GENÉTICA DE BACTÉRIAS

TECNOLOGIA DNA RECOMBINANTE

Prof. Dr. Paulo Urbano
HISTÓRICO

Frederick Griffith

documenta detalhadamente suas observações acerca do comportamento de diferentes

tipos de pneumococos em cultura e sua virulência em camundongos.

Journ. of Hyg. 27 (2), Jan 1928

PRINCÍPIO DA TÉCNICA
HISTÓRICO

“Princípio transformante” - DNA

MUTAÇÃO
¨ Qualquer modificação súbita ou hereditária no conjunto
gênico de um organismo que não é explicável pela
recombinação da variabilidade genética preexistente.

¨ Mutações espontâneas: resultado de funções celulares

normais ou interações aleatórias com o ambiente.

¨ Mutações induzidas: ocorre devido o tratamento com

determinados compostos chamados de mutagênicos ou
genotóxicos.
AGENTES MUTAGÊNICOS
¨ Mutagênicos físicos:
à UV (dímeros de pirimidina),
à radiações ionizantes (ionização do DNA à quebras das cadeias do DNA
simples e duplas
à Calor

¨ Mutagênicos químicos:
à moléculas planares: - Brometo de etídio (EB),
- dodecilsulfato de sódio (SDS)

à Agentes alquilantes: metil metano sulfonato (SEM)

à água oxigenada (H2O2)
TIPOS DE VARIAÇÃO GENÉTICA

Transfecção - introdução de DNA exógeno em uma célula eucariótica

DNA genômico, plasmídeo Ti

Eletroporação, produção de protoplastos, biobalística, vetores virais, etc.

Transformação - incorporação de DNA exógeno por uma célula procariótica

(comumente realizada em Escherichia coli)

DNA plasmidial
Choque térmico, eletroporação
Transdução - o DNA bacteriano é transferido de uma bactéria para outra por um
vírus, os chamados bacteriófagos.
Generalizada, em que qualquer gene pode ser transmitido
Restrita, que se limita a alguns genes específicos.
TRANSFECÇÃO
TRANSFORMAÇÃO E TRANSDUÇÃO

Transformação - incorporação de DNA exógeno por uma célula procariótica

(comumente realizada em Escherichia coli)

DNA plasmidial
Choque térmico, eletroporação

Transdução - o DNA bacteriano é transferido de uma bactéria para outra por um

vírus, os chamados bacteriófagos.
Generalizada, em que qualquer gene pode ser transmitido
Restrita, que se limita a alguns genes específicos.
PLASMÍDEOS RECOMBINANTES
PLASMÍDEOS
PLASMÍDEOS RECOMBINANTES
RECOMBINAÇÃO E CLONAGEM - PLASMÍDEO

Pequenas moléculas de DNA circular extra-cromossômico com capacidade de

replicação independente do DNA genômico.

Podem conter sequências que aumentem a adaptabilidade e sobrevivência das células

que os carregam (resistência a antibióticos, fatores de virulência, etc.)
INTEGRAÇÃO
INTEGRAÇÃO

Principais plasmídeos transferidos naturalmente:

Fator de fertilidade (plasmídeo F)

Genes de resistência a antibióticos (β-lactamase, bombas de efluxo)

Genes de virulência (modificação na sequência de aa de proteínas de

membrana)

Ocorre mais frequentemente sob condições de estresse

INTEGRAÇÃO
TIPOS DE VETORES

Plasmídeos

Cosmídeos

Bacteriófago

Bactérias / leveduras
VETORES PLASMIDIAIS

Plasmídeos - moléculas de DNA circular, fita dupla, extracromossomais, que ocorrem

naturalmente em bactérias

pUC18

pBR322

pUP310

Ob.: Utilizados para clonar fragmentos de até 9 kb

VETORES PLASMIDIAIS
VETORES PLASMIDIAIS - $$
BACTERIÓFAGOS

Vírus que infectam bactérias

Utilizados para clonar fragmentos de 9kb a 25 kb

BACTERIÓFAGOS
BACTERIÓFAGOS - FAGOS
COSMÍDEOS

São híbridos entre plasmídeos e bacteriófagos

Utilizados para clonar fragmentos de 25 a 45 kb;

COSMÍDEOS
CONSTRUÇÃO DE UM OGM

Obtenção do DNA a ser clonado

Preparação do vetor

Ligação do vetor com o “inserto”

Transformação da bactéria

Seleção dos clones recombinantes

Importante! à Gene de resistência!

CONSTRUÇÃO DE UM OGM

Transformação da Bactéria

Eletroporação

Aplicação de pulsos de corrente elétrica às células, causando a

abertura de discretos poros na membrana

Heat-chock

Aplicação de choque de temperatura no microrganismo, causando a

abertura de discretos poros na membrana
 COMO COLOCAR DENTRO DA BACTÉRICA?

¨ Precisamos de uma bactéria competente à Capaz de aceitar um DNA

exógeno
¨ Eletrocompetentes – choque elétrico
¨ Quimiocompetentes – choque térmico
CONSTRUÇÃO DE UM OGM

Transformação da Bactéria

∆V
CONSTRUÇÃO DE UM OGM

Transformação da Bactéria

∆V
CONSTRUÇÃO DE UM OGM - Resuminho
Molécula de DNA de um plasmídeo linear
com extremidades coesivas
Molécula de DNA de um
Seleção doscircular
plasmídeo clones recombinantes

anelamento

Clivagem com
enzima de restrição

Ligação covalente pela

DNA ligase

Inserção em uma
célula hospedeira

Molécula de DNA
plasmidial contendo o
inserto
CONSTRUÇÃO DE UM OGM

Seleção dos
clones
recombinantes
DETECÇÃO
¨ Resistência a
antibióticos,
requisitos
nutricionais

¨ Fenótipo
diferente
EXPRESSÃO DE PROTEÍNA RECOMBINANTE
NA NATUREZA
¨ Conjugação

à Processo no qual um plasmídeo

ou um elemento genético é
transferido de célula dadora para
célula receptora por contato
direto, normalmente mediada por
um pili sexual

à Mesma espécie ou diferentes

CONJUGAÇÃO
NA NATUREZA
¨ Plasmídeos que
conferem resistência a
antibióticos ou a
inibidores de crescimento

¨ Estes genes codificam

proteínas que inativam o
antibiótico ou o seu
efeito

¨
TRANSFORMAÇÃO
GENÉTICA
DEFINIÇÃO

¨ Introdução controlada de ácidos nucleicos utilizando ferramentas de

engenharia genética

¨ Cinco etapas:
1) Identificação, isolamento e caracterização do gene de interesse.

2) Construção de um cassete de expressão e clonagem.

3) Transformação propriamente dita.

4) Regeneração e seleção das células transformadas.

5) Testes dos organismos transformados.

IDENTIFICAÇÃO, ISOLAMENTO E CARACTERIZAÇÃO
DO GENE DE INTERESSE

¨ Os principais genes procurados para transformação

genética são aqueles associados a características de
produtividade, resistência a estresses bióticos e
abióticos e qualidade nutricional.
CONSTRUÇÃO DE UM CASSETE DE
EXPRESSÃO E CLONAGEM

¨ O cassete de DNA obtido deve conter pelo menos

uma sequência promotora, o gene de interesse,
uma sequência terminadora e um gene marcador
de seleção ou repórter
QUESTIONAMENTOS PRÁTICOS

¨ Plantas e animais?

¨ Danos a saúde?

¨ Uso de agrotóxicos?
QUESTIONAMENTOS PRÁTICOS

¨ Plantas e animais?

¨ Danos a saúde?

¨ Uso de agrotóxicos?

¨ Resposta: Proteína recombinante

NA PRÁTICA - PROTEÍNAS
NA PRÁTICA - PROTEÍNAS
APLICAÇÕES DE PLANTAS TRANSGÊNICAS
FUTURO DOS ALIMENTOS
 FUTURO DOS ALIMENTOS

Crescimento da área global de plantio das culturas biotecnológicas, de 1996 a 2008

(Milhões de hectares).
E EM ANIMAIS?

¨ Final da década de 1970 à Estudos sobre câncer

que utilizavam camundongos
NA PRÁTICA
¨ O uso excessivo de
antibióticos acelera o
surgimento de
resistência

¨ Qual seria o motivo?

NA INDÚSTRIA
GENÉTICA BACTERIANA - CRISPR
¨ Clustered Interspaced Short Palindromic Repeats
(CRISPR) à Conjunto de repetições palindrômicas
regularmente espaçadas

¨ CRISPR-Cas foi descoberto em bactérias e archaea

¨ É um mecanismo de imunidade adaptativa contra

bacteriófagos
GENÉTICA BACTERIANA - CRISPR
GENÉTICA BACTERIANA - CRISPR
¨ CRISPR pode ser ativado pelos seus genes vizinhos CRISPR-
associado (CAS)

¨ Espaçadores serão processados em RNA molecular.