GENÉTICA DE VÍRUS

APLICAÇÕES NA BIOTECNOLOGIA MÉDICA

Prof. Dr. Paulo Urbano
Genética Viral para terapia gênica
¨ A terapia gênica pode ser esquematizada de forma simples:

1| Inserção do gene no vetor;

2| Transferência do vetor transportando o gene terapêutico para a
célula;
3| Entrada do gene na célula;
*4| Dissociação do vetor e libertação do gene para o citoplasma;
*5| Disposição do gene do citoplasma para o núcleo;
6| Entrada do gene para o núcleo;
7| Transcrição do gene terapêutico em RNA mensageiro (mRNA) e
transporte para o citoplasma;
8| Tradução do mRNA em proteínas terapêuticas;
9| Secreção da proteína terapêutica ou inserção na membrana
celular.
VÍRUS
?
Portas de Entrada = INFECÇÃO

– Mucosa do sistema respiratório

digestório, urinário,

– conjuntiva/córnea

– pele

– Sangue: agulhas, picadas

transfusão, sexual

A via respiratória é provavelmente a mais comum.

Caracterís)cas

- Tamanho : 30 a 1000 nm

- Unidade: partícula vírica, partícula viral, vírion

-Por quê são intracelulares obrigatórios?

Os vírus não possuem a maquinaria necessária para a produção de

energia metabólica e síntese proteica e, por isso, necessitam das

funções e do metabolismo celular para se multiplicar

Caracterís)cas

¨ Capsídeo (nucleocapsídeo) à Envoltório proteico (Diferentes

formatos)

¨ Alguns possuem envelope – lipídios e proteínas

¨ Genomas diferentes (DNA e RNA)

¨ Enzimas

¨ Conceitos
Características estruturais

DNA ou RNA (exceção Citomegalovírus e Mimivírus) - Capsídeo / Nucleocapsídeo

RNA: HIV, virus da raiva - Envelope
- Proteínas
DNA: Hepatite B, HPV
Envelope Viral

¨ Origem – Membrana celular

¨ Pode originar-se também das membranas do aparelho de

Golgi, do retículo endoplasmático ou da membrana nuclear,
dependendo do vírus e do compartimento celular onde ocorre
a replicação.

¨ Composto de uma camada dupla de lipídios – de origem

celular – com proteínas associadas.
 Diferenças
Envelopados x Não envelopados
¨ O envelope os protege da ação ¨ Detectados mais rapidamente
do sistema imunológico e auxilia pelo sistema imunológico do
na infecção. organismo invadido.

¨ Facilmente inativados no ¨ Mais resistentes às condições

ambiente. ambientais, pela sua capacidade
de cristalização

¨ Transmitidos em geral por via

respiratória ou por contato ¨ Podem ser transmitidos por via
direto. hídrica.
Material genético

1. Vírus de DNA

2. Vírus de RNA que não é retrovírus

3. Retrovírus
Diversidade Viral
Replicação

¨ Células suscetíveis e permissivas

– Suportam o ciclo replicativo completo
Penetração + etapas intracelulares

¨ Células não suscetíveis ou permissivas

– Faltam receptores para adsorção e penetração
– Sem permissivas
– Exceção = Transfecção (processo artificial)
Etapas da Replicação

¨ Adsorção à Ligação específica das partículas víricas na superfície

das células hospedeiras

¨ Penetração à Principais mecanismos de penetração dos vírus nas

células hospedeiras:

A) Fusão com a membrana plasmática

B) Fusão após endocitose mediada por clatrina

C) Fusão após endocitose mediada por caveolina

D-E) Penetração após endocitose mediada por lipídios

 Etapas da Replicação - Penetração

A) Fusão com a membrana

plasmática
B) Fusão após endocitose
mediada por clatrina
C) Fusão após endocitose
mediada por caveolina
D-E) Penetração após
endocitose mediada por lipídios

Imagem de Fabricio S Campos

 Etapas da Replicação

¨ A clatrina é uma proteína que

desempenha um importante papel no
processo de formação de vesículas
membranares no interior das células
eucariontes

à responsáveis pelo transporte de material

proveniente da membrana plasmática, entre
os compartimentos endossomais e da face
trans do complexo de Golgi à Retículo à
Núcleo
 Etapas da Replicação

¨ As caveolinas compõem uma família de

proteínas transmembranas envolvidas em
processos formação invaginante e/ou vesícula
das cavéolas e estão envolvidas na endocitose
independente do receptor

¨ Formação de caveossomo à migração para o

retículo à raças à presença dos ribossomos, é
responsável por boa parte da produção de
proteínas da célula

¨ Genoma viral – membrana do RE – citosol -

núcleo
Etapas da Replicação

¨ Desnudamento à Série de eventos que ocorre após a penetração e

exposição do genoma para transcrição / tradução

¨ Expressão gênica (transcrição e tradução) à mRNA para fazer

proteínas à Replicação do genoma à Utilização da maquina
celular para multiplicar o material genético
¨ Morfogênese / maturação à Processo de montagem das partículas
virais / Aquisição de envelope

¨ Egresso à Saída (com possível destruição celular)

Brotamento
Infecção de Vírus por Células animais
Ciclos

¨ Lítico (ou infecção virulenta) - Material genético viral na célula

hospedeira e passa a dominar o metabolismo – lise celular

Ex.: Influenza, Adenovírus, Ebola

¨ Lisogênico – Combina as suas instruções genéticas com as

da célula hospedeira

Ex.: HIV, Herpes, Oncovírus

Lítico

¨ Absorção - reconhecimento e a fixação.

¨ Penetração – Introdução do genoma viral no interior da célula hospedeira.

à Direta – Material genético injetado na célula, permanecendo sua parte

proteica no lado externo.

à Fusão do envelope viral – Envelope fundido à membrana celular, o

capsídeo se desfaz e o genoma do parasita invade a célula.

à Endocitose – Fixação do vírus - englobado pelas invaginações.

¨ Síntese - Vírus começa a determinar as atividades metabólicas da célula à

redirecionamento metabólico

¨ Montagem - Componentes dos vírus que foram produzidas anteriormente são

organizados – Novos vírus

Ø Liberação – Enzima lisozima causa a

ruptura da célula hospedeira
Ø esgotamento celular
Ø rompimento
Lisogênico
¨ Célula continua as suas operações normais

¨ Divisão celular à o material genético da célula, juntamente com o material genético do vírus que

foi incorporado, sofre duplicação e em seguida é dividido equitativamente entre as células-filhas

à mitose

¨ Doenças causadas por vírus lisogênico tendem a ser incuráveis à genoma viral agora faz parte

do genoma celular

CURIOSIDADE à Vale a pena lembrar que o vírus incorporado na célula pode "despertar" por

algum motivo como a radiação, quimioterapia, raios X, etc...

Lisogênico
Interação vírus-célula

1. Autólise celular
– Liberação enzimas autolí8cas.
– Apoptose (Fas).

2. Integração genômica
- Infeções persistentes: HIV, HPV

3. Alterações cromossomiais
- síndrome rubéola congênita
- linfomas associados ao vírus Epstein Barr (EBV)
Efeito Citopático
Apoptose
Uso na Biotecnologia
¨ Pontos importantes ¨ Mais utilizado
à Adenovírus
à Vírus integrativos Plasmídeo
Maior eficiência
Menor segurança ¨ Transfecção

à Vírus não integrativos

¨ Terapia Gênica
Expressão transitória
Menor eficiência
Maior segurança
Pontos importantes

¨ Ausência de toxicidade para as células

¨ Ausência de resposta imune contra o vetor

¨ Ausência de resposta imune contra o transgene

¨ Capacidade de integração sítio-específico

¨ Estabilidade e expressão do gene em longo prazo

Tipos de vírus utilizados
¨ Os retrovírus - Integração do seu DNA nas células infectadas. Eles infectam
somente as células que estão proliferando.

¨ Os lentivírus (HIV) – Transferência de material genético para células que

não proliferam (como os neurônios e células do fígado) ou para células
refratárias para o retrovírus (como as células retiradas da medula óssea).

¨ Os adenovírus - Não são capazes de integrar o seu DNA ao cromossomo.

Podem transportar genes de grandes dimensões, Expressão não realizada
por muito tempo.
Adenoassociado

¨ Os adenoassociados - Integração do seu DNA ao cromossomo da célula

hospedeira à Inofensivos para a natureza em relação ao retrovírus, mas

não são capazes de transportar genes de dimensões grandes.

¨ Infecção com 3 plasmídeos diferentes

à Gene de interesse

à Proteínas virais

à Capsídeo
Diferença viral vs não viral
Na prática – Construção para a Recombinação viral
Na prática - Procedimento
Na prática - Procedimento
Terapia Gênica
Na Prática – Perda de visão

¨ Indivíduos com mutação no gene RPE65

apresentam degeneração da retina e perda de
visão. Doença autossômica recessiva

¨ Uso de vírus adenoassociado para expressão da

proteína correta e restauro da visão
Na Prática

¨ LUXTURNA - Utiliza um vetor viral adenoassociado sorotipo

2 (AAV2) para transportar uma cópia funcional do gene
RPE65 para as células epiteliais pigmentares da retina
(RPE) para compensar a mutação RPE65

¨ O AAV2 transfecta com eficiência as células RPE (células

epiteliais de pigmento da retina), tem baixo potencial para
provocar uma resposta inflamatória e não é patogênico
Na Prática
Na Prática
Na Prática

¨ Com um gene
RPE65 em
funcionamento, as
células começam
a produzir a
proteína 1 RPE65
Na Prática
Na Prática

¨ Com a proteína
funcional RPE65, 11-
cis-retinal (um
componente de
pigmento visual crítico)
se regenera para
restaurar o ciclo visual
Na Prática
Na Prática - Talassemia

¨ Mutação no gene HBB (β-globina). Doença

autossômica recessiva

¨ Baixa produção da cadeia β da hemoglobina

¨ Anemia
Na Prática

¨ Utilização de um lentivírus

¨ Integração do gene HBB correto em células tronco

hematopoiéticas (HSPCs)

¨ Produção de hemácias com hemoglobina funcional

Na Prática
Problema
¨ Reação imunológica - O produto do gene novo, o gene
propriamente dito ou seu vetor podem instigar uma resposta
imunitária no organismo sob tratamento – Antígenos em relação ao
hospedeiro

à Eliminação das células modificadas geneticamente

à Inativação da proteína produzida pelo gene novo

¨ Tentar evitar respostas imunitárias ao vetor ou ao produto do gene

introduzido.
E agora...

¨ Artigo científico

¨ Revisão de terapias virais

¨ Português

¨ 5 paginas

¨ Cai na Prova!
Arma biológica?
¨ Escolher um vírus já existente e modificá-lo para que ele possa
adentrar células humanas e se tornar mortal

¨ Varíola?
https://www.scielo.br/j/csp/a/9tQV9xnDLQBfdvQQKRh3PTv/?lang=
pt

¨ SARS-CoV-2?
Arma biológica?
Quer saber mais?
¨ https://www.scielo.br/j/bioet/a/RtrGZzZxcGJywg
dBgpVVXMS/?lang=pt&format=pdf
Na Prática - Câncer

¨ Introdução de genes supressores tumorais (gene

que impeça o crescimento e destrua os tumores) -
Ao chegarem ao núcleo das células tumorais, esses
genes causam a morte celular.

¨ Experimentos com animais à Reduziu os tumores

cancerígenos em até 80%
Na Prática - Câncer
¨ Praticamente todos os tumores à Erro na divisão é causada por problemas
no controle do ciclo de vida das células (proliferação, envelhecimento e
morte) à Mutações em dois alvos - p53 e CDKN2A.

¨ p53 integro à identifica situações de estresse nas células, como a

presença de mutações que podem levar à proliferação exagerada e ao
câncer à Aciona proteínas que contornam essa situação e o não
funcionamento induz à morte das células

¨ CDKN2A à Gene ligado ao envelhecimento das células - bloqueia

definitivamente o processo de divisão
Na Prática - Câncer
Na prática – Alternativas para tratamento de câncer

Paiva., 2017 – Terapia gênica e suas aplicações