na
sua composição molecular e forma. Sem material genético, estas partículas não são
infecciosas e, por conseguinte, são seguras d e manusear.
Nos EUA, 77 testes baseados em serologia têm uma Autorização de Utilização de
Emergência ativa da Food and Drug Administration (última atualização em 30 de março
de 2022). A grande maioria destes testes mede apenas os anticorpos contra a proteína
spike ou o RBD. Apenas 13 testes contêm péptidos ou a nucleoproteína recombinante de
comprimento total. Foi proposto que a apresentação de péptidos de mais do que uma
proteína aumenta a sensibilidade dos testes serológicos [9]. No entanto, existem apenas
nove testes autorizados pela FDA que contêm péptidos de duas proteínas (N e S) e
apenas um teste que contém quaisquer péptidos das proteínas M, N e S. Embora seja
bastante comum para outras doenças virais [10-14], tanto q u a n t o sabemos, não existe nenhum
teste serológico que utilize VLPs como antigénios para detetar anticorpos contra o SARS-CoV-2.
Durante esta pandemia, as VLPs do SARS-CoV-2 foram desenvolvidas principalmente
como can didatos de vacinas [15-18] ou como ferramentas de investigação para
monitorizar a entrada do vírus em células susceptíveis [19-22]. Surpreendentemente, as
VLP do SARS-CoV-2 têm atraído muito pouca atenção no domínio do diagnóstico.
Neste estudo de prova de princípio, caracterizámos a reatividade das VLPs do SARS-
CoV-2 contendo as quatro proteínas principais com soro de uma coorte de 230
indivíduos. Verificámos que a elevada sensibilidade e especificidade, bem como o
desempenho superior do ELISA baseado em VLP em comparação com um IVD certificado,
validam a utilidade das VLPs do SARS-CoV-2 como antigénios
para detetar reacções imunitárias específicas no soro humano.

2. Materiais e métodos
Recolha de soro e declaração de ética: As amostras de soro foram obtidas de
diferentes fontes, tais como doentes de uma clínica privada de internamento e
ambulatório (MeoClinic, Berlim), o ambulatório de um médico (Dr. Omar Kamal-
Eddin), de membros do laboratório e familiares, bem como, em parte, devido ao serviço
da Diagnostic HealthCare Solutions GmbH. A aprovação ética foi obtida pelo comité de
análise ética da Charité-Universitätsmedizin Berlin (EA1/304/21) e todos os
participantes deram o seu consentimento escrito para participar neste estudo. O sangue
foi processado no mesmo dia da colheita por centrifugação a 4500× g durante 10
minutos a 4 ◦C. As amostras de soro foram armazenadas a -20 ◦C para armazenamento a
curto prazo e a
-80 ◦C para armazenamento a longo prazo.
Cultura de células Expi293: O Expi293™ Expression System Kit, composto pela
linha celular adaptada de suspensão Expi293, pelos reagentes de transfecção Expi293 e
pelo meio de cultura Expi293, foi adquirido à Thermo Fisher Scientific. A cultura e a
transfecção das células Expi293 foram efectuadas principalmente de acordo com as
instruções do fabricante. As células foram semeadas a uma densidade entre 0,3 × 106 e
0,5 × 106 células/mL e subcultivadas a uma concentração de 3 × 106 a 5 × 106 células
viáveis/mL após 3-5 dias. O diâmetro das células, a percentagem de células viáveis
(vitalidade) e a concentração de células viáveis foram medidos por rotina utilizando o
LUNA Cell Counter (Logos Biosystems, Anyang, Coreia do Sul).
Geração de VLPs SARS-CoV-2: As partículas semelhantes a vírus foram produzidas
a partir de duas linhas de células adaptadas à suspensão Expi293 genéticamente
modificadas. As células foram cultivadas a 37 ◦C, 8% CO2 com 130-150 rpm num
agitador de plataforma Rotamax120 (Heidolph Instruments GmbH & Co. KG,
Schwabach, Alemanha) em meio Expi293 contendo uma concentração final de 100
unidades/mL de penicilina e 100 µg/mL de estreptomicina. A linha celular 1
(Expi_MEN) contém os genes M- (Gen Bank: QHD43419.1), E- (Gen Bank:
QHD43418.1) e N- (Gen Bank: QHD43423.2) humanos optimizados em termos de
códons, integrados de forma estável no genoma. A linha celular 2 (Expi_SMEN) contém
Anticorpos 2022, 11, 76 3 de 15

adicionalmente o gene S (Gen Bank: QHD43416.1), incluindo a mutação D614G e as

substituições R683A e R685A, para tornar o local de clivagem da furina (FKO) não
funcional, integrado de forma estável no genoma. A indução da produção de VLP é
controlada pelo promotor do elemento responsivo à tetraciclina (TRE) [23] e pode ser
Anticorpos 2022, 11, 76 4 de 15

activadas pela tetraciclina ou seus análogos (por exemplo, doxiciclina) [24,25]. A

produção de VLP foi induzida pela adição de doxiciclina-hiclato (Sigma-Aldrich,
Taufkirchen, Alemanha) a uma concentração de 1 µg/mL. Cerca de 96-120 h após a
indução, quando a vitalidade da cultura de células era tipicamente de 40-60%, os
sobrenadantes foram colhidos. Subsequentemente, os sobrenadantes da cultura de células
foram limpos por centrifugação a 2000 × g durante 10 min, seguida de filtração com um
Minisart NML de 1,2 µm (Sartorius Stedim Biotech GmbH, Göttingen, Alemanha),
seguido de um filtro de seringa Millex Low Binding Durapore (PVDF) de 0,45 µm (Merk
Millipore Ltd., Tullagreen, Irlanda). Os sobrenadantes clarificados da cultura de células
foram continuamente diafiltrados com quatro vezes o volume inicial de PBS (pH 7,2) a
uma pressão constante de 0,124-0,165 kPa e 135 rpm, utilizando um sistema de filtração
de fluxo tangencial Minimat EVO equipado com uma membrana Omega com um corte
de 300 kDa (Pall Corporation, Dreieich, Alemanha). As VLP foram precipitadas a partir
do retentado diafiltrado através da adição de PEG-it Virus Precipitation Solution (System
Biosciences, Palo Alto, CA, EUA) numa proporção de 1:10. Os sobrenadantes foram
incubados a 4 ◦C num agitador rotativo durante 24-48 h antes da precipitação a 1500× g
durante 30 min. O sobrenadante foi removido e o pellet contendo VLP foi ressuspendido
com PBS estéril (pH 7,2) e armazenado a -80 ◦C até ser utilizado.
Microscopia eletrónica: As células produtoras de VLP foram fixadas com glutaraldeído a
2,5% (Serva, Heidelberg, Alemanha) em tampão cacodilato de sódio 0,1 M (Serva, Heidelberg,
Alemanha) durante 30 min e pós-fixadas com tetróxido de ósmio a 1% (Science Services,
München, Alemanha) e ferrocianeto de potássio II a 0,8% (Merck, Darmadt, Alemanha)
em tampão cacodilato 0,1 M durante 1,5 h. As amostras embebidas em agarose foram
desidratadas em água e em água.8% de ferrocianeto de potássio II (Merck, Darmstadt,
Alemanha) em tampão cacodilato 0,1 M durante 1,5 h. As amostras embebidas em
agarose foram desidratadas numa série graduada de etanol e embebidas em resina Epon
(Serva, Heidelberg, Alemanha). Finalmente, secções ultrafinas das amostras (70 nm)
foram coradas com acetato de uranilo a 4% e citrato de chumbo Reynolds [26] (Merck).
Para a aquisição de imagens, foi utilizado um microscópio eletrónico Zeiss EM 906 com
uma tensão de aceleração de 80 kV (Carl Zeiss, Oberkochen, Alemanha), equipado com
uma câmara CCD 2K de varrimento lento (TRS, Moorenweis, Alemanha).
Análise de rastreio de nanopartículas (NTA): A NTA foi aplicada para medir o
tamanho e a concentração de VLPs em diferentes preparações, de acordo com o nosso
protocolo anterior [27]. As medições de NTA foram efectuadas utilizando um
instrumento NanoSight LM10 (NanoSight, Ames- bury, UK) que consiste num microscópio
ótico convencional, uma câmara sCMOS de alta sensibilidade e uma unidade LM10 equipada
com um módulo laser de 488 nm. As amostras foram injectadas na unidade LM através da
bomba de seringa nanosight a um caudal constante de 50 µL/min, utilizando uma seringa
estéril de 1 ml. As diluições de amostras de 1:2000 a 1:5000 resultam normalmente numa
concentração efectiva de partículas adequada para análise com NTA (1,0 × 108 a 2,5 × 109
partículas/mL). As definições de captação (obturador e ganho) e de análise foram
ajustadas manualmente e mantidas constantes entre todas as amostras registadas no mesmo
dia. O software NTA (NTA 3.2 Dev Build 3.2.16) foi utilizado para captar três vídeos de
30 s cada para analisar os dados de seguimento das nanopartículas de cada amostra.
ELISA (Enzyme-linked Immunosorbent Assay): O protocolo foi comparável ao do
nosso estudo anterior [27]. A proteína S (Sino Biological Inc., Pequim, China, # 40689-
V08B), a proteína N (carga 2020/20,7/2, 0,4 mg/mL de stock, new/era/mabs GmbH,
Potsdam, Alemanha) ou as VLPs do SARS-CoV-2 foram imobilizadas como antigénios
em placas de microtitulação de 96 poços Nunc Polysorb em 100 µL de tampão de
carbonato por poço durante a noite a 4 ◦C. Os locais de ligação livres foram
bloqueadas com 250 µL por alvéolo de PBS contendo 1% de albumina de soro bovino
(BSA) para
45 min à temperatura ambiente (RT). Após lavagem com PBS, os anticorpos
monoclonais de coelho contra a spike- (1:2000, 40689-V08B, Sino Biological Inc., Pequim,
China) e a nucleoproteína (1:5000, 40143-R019, Sino Biological Inc., Pequim, China) ou o
soro humano (1:50-1:100) foram incubados com o antigénio imobilizado em 100 µL de
PBS contendo 0,05% de Tween, Pequim, China, Pequim, China) ou soro humano (1:50-
1:100) foram incubados com o antigénio imobilizado em 100 µL de PBS contendo
Anticorpos 2022, 11, 76 5 de 15

0,05% de Tween20 (PBS-T) e 1% de BSA à temperatura ambiente durante 1 h. Foi

escolhido um tampão contendo detergente para facilitar o acesso dos anticorpos aos
epítopos no interior do lúmen das VLP. Após a lavagem, as placas foram incubadas à
temperatura ambiente com um anticorpo anti-coelho de cabra ou IgG anti-humano de cabra
conjugado com peroxidase de rábano (HRP) (Dianova GmbH, Hamburgo, Alemanha), diluído
a 1:10 000 em PBS-T com 1% de BSA. As moléculas conjugadas não ligadas foram
removidas por lavagem com PBS. A reação colorimétrica utilizando 100 µL de
tetrametilbenzidina (TMB, Carl Roth GmbH,
Anticorpos 2022, 11, 76 6 de 15

Karlsruhe, Alemanha) como substrato foi interrompido com 100 µL de 0,125 M H2 SO4
por poço após 10-30 min. A absorvância foi imediatamente medida com um leitor de
microplacas Epoch a λ = 450 nm e subtraída pela absorvância do comprimento de onda
de referência a λ = 620 nm. Para a aproximação quantitativa das concentrações das
proteínas N e S nas amostras de VLP, tomou-se como referência a gama linear de uma
série de diluições de 2 log (triplicado) das respectivas proteínas.
Western blot: As amostras foram preparadas de acordo com o Guia Técnico NuPAGE
da In- vitrogen. Após a desnaturação em tampão de amostra NuPAGE LDS com DTT 50 mM
durante 10 min a 70 ◦C, as amostras e os marcadores foram colocados num gel de gradiente
bis-tris Novex (4-12%, Thermo Fischer Scientific) utilizando o tampão de corrida NuPAGE
MOPS SDS e subsequentemente colocados numa membrana de nitrocelulose Novex 0,45 µm
(LC2001, Thermo Fischer Scientific). As membranas foram bloqueadas durante 1 h em PBS
contendo 1% de BSA, e subsequentemente incubadas com um anticorpo primário anti-
nucleoproteína de coelho (1:5000, 40143-R019, Sino Biological Inc, Beijing, China) ou soro
humano em PBS contendo 1% de BSA e 0,2% de PBS-T a 4 ◦C durante a noite num agitador.
O soro humano de um indivíduo duplamente vacinado (AstraZeneca) foi utilizado para
detetar apenas a proteína S ou a proteína S e a proteína N, respetivamente. Foram
confirmados níveis elevados de IgGs anti-S nos respectivos soros humanos por ELISA. Os
anticorpos secundários anti-humano ou anti-coelho de cabra acoplados a HRP (Dianova
GmbH, Hamburgo, Alemanha) foram incubados a uma diluição de 1:10.000 em PBS-T
durante 3 h à temperatura ambiente. As proteínas foram detectadas por quimioluminescência
utilizando os respectivos kits da Biozym Scientific GmbH (Hessisch Oldendorf,
A l e m a n h a ) e submetidas a análise de imagem com ImageJ [28].
Avaliação dos dados e análise estatística: A análise estatística foi efectuada com o
programa Prism 8 (GraphPad, San Diego, CA, EUA). Valores de p inferiores a 0,05 foram
considerados estatisticamente significativos. As diferenças entre os grupos foram testadas
com ANOVA ou respectivos métodos não paramétricos (teste de Kruskal-Wallis), seguidos
de comparação múltipla (testes de Dunnett ou Dunn). Os níveis de significância foram
marcados com asteriscos, onde * corresponde a p < 0,05,
** p < 0,01, *** p < 0,001 e **** p < 0,0001.

3. Resultados
3.1. Caracterização das VLPs do SARS-CoV-2
As linhas celulares Expi_MEN e Expi_SMEN adaptadas à suspensão foram cultivadas em
200 ml de meio até uma concentração de 3 × 106 células/mL. A produção de proteína lisa
ou de pico contendo VLPs de SARS-CoV-2 foi estimulada com 1 µg/mL de doxiciclina.
A produção de VLPs foi acompanhada pelo declínio da viabilidade celular. Com uma
viabilidade de 40-60%, o sobrenadante da cultura de células foi limpo por centrifugação,
filtrado (0,45 µm) e sujeito a filtração de fluxo tangencial com um corte de 300 kDa.
Subsequentemente, as VLP foram precipitadas com PEG e ressuspensas em PBS estéril.
A montagem bem sucedida de partículas com aspeto de vírus foi ilustrada por
microscopia eletrónica (Figura 1A). Utilizando a análise de rastreio de nanopartículas
(NTA), determinámos um diâmetro de partícula de 125 nm 95% CI [90-178, n = 2854
partículas] para VLP_SMEN e para o VLP_MEN suave de 127 nm 95% CI [87- 186, n =
2866 partículas] (Figura 1B). As VLP_MEN e as VLP_SMEN foram revestidas na fase
sólida de uma placa de microtítulo numa série de diluições de 2 lógicas a partir de 32
µg/mL. Um anticorpo monoclonal detectou, de forma dependente da dose, a proteína N
em VLP_SMEN e em VLP_MEN num teste ELISA (Figura 1C). Este resultado foi
corroborado pela deteção da proteína N com o peso molecular esperado em Western blot.
Como esperado, a proteína S só foi detectada de forma dependente da dose em
VLP_SMEN e estava ausente na VLP_MEN lisa em ELISA e Western blot.
Anticorpos 2022, 11, 76 7 de 15

Figura 1. Caracterização de VLP_SMEN e VLP_MEN. (A) Imagem ilustrativa de microscopia

eletrónica de VLP_SMEN. Barra de escala 100 nm (B) Análise de rastreio de nanopartículas (NTA). (C)
ELISA utilizando anticorpos monoclonais contra a espícula ou a nucleoproteína e Western blot
utilizando um anticorpo monoclonal contra a nucleoproteína e soro humano policlonal de um
indivíduo vacinado.

3.2. Aplicação de VLPs SARS-CoV-2 como antigénios para o diagnóstico sérico

Para validar o desempenho das VLPs como antigénios para detetar reacções imunitárias
específicas ao SARS-CoV-2, recolhemos 230 amostras de soro (Figura 2A). Isso incluiu 17
amostras de soro de pacientes em um ponto inicial (<3 semanas) e 44 amostras de soro
em um ponto de tempo posterior (> 3 semanas) após a infeção por SARS-CoV-2. A
recolha de soro teve lugar entre maio de 2020 e dezembro de 2021. A infeção foi
verificada por PCR ou relatórios/documentos de doentes com um resultado positivo de
PCR obtido noutro local. Também recolhemos soro de 38 indivíduos previamente
vacinados entre março de 2021 e dezembro de 2021. Este grupo não era homogéneo
porque alguns dos doentes vacinados relataram uma infeção anterior com SARS-CoV-2.
Como controlo negativo, foram colhidas 89 amostras de soro de indivíduos saudáveis
sem suspeita de infeção por SARS-CoV-2 em maio de 2020, altura em que também era
improvável uma infeção devido à fase inicial da pandemia. Além disso, obtivemos
amostras de uma coorte de 42 mulheres grávidas que foram recolhidas antes de 2014. Todas as
230 amostras de soro foram analisadas com um ELISA anti-IgG humana interno
utilizando 1 µg/mL de spike- ou nucleoproteína ou 5 µg/mL de VLPs como antigénio
imobilizado numa placa de microtitulação (Figura 2B). A solução de revestimento
VLP_SMEN continha aproximadamente 0,12 µg/mL de proteína S e 0,24 µg/mL de
proteína N, conforme determinado por ELISA quantitativo contra uma diluição de 2-log
da respectiva proteína de referência. O sinal de fundo das amostras de indivíduos
saudáveis e das amostras pré-pandémicas foi geralmente baixo com todos os quatro
antigénios. A ANOVA de uma via revelou uma diferença significativa entre os grupos de
Anticorpos 2022, 11, 76 8 de 15

soro para todos os quatro antigénios

Anticorpos 2022, 11, 76 9 de 15

antigénios. O teste de Tukey para comparação múltipla confirmou que as amostras de

soro em fase tardia apresentavam níveis de IgG anti-proteína S (p = 0,0001, IC 95% = -
0,3646 a -0,1471) e anti-proteína N (p < 0,0001, IC 95% = -0,3969 a -0,1954)
significativamente mais elevados do que as amostras de soro em fase inicial.
Curiosamente, também pudemos confirmar que os níveis de IgG anti-proteína-S são mais
elevados nos indivíduos vacinados do que naqueles com uma infeção anterior (teste de
Tukey: p < 0,0001, 95% C.I. = -0,2815 a -0,1123). Na população vacinada, não encontrámos
qualquer diferença nos níveis de IgG anti-S-proteína e anti-VLP entre os indivíduos
vacinados com ou sem uma infeção anterior por SARS-CoV-2. A infeção anterior foi inferida a
partir de um questionário e pela presença de IgG anti-N. Todas as vacinas incluídas neste
estudo têm como alvo apenas a proteína S do SARS-CoV-2. Utilizando duas vezes a
média da DO de indivíduos saudáveis mais um desvio padrão como ponto de corte, foi
possível distinguir indivíduos previamente infectados daqueles que apenas tinham
recebido a vacina. Isto sugere que a utilização da proteína N irá receber mais atenção
para distinguir as infecções por SARS-CoV-2 dos anticorpos induzidos pela vacina.

Figura 2. Caracterização serológica de 230 amostras. (A) Classificação das amostras. (B) Foi utilizado um
ELISA interno para avaliar a reatividade do soro com as proteínas VLP_SMEN, VLP_MEN, S- e N-.
(C) Correlação entre os valores de DO normalizados das VLPs e das proteínas S e N. * p < 0,05, ** p <
0,01 e **** p < 0,0001.
Anticorpos 2022, 11, 76 10 de 15

Os coeficientes de correlação de Pearson foram calculados para avaliar a relação

linear entre os valores de DO normalizados de VLP_SMEN e a proteína S de todas as
amostras de soro (Figura 2C). Verificou-se uma correlação positiva entre as duas
variáveis, r(228) = 0,95, p < 0,0001. Para os cálculos dos coeficientes de correlação de
Pearson comparando o valor de DO normalizado da proteína N com VLP_SMEN ou
VLP_MEN, foram excluídas as amostras de soro de indivíduos vacinados. Verificou-se uma
correlação positiva entre o valor n o r m a l i z a d o da DO da proteína N com VLP_SMEN, r(190)
= 0,89, p < 0,0001 e VLP_MEN, r(190) = 0,76, p < 0,0001.

3.3. Comparação do desempenho do SARS-CoV-2 VLP-ELISA com um IVD certificado

Por fim, comparámos o VLP-ELISA com o desempenho da N-proteína ou da S-
proteína completa isoladamente e com um IVD com certificação CE (EUROIMMUN, EI 2606-
9601 G, Lübeck, Alemanha) (Figura 3 e Quadro 1). O DIV é um ELISA que utiliza o
domínio S1 da proteína S do SARS-CoV-2 como antigénio. Nos testes VLP-, N- e S-
ELISA, o ponto de corte que define uma amostra "positiva" foi estabelecido como sendo
superior a duas vezes a DO média de indivíduos saudáveis mais um desvio padrão
(2OD+SD). "Negativo" foi definido como inferior a duas vezes a DO média de
indivíduos saudáveis (2OD). A incerteza (UC) foi definida entre os dois pontos de corte.
O IVD e o VLP-ELISA classificaram corretamente todas as amostras pré-pandémicas e
saudáveis como negativas, o que representou uma especificidade de 100% (Figura 3 e
Quadro 1). Registaram-se quatro e três resultados falsos positivos para o S- e N-ELISA,
respetivamente. A especificidade foi de 96,1% para o S-ELISA e de 95,4% para o N-
ELISA. A sensibilidade de diagnóstico para as 44 amostras colhidas mais de três semanas
após a infeção por SARS-CoV-2 foi de 100% para o S-ELISA, 97,5% para o VLP-
ELISA, 95,5% para o IVD certificado e 90,9% para o N-ELISA. Surpreendentemente, o
IVD certificado não identificou nenhuma das amostras que foram colhidas menos de três
semanas após a infeção por SARS-CoV-2, ao passo que o N-ELISA identificou 29,4% e
o VLP-ELISA e o S-ELISA 35,3%. No total, registaram-se sete casos de resultados
incertos para o IVD certificado, enquanto os resultados do VLP-ELISA foram incertos
em apenas três casos. A combinação da baixa taxa de falsos positivos e da elevada
sensibilidade sugere que pode haver vantagens na utilização de VLPs como antigénios
para identificar reacções imunitárias específicas ao SARS-CoV-2 em relação a antigénios
individuais.

Correlação entre o IVD certificado e o VLP-ELISA

12 Incerto_VLP: n = 3

r = 0.93
95% CI [0,91 - 0,95]
10

6
Antes de 2014
Saudável
Infeção precoce
4 Infeção tardia
Vacinados
Não respondentes
Vacinação: n = 3 2
Incerto_IVD: n = 7

0
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2
VLP_SMEN_IgG (DO normalizada 450-620)

Figura 3. Comparação do desempenho do ensaio VLP-ELISA para o SARS-CoV-2 com um DIV

certificado. Correlação dos resultados do VLP-ELISA com um IVD certificado.
Anticorpos 2022, 11, 76 11 de 15

Quadro 1. Comparação do desempenho do VLP-ELISA e de um IVD certificado.

Infeção Infeção
Antes de 2014 Saudável Vacinado
precoce tardia
Não. amostras 42 89 17 44 38
1 E.I.pos 0 0 0 42 32
1 E.I.neg 42 89 17 0 1
1
E.I. UC 0 0 0 2 5
% correto 100.0 100.0 0.0 95.5 84.2
VLP pos 0 0 6 44 35
VLP neg 42 89 9 0 3
VLP UC 0 0 2 1 0
% correto 100.0 100.0 35.3 97.7 92.1
S pos 2 2 6 44 38
S neg 39 87 10 0 0
S UC 1 0 1 0 0
% correto 92.9 97.8 35.3 100.0 100.0
N pos 0 3 5 40 9
N neg 42 83 12 3 28
N UC 0 3 0 1 1
% correto 100.0 93.3 29.4 90.9 23.7
1 EUROIMMUN, EI 2606-9601.

4. Discussão
Este é o primeiro relatório que utiliza partículas semelhantes a vírus num
imunoensaio de fase sólida para detetar anticorpos contra o SARS-CoV-2. Em
contrapartida, as VLP são utilizadas em algumas abordagens de vacinação [18,29].
Conseguimos gerar partículas estáveis (127 nm para a MEN VLP, 125 nm para a SMEN VLP)
com um tamanho esperado semelhante ao do vírus natural (60 a 140 nm, conforme
referido por [2]). A montagem adequada do tipo vírus foi ilustrada por microscopia eletrónica.
As experiências ELISA e Western blot validaram a presença das proteínas N e S. A
presença das proteínas M e E pode estar implícita, uma vez que são essenciais para a
formação de partículas [7,8,30,31].
Teoricamente, existem algumas vantagens em utilizar VLPs em vez de proteínas
isoladas ou isolados de vírus naturais para produzir uma superfície revestida de antigénio
para imunoensaios de fase sólida para detetar anticorpos antivírus: (i) Existe uma maior
probabilidade de os antigénios manterem a sua conformação natural. (ii) Ao utilizar a
terceira dimensão, poderá haver uma maior quantidade de antigénios globais disponíveis.
(iii) Devido à ausência de material genético, as VLP não são infecciosas. (iv) Quando as
VLP contêm todas as proteínas do vírus, podem estar disponíveis alguns epítopos
adicionais. Por conseguinte, um teste ELISA que utilize VLPs pode ser capaz de detetar
mais anticorpos numa amostra de soro, o que resulta numa maior sensibilidade.
Foi desenvolvido um ELISA de diagnóstico semelhante baseado em VLP para a
deteção do papilomavírus humano tipo 16, que é um fator de risco para o cancro do colo
do útero [10,12,32,33]. Os ELISA baseados em VLP são frequentemente utilizados em
medicina veterinária para detetar anticorpos contra d i f e r e n t e s vírus, como o
vírus da doença vesicular do suíno [11], o circovírus suíno tipo 2 [13] ou o Senecavirus A
[14]. Ficámos surpreendidos com o facto de não existir atualmente nenhum ELISA
baseado em VLP para a deteção de anticorpos contra o SARS-CoV-2.
O VLP-ELISA que foi desenvolvido neste estudo teve um desempenho notável. O
pequeno estudo clínico demonstrou claramente que o desempenho do diagnóstico
correspondeu às nossas expectativas: Resultados 100% correctos para amostras
negativas, mas maior sensibilidade para amostras positivas em comparação com um kit
IVD da subunidade S1 da proteína S disponível no mercado com marcação CE (infeção
tardia 97,7% versus 95,5%, vacinados 98,5% versus 84,2%). A sensibilidade na fase inicial
(menos de 3 semanas) da infeção foi notável: 35,3% versus 0,0%. É importante minimizar
o intervalo de diagnóstico entre o momento da infeção e o momento de um teste de
anticorpos positivo. Ao considerar a sensibilidade e a especificidade, o desempenho
global foi melhor quando se utilizaram VLPs como antigénio, em vez de apenas a
Anticorpos 2022, 11, 76 12 de 15

proteína N individual ou a proteína S completa.

Anticorpos 2022, 11, 76 13 de 15

Apresentamos aqui uma prova de conceito para um ELISA baseado em VLP na infeção por
SARS-CoV-2. Os dados clínicos preliminares mostram uma sensibilidade e especificidade
muito elevadas. Estes dados devem ser confirmados por um estudo clínico de maior
dimensão.

Contribuições dos autores: Conceptualização, J.K.-M., K.H., K.S.-F. e S.H.; metodologia, H.B., J.K.-M. e
S.H.; validação, H.B. e S.H.; análise formal, S.H.; investigação, H.B., J.K.-M. e S.H.; recursos,
A.P., C.H., J.K.-M., K.H., K.S.-F., O.K.E. e S.H.; redação - preparação do projeto original, S.H.;
redação - revisão e edição, C.H., F.R., K.H., K .S.-F. e S.H.; visualização, S.H.; supervisão, J.K.-M., K.S.-F.
e S.H.; administração do projeto, A.P., K.H. e S.H.; obtenção de financiamento, J.K.-M., K.H., K.S.-F.,
O . K.E. e S.H. Todos os autores leram e concordaram com a versão publicada do manuscrito.
Financiamento: Os parceiros do projeto Charité (S.H.), Universidade de Potsdam (K.H.), CellTrend GmbH
(K.S.F.) e Wimedko GmbH (O.K.E., J.K.M.) receberam financiamento do Ministério Federal Alemão da
Educação e Investigação (código de projeto BMBF: 03COV01C).
Declaração do Comité de Revisão Institucional: O Comité de Ética da Charité-
Universitätsmedizin Berlin (código de protocolo EA1/304/21; data de aprovação: 3 de outubro de
2021), aprovou o estudo.
Declaração de consentimento informado: Não aplicável.
Declaração de disponibilidade de dados: Todos os dados e métodos relacionados são
apresentados neste documento. Para mais informações, contactar o autor correspondente.
Agradecimentos: Agradecemos ao Core Facility for Electron Microscopy do Charité pelo apoio na
aquisição (e análise) dos dados. Agradecemos a contribuição de Sandra Kamhieh-Milz, Ghada Ben
Amor e Fatemeh Ghazaani.
Conflitos de interesse: Os autores declaram não haver conflito de interesses.
Referências
1. Wu, F.; Zhao, S.; Yu, B.; Chen, Y.M.; Wang, W.; Song, Z.G.; Hu, Y.; Tao, Z.W.; Tian, J.H.; Pei, Y.Y.; et al. Um novo
coronavírus Associado à doença respiratória humana na China. Nature 2020, 579, 265-269. [CrossRef] [PubMed]
2. Zhu, N.; Zhang, D.; Wang, W.; Li, X.; Yang, B.; Song, J.; Zhao, X.; Huang, B.; Shi, W.; Lu, R.; et al. Um novo coronavírus de
Pacientes com pneumonia na China, 2019. N. Engl. J. Med. 2020, 382, 727-733. [CrossRef] [PubMed]
3. Guan, W.; Ni, Z.; Hu, Y.; Liang, W.; Ou, C.; He, J.; Liu, L.; Shan, H.; Lei, C.; Hui, D.S.C.; et al. Características clínicas da doença
do coronavírus 2019 na China. N. Engl. J. Med. 2020, 382, 1708-1720. [CrossRef] [PubMed]
4. Long, Q.X.; Tang, X.J.; Shi, Q.L.; Li, Q.; Deng, H.J.; Yuan, J.; Hu, J.L.; Xu, W.; Zhang, Y.; Lv, F.J.; et al. Clínico e Imunológico
Avaliação de Infecções Assintomáticas por SARS-CoV-2. Nat. Med. 2020, 26, 1200-1204. [CrossRef] [PubMed]
5. Yao, H.; Song, Y.; Chen, Y.; Wu, N.; Xu, J.; Sun, C.; Zhang, J.; Weng, T.; Zhang, Z.; Wu, Z.; et al. Arquitetura molecular do Vírus
SARS-CoV-2. Cell 2020, 183, 730-738.e13. [CrossRef]
6. Kim, D.; Lee, J.Y.; Yang, J.S.; Kim, J.W.; Kim, V.N.; Chang, H. A Arquitetura do Transcriptoma do SARS-CoV-2. Cell 2020, 181,
914-921.e10. [CrossRef]
7. Xu, R.; Shi, M.; Li, J.; Song, P.; Li, N. Construção de partículas semelhantes ao vírus SARS-CoV-2 pelo sistema de expressão de
mamíferos. Front. Bioeng. Biotechnol. 2020, 8, 862. [CrossRef]
8. Swann, H.; Sharma, A.; Preece, B.; Peterson, A.; Eldridge, C.; Belnap, DM; Vershinin, M.; Saffarian, S. Sistema mínimo para
Montagem de partículas semelhantes ao vírus SARS-CoV-2. Sci. Rep. 2020, 10, 21877. [CrossRef]
9. Lagousi, T.; Routsias, J.; Spoulou, V. Desenvolvimento de um ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA) para diagnóstico
preciso e imediato da doença de Coronavírus 2019 (COVID-19) usando a seleção racional de biomarcadores sorológicos.
Diagnósticos 2021, 11, 1970. [CrossRef]
10. Kirnbauer, R.; Hubbert, N.L.; Wheeler, C.M.; Becker, T.M.; Lowy, D.R.; Schiller, J.T. A Virus-like Particle Enzyme-Linked
Immunosorbent Assay Detecta Anticorpos Séricos numa Maioria de Mulheres Infectadas com Papilomavírus Humano Tipo 16. J.
Natl. Cancer Inst. 1994, 86, 494-499. [CrossRef]
11. Ko, Y.J.; Choi, K.S.; Nah, J.J.; Paton, D.J.; Oem, J.K.; Wilsden, G.; Kang, S.Y.; Jo, N.I.; Lee, J.H.; Kim, J.H.; et al. Antigénio de
partículas semelhantes a vírus não infecciosos para deteção de anticorpos contra o vírus da doença vesicular do suíno em suínos
através do ensaio de imunoabsorção enzimática . Clin. Diagn. Lab. Immunol. 2005, 12, 922. [CrossRef] [PubMed]
12. Hernandez, B.Y.; Ton, T.; Shvetsov, Y.B.; Goodman, M.T.; Zhu, X. Human Papillomavirus (HPV) L1 and L1-L2 Virus-like
Particle- Based Multiplex Assays for Measurement of HPV Virion Antibodies. Clin. Vaccine Immunol. 2012, 19, 1348-1352.
[CrossRef] [PubMed]
13. Zhang, Y.; Wang, Z.; Zhan, Y.; Gong, Q.; Yu, W.; Deng, Z.; Wang, A.; Yang, Y.; Wang, N. Generation of E. ColiDerived Virus-like
Particles of Porcine Circovirus Type 2 and Their Use in an Indirect IgG Enzyme-Linked Immunosorbent Assay. Arch. Virol. 2016, 161,
1485-1491. [CrossRef] [PubMed]
Anticorpos 2022, 11, 76 14 de 15

14. Bai, M.; Wang, R.; Sun, S.; Zhang, Y.; Dong, H.; Guo, H. Desenvolvimento e validação de um ELISA competitivo baseado em vírus-like
Partículas do sorotipo Senecavirus A para detetar anticorpos séricos. AMB Express 2021, 11, 7. [CrossRef] [PubMed]
15. Arora, K.; Rastogi, R.; Arora, N.M.; Parashar, D.; Paliwal, J.; Naqvi, A.; Srivastava, A.; Singh, S.K.; Kalyanaraman, S.; Potdar, S.;
et al. Partícula multiantigénica semelhante a um vírus do SARS CoV-2 produzida em Saccharomyces Cerevisiae como candidata a
vacina. bioRxiv 2020. [CrossRef]
16. Ward, B.J.; Gobeil, P.; Séguin, A.; Atkins, J.; Boulay, I.; Charbonneau, P.-Y.; Couture, M.; D'Aoust, M.-A.; Dhaliwall, J.; Finkle,
C.; et al. Ensaio aleatório de fase 1 de uma vacina de partículas semelhantes a vírus derivadas de plantas para COVID-19. Nat. Med.
2021, 27, 1071-1078. [CrossRef]
17. Mohsen, M.O.; Balke, I.; Zinkhan, S.; Zeltina, V.; Liu, X.; Chang, X.; Krenger, P.S.; Plattner, K.; Gharailoo, Z.; Vogt, A.C.S.; et al.
A Scalable and Highly Immunogenic Virus-like Particle-Based Vaccine against SARS-CoV-2. Allergy 2022, 77, 243-257.
[CrossRef]
18. Yilmaz, I.C.; Ipekoglu, E.M.; Bulbul, A.; Turay, N.; Yildirim, M.; Evcili, I.; Yilmaz, N.S.; Guvencli, N.; Aydin, Y.; Gungor, B.; et
al. Desenvolvimento e avaliação pré-clínica da vacina de partículas semelhantes a vírus contra a infeção por COVID-19. Allergy
2022, 77, 258-270. [CrossRef]
19. Plescia, C.B.; David, E.A.; Patra, D.; Sengupta, R.; Amiar, S.; Su, Y.; Stahelin, R.V. SARS-CoV-2 Viral Budding and Entry Can Be
Modeled Using BSL-2 Level Virus-like Particles. J. Biol. Chem. 2021, 296, 100103. [CrossRef]
20. Kumar, B.; Hawkins, G.M.; Kicmal, T.; Qing, E.; Timm, E.; Gallagher, T. Montagem e entrada do Coronavírus 2 da Síndrome
Respiratória Aguda Grave (SARS-CoV2): Avaliação usando partículas semelhantes a vírus. Cells 2021, 10, 853. [CrossRef]
21. Syed, A.M.; Taha, T.Y.; Tabata, T.; Chen, I.P.; Ciling, A.; Khalid, M.M.; Sreekumar, B.; Chen, P.Y.; Hayashi, J.M.; Soczek, K.M.; et
al. Avaliação rápida de variantes evoluídas de SARS-CoV-2 usando partículas semelhantes a vírus. Science 2021, 374, 1626-1632.
[CrossRef]
22. Abdullah, SW; Jaron, M.; Lehky, M.; Zarà, M.; Zaydowicz, CN; Lak, A.; Ballmann, R.; Heine, PA; Wenzel, EV; Schneider,
K.-T.; et al. Produção de partículas semelhantes ao vírus SARS-CoV-2 sem baculovírus em células de insetos para
neutralização rápida Avaliação. Viruses 2022, 14, 2087. [CrossRef]
23. Gossen, M.; Freundlieb, S.; Bender, G.; Müller, G.; Hillen, W.; Bujard, H. Transcriptional Activation by Tetracyclines in
Mammalian Cells. Science 1995, 268, 1766-1769. [CrossRef] [PubMed]
24. Freundlieb, S.; Schirra-Mu Èller Hermann Bujard, C. Um sistema de ativação/repressão controlado por tetraciclina com maior
potencial de transferência de genes para células de mamíferos. J. Gene Med. 1999, 1, 4-12. [CrossRef]
25. Urlinger, S.; Baron, U.; Thellmann, M.; Hasan, M.T.; Bujard, H.; Hillen, W. Exploring the Sequence Space for Tetracycline-
Dependent Transcriptional Activators: Novas mutações produzem maior alcance e sensibilidade. Proc. Natl. Acad. Sci. USA
2000, 97, 7963-7968. [CrossRef] [PubMed]
26. Reynolds, E.S. The use of lead citrate at high pH as an electron-opaque stain in electron microscopy. J. Cell Biol. 1963, 17, 208-212.
[CrossRef] [PubMed]
27. Schlör, A.; Hirschberg, S.; Amor, G.B.; Meister, T.L.; Arora, P.; Pöhlmann, S.; Hoffmann, M.; Pfaender, S.; Eddin, O.K.; Kamhieh-
Milz, J.; et al. SARS-CoV-2 Neutralizing Camelid Heavy-Chain-Only Antibodies as Powerful Tools for Diagnostic and Therapeutic
Applications. Front. Immunol. 2022, 13, 930975. [CrossRef] [PubMed]
28. Schindelin, J.; Arganda-Carreras, I.; Frise, E.; Kaynig, V.; Longair, M.; Pietzsch, T.; Preibisch, S.; Rueden, C.; Saalfeld, S.; Schmid,
B.; et al. Fiji: Uma plataforma de código aberto para análise de imagens biológicas. Nat. Methods 2012, 97, 676-682. [CrossRef]
29. Hager, K.J.; Pérez Marc, G.; Gobeil, P.; Diaz, R.S.; Heizer, G.; Llapur, C.; Makarkov, A.I.; Vasconcellos, E.; Pillet, S.; Riera, F.; et
al. Eficácia e segurança de uma vacina Covid-19 com adjuvante à base de plantas recombinantes. N. Engl. J. Med. 2022, 386, 2084-
2096. [CrossRef]
30. Moon, K.B.; Jeon, J.H.; Choi, H.; Park, J.S.; Park, S.J.; Lee, H.J.; Park, J.M.; Cho, H.S.; Moon, J.S.; Oh, H.; et al. Construção de
Partículas semelhantes ao vírus SARS-CoV-2 na planta. Sci. Rep. 2022, 121, 1005. [CrossRef] [PubMed]
31. Naskalska, A.; Dabrowska, A.; Szczepanski, A.; Jasik, K.P.; Gromadzka, B.; Pyrc, K. Functional Severe Acute Respiratory
Syndrome Coronavirus 2 Virus-Like Particles from Insect Cells. Front. Microbiol. 2021, 12, 2773. [CrossRef] [PubMed]
32. Peng, S.; Qi, Y.; Christensen, N.; Hengst, K.; Kennedy, L.; Frazer, I.H.; Tindle, R.W. Capture ElISA e ensaio de ligação
celular in vitro para a deteção de anticorpos contra partículas semelhantes ao vírus do papilomavírus humano tipo 6b em
doentes com verrugas anogenitais. Pathology 1999, 31, 418-422. [CrossRef] [PubMed]
33. Du, P.; Brendle, S.; Milici, J.; Camacho, F.; Zurlo, J.; Christensen, N.; Meyers, C. Comparações de ELISA com base em VLP, ensaios
de neutralização com HPV nativo e ensaios de neutralização com PsV na deteção de respostas de anticorpos contra o HPV em
mulheres infectadas pelo HIV.
J. AIDS Clin. Res. 2015, 6, 433. [CrossRef] [PubMed]