O QUE É UM PLASMÍDEO?

• DNA extracromossômico
• Separado do DNA cromossômico
PLASMÍDEO • Replicação independente
• Comumente circular
• Genes de resistência
O QUE É UM PLASMÍDEO?

PLASMÍDEO
PLASMÍDEO
 IMPORTÂNCIA DOS PLASMÍDEO?
PRODUÇÃO DE MILHO COM GENE
INSULINA Bt
((Johnson, 1982) (Koziel et al.,1993)
 TIMELINE
PRIMEIRO VETOR
CRIAÇÃO DO VETOR
MODULAR
pBR322
pZ

1973 1985 2000

1977 1997
PRIMEIRO PLASMÍDEO CRIAÇÃO DOS
SURGIMENTO DA
EDITADO PLASMÍDEOS EM SÉRIE
BIOLOGIA SINTÉTICA
pSC101 pUC
 TIMELINE
CRIAÇÃO DOS
VETORES
pSEVA

2003 NEXT?

2013
PRIMEIROS VETORES
PADRONIZADOS ...
BioBricks
TIPOS DE PLASMIDEO
1973 – os pesquisadores trocaram o gene de
resistência a tetramicina do pSC101 pelo de
Canamicina, o transformando em pSC102
TIPOS DE PLASMÍDEO
1977  O plasmídeo pBR322  Nova era da Biologia
Molecular

• Usado na em diferentes ferramentas genéticas

 PLASMÍDEO x VETORES
Os plasmídeos se transformam em vetor, como meio de transporte para entregar e
manipular DNA estranho dentro de uma célula hospedeira, iniciando a nova era para a
biologia molecular
 ORI

•  ponto inicial para a

replicação de DNA

• Sequencia especifica de 50 a
100 pares de bases

• Necessario para que ocorra

a replicação dos plasmídeos

• Permite ao DNA do
plasmídeo replicar-se
independentemente do
ORIGEM DE DNA cromossómico

REPLICAÇÃO
Arquiteturas e categorias de plasmídeos bacterianos mais
comuns
Arquiteturas e categorias de plasmídeos bacterianos
mais comuns

arquitetura geral mínima é formada por uma origem de

replicação (ori), um marcador de resistência a antibióticos
(AbR) e uma clonagem múltipla site (MCS)
Arquiteturas e categorias de plasmídeos bacterianos mais
comuns

• Narrow host range, o ori retransmite na

maquinaria de replicação ou em uma proteína
(Rep) fornecida pelo hospedeiro.

• Broad Host range, o plasmídeo abriga seu próprio

gene Rep, o que o torna independente do
hospedeiro

• Shuttle vector, duas regiões ori (ori1 e ori2)

são colocados no vetor, cada um sendo
reconhecido por uma proteína Rep específica
de diferentes hospedeiros (Rep1 e Rep2).

• AbR (AbR 1 e AbR 2) são introduzidos para

permitir a seleção no host apropriado
DIFERENTES FUNCIONALIDADES DE VETORES

vetores de clonagem, um MCS geralmente está localizado

dentro de um marcador de seleção (como o gene lacZa
em vetor pUC ) para permitir a fácil identificação de
plasmídeos com fragmentos inseridos
DIFERENTES FUNCIONALIDADES DE VETORES

vetores de expressão, o MCS é precedido por um

sistema de expressão (aqui mostrado como um promotor
regulado P e seu regulador cognato R) que permite a
expressão do fragmento clonado em resposta a um
indutor químico.

um sinal terminador forte (Ter) é localizado após o MCS

para garantir a terminação transcricional eficiente e
estabilidade aumentada do plasmídeo.
DIFERENTES FUNCIONALIDADES DE VETORES

vetor repórter, um gene repórter (como uma proteína

fluorescente, um gene codificador da luciferase ou uma
codificação enzimática gene como lacZ) é flanqueado por um
MCS e um terminador forte.

a clonagem de uma sequência promotora no MCS

permite a investigação da dinâmica do promotor usando o
gene repórter de sua escolha
DIFERENTES FUNCIONALIDADES DE VETORES

vetor repórter, um gene repórter (como uma proteína

fluorescente, um gene codificador da luciferase ou uma
codificação enzimática gene como lacZ) é flanqueado por um
MCS e um terminador forte.

a clonagem de uma sequência promotora no MCS

permite a investigação da dinâmica do promotor usando o
gene repórter de sua escolha
VETORES DE
CLONAGEM
• vantagem de combinar com outras
propriedades desejáveis:
• capacidade de replicação no interior da célula
hospedeira.
• mantendo-as estável dentro de um organismo
hospedeiro
• alta eficiência de transformação,
• indicadores selecionáveis convenientes para
transformantes e recombinantes
• capacidade de clonar porções relativamente
grandes de DNA
VETORES DE EXPRESSÃO

• Contêm um regulador e um promotor alvo

que controla a expressão do gene que codifica
essa proteína

• Os vetores de expressão são vetores de
clonagem que possuem todos os elementos
genéticos que permitem a expressão de
proteínas recombinante
Vetores repórteres permitem a análise in vivo da cinética de
expressão gênica em todo o crescimento do organismo,
permitindo estudos sofisticados mesmo no nível de célula única

VETORES
REPÓRTER
Desenvolvimento de vetores para engenharia de bactérias

OS ColE1 - RK2 E RF1000 Pbr322 – Primeiro

PLASMIDEOS tornaram
BACTERIANOS restritos vetor artificial 
COMECARAM principalmente possível a um dos mais
A SER a E. coli devido introdução de importantes vetor
DERIVADOS à sua tecnologias de de bactéria 
DO DNA
PLASMIDEO maquinaria de utilizado para
recombinante
ColE1 replicação clonagem
 Desenvolvimento de vetores para engenharia de bactérias
pJET1.2 e pGEM-T  vetores atuais que reconhecem genes letais e a atividade da B- galactosidase
PLASMIDEOS pUC

•pUC promotor-operador lac

•exigem host compatíveis para
complementação
•sistema de rastreio que permite a
recuperação de b-galactosidase LacZ
funcional,
• fornece uma seleção para recombinantes
vetores modulares em bactérias

três módulos são combinados para gerar uma

coleção de vetores.
três ori de faixa estreita de hospedeiros foram
combinadas com quatro marcadores de resistência
a antibióticos e alguns sistemas de expressão e
repórteres
vetores modulares em bactérias Plataforma
BioBrick
• Na plataforma BioBrick, uma
ferramenta interativa
•A montagem é usada para
montar circuitos complexos
pela junção de fragmentos de
DNA usando apenas quatro
enzimas de restrição (EcoRI,
XbaI, SpeI e PstI).
 vetores modulares em bactérias
pSEVA
No pSEVA, origens de replicação de vários hosts
(representadas pelos elementos oriV e Rep)
são selecionados, permitindo a replicação dos plasmídeos
em várias bactérias Gram-negativas.