Universidade Estadual de Santa Cruz

Medicina Veterinária
Programa de Pós Graduação em Ciência Animal

Carlos Eduardo D’Alencar Mendonça

Ilhéus
2009
 Introdução
Biologia molecular

Terapia Gênica
Conceito
Objetivo

Princípio
 História
Foco principal » desordens genéticas hereditárias

O primeiro protocolo clínico (Blaese et al., 1990)

Em 1990
Imunodeficiência Severa Combinada (SCID)
Gene da Adenosina Desaminase (ADA)

Recentemente:
Câncer
Doenças cardiovasculares
Desordens neurodegenerativas
Doenças adquiridas
 Testes pelo mundo
987 testes clínicos (até 2004):

Fonte: www.wiley.co.uk/genmed/clinical
 Estratégias terapêuticas
Compensação de genes defeituosos ou ausentes;
Aumento ou redução das funções de genes presentes;
Aquisição de sensibilidade a uma pró-droga
normalmente inerte;
Interferência no ciclo de vida de agentes infecciosos.
Objetivo
Melhorar o quadro clínico através de uma única
administração de um gene terapêutico apropriado.
Viabilização de tratamentos melhores que os
convencionais para diversas doenças.

Ética
Células somáticas, que constitui-se na inserção de
genes em células diplóides.
Não herdabilidade dos transgenes
Vias de administração

BURLAMAQUE NETO, 2005

 Vetor

Vetor de
clonagem

Vetor de
transferência
 Vetor ideal
Características:
Capacidade de acomodação de um transgene de
tamanho considerável;
Baixa imunogenicidade e citotoxidade;
Expressão estável do transgene;
Direcionamento para tipos específicos de células ou
tecidos;
Custo baixo
Fácil produção e manipulação
Capacidade de regulação da expressão do transgene no
tempo e/ou na quantidade requerida do seu produto.

Vetor teórico
Na prática
Vantagens e desvantagens
 Eficiência;
 Estabilidade;

 Segurança.

Sistemas de entrega gênica:

Métodos químicos;
Métodos físicos;
Métodos biológicos.
 Métodos físicos
Princípio

Métodos de abordagem:
Microinjeção;
Injeção hidrodinâmica;
Biobalística;
Eletroporação.
 Métodos químicos
Catiônicos + DNA (carga negativa)
 Baixo custo e fácil manipulação e produção.
Lipídeos catiônicos
 Micela (endocitose)

Polímeros catiônicos
 Interações iônicas
 Protegem o DNA de nucleases e lisossomos.

Compostos químicos.
 Liberação de cátions, em solução aquosa, que se ligam ao
DNA.
 Fosfato de cálcio
 Cloreto de zinco
 Métodos biológicos
Vetores de origem
Plasmidial
Viral

Vetores virais são mais eficientes.

 Vírus
Dependem da célula hospedeira
Síntese de proteínas e enzimas (replicação)

Estrutura básica viral:

Núcleo
Capsídeo
Matriz
Envelope
Expressar sua informação genética nas células
infectadas.
Ciclo viral
Infecção
Replicação

Para ambas fases são necessários grupos de genes cuja

expressão é regulada temporalmente, sendo os genes de
função regulatória os primeiros a serem expressos,
seguido pelos genes estruturais.

Vírus geneticamente modificados

Produção de vírus recombinantes.

Grupo de sistemas de transferência gênica bastante

heterogêneo.

Classificados de acordo com os vírus os quais são baseados.

Transdução.

Vetores virais integrativos

Vetores virais epissomais

 Retrovírus
Subdividivisão
Oncovirinae
Lentivirinae

Vantagens:
Fácil manipulação e produção;
Grande eficiência na transdução e expressão do
transgene por um longo período.
 Lentivírus
Transdução de células quiescentes.

Possibilidade de mutagênese insercional.

Pequena capacidade de acomodação do transgene

Cerca de 8 kb
Considerações éticas (lentivírus HIV)
 Adeno-associados
Parvovírus não patogênicos + Adenovírus

Vetores seguros.

Capacidade de acomodação de transgene (5kb).

Difícil manipulação.
 
 Adenovírus
Transdução de grande número de tipos celulares.
Uso sistêmico destes vetores.

Capacidade de carregar um transgene maior que 8 kb

São produzidos em grande quantidade com facilidade.

Expressão do transgene transportado pode

permanecer por até um ano.

Segurança
Vetores virais

Adaptado de BURLAMAQUE NETO, 2005

 Vetores virais

http://media.invitrogen.com.edgesuite.net/cellTheraphySystems/lentigen4/player.html
 Vetores virais
Ausência de genes estruturais e/ou regulatórios.

Número de vetores lentivirais em pesquisa

 Estrutura lentiviral
LTR (long terminal repeats) » extremidades provírus
Regulação da expressão gênica e da integração viral

ORFs (Open reading frames)

gag (estruturais)
pol (enzimáticos)
env (envelope)

Pelo menos dois genes regulatórios adicionais :

tat e rev
Outros genes acessórios
Ciclo replicativo

Ciclo de replicação viral de um lentivírus

(COFFIN, 1996)
Integração do genoma

http://www.geocities.com/CollegePark/Field/8825/viaidreG99.gif
Vírus recombinante

Daly & Chernajovsky, 2000

http://media.invitrogen.com.edgesuite.net/cellTheraphySystems/lentigen4/
player.html
Organização genômica dos
retrovírus

Buchschacher & Woong-Staal, 2000

 Aplicações
MLV
desenvolvimento de leucemia em dois pacientes, por
mutagênese insercional.
Generalizações a respeito dos retrovírus
 peculiaridades especialmente na biologia viral.

Woodley et al. (2004)

Reverteram sinais clínicos da distrofia epidermolítica
bulosa em células de pacientes enxertadas em
camundongos atímicos.
Vetor lentiviral codificava o gene do colágeno tipo VII
Através de injeção intradérmica.
Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV)
Utilização proibida
 Integração sítio-inespecífica
 Possibilidade de recombinação homóloga com seqüências
retrovirais endógenas
 Recombinação com o vírus selvagem

Condições de biossegurança
 Considerações Finais
Eficiência dos vetores virais.
Lentivírus (Aplicações):
 Terapia em células somáticas;
 Terapia com células –tronco;

 Vacinas;

 Produção de proteínas terapêuticas.

Processo de reavaliação cauteloso.