Eletroforese

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 Eletroforese
 É um processo que consiste na separação dos componentes de um sistema através da aplicação de

um campo elétrico.
 É usado para separar e analisar biomoléculas.

 Princípio:

Substâncias em solução que possuem carga elétrica livre, deslocam-se quando submetidas a um campo

elétrico de sentido invariável.

 Para que uma partícula se mova é necessário que possua carga elétrica livre, isto é, excesso ou

diferença de elétrons.

 Portanto:

- para o ânodo (+) dirigem-se os ânions

- para o cátodo (-) dirigem-se os cátions 2

Técnica de separação de partículas através

de corrente elétrica

1-Identificação de substâncias

2-Homogeneidade de sistemas biológicos

3-Determinação de pontos isoelétrico

3
 N E i i
Ni
E  i
 E i   Pi E i
N N
Eletroforese
i i

 As moléculas são separadas umas das outras conforme o tamanho, a carga elétrica e a forma.

 Separa-se partículas de mesma carga, porém com quantidades diferente de carga.

 Tipos de eletroforese

- Livre

- Anticonvectante

- Carga da partícula

- Peso da partícula

- pH (solução tampão)
4
 Moléculas grandes migram lentamente, enquanto moléculas pequenas movem-se
rapidamente.
5
6
 N E i i
Ni
E  i
 E i   Pi E i
N N
Eletroforese
i i

 Suportes:

Meio sólido: - Papel

- Acetato de celulose

Meio semi-sólido: - Gel de amido

- Gel de agarose

- Gel de poliacrilamida

7
A técnica é tão sensível, que pode ser usada eficientemente para separar
moléculas que diferem apenas muito sutilmente em suas cargas e/ou

massas.

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  N i Ei c2 2 m  2
PV  Ni A mu 2  N A mN i  N A  c 2   N A  average kinetic energy / molecule 
E    3 E i 3  Pi 2E i  3
N i N i

Eletroforese

 Marcadores de peso molecular são

usados para estimar o tamanho das

moléculas das amostras.

9
10
 Eletroforese: a concentração do gel

 A concentração do gel
definirá o tamanho dos
poros a serem
atravessados pelas
moléculas em migração.
 Geis muito
concentrados oferecerão
maior resistência à
migração das moléculas.
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  N i Ei c2 2 m  2
PV  Ni A mu 2  N A mN i  N A  c 2   N A  average kinetic energy / molecule 
E    3 E i 3  Pi 2E i  3
N i N i

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 Eletroforese em suporte

Iniciada por König em 1937 na separação de

veneno de cobra recorrendo a papel de filtro

como meio-suporte, em 1946, Martin retomou

esta eletroforese.

Os principais tipos de eletroforese são:

13
14
15
 Eletroforese Capilar no

Seqüenciamento Automático

de DNA

1-Para decifrar o código genético humano, os cientistas do Projeto Genoma

tiveram de enfrentar a enorme tarefa de localizar as dezenas de milhares de

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genes que se encontram no DNA humano e em seguida fazer o
3-A técnica tradicional para seqüenciamento de

DNA é o método de Sanger, desenvolvida por

Frederick Sanger, um dos ganhadores do prêmio

Nobel de Química de 1980. Esse método utiliza

enzimas especiais para sintetizar fragmentos de

DNA que terminam quando uma determinada base

(adenina, citosina, guanina ou timina) aparece ao

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longo da seqüência.
 • Tipos de gel de eletroforese
• Gel de agarose

• É um polissacarídeo; forma uma rede que segura as

moléculas durante a migração.

Preparo: pó de agarose e solução tampão (TBE).

Após fundir, coloca-se brometo de etídio, que fará o DNA ou

RNA "brilhar" quando exposto ao UV. Coloca-se o pente no

gel. O pente cria poços que serão utilizados para a aplicação

das amostras.

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Diferentes sistemas de revelação dos géis: a) brometo de etídio; b) nitrato de

prata; c) raio – X; d) quimiluminescência; e) coomasie blue e f) fast blue BB

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Identificação de pessoas: em testes de

paternidade, comparando o DNA do suposto pai,

da mãe e do filho;

2- na identificação de criminosos.

3- Na Industria Farmacêutica (Vacinas, Reagentes

de diagnóstico);

4- Na Agropecuária (Animais e plantas 20

Como é feito o exame de paternidade?

21
Pólo -

23
 O Sequenciamento
de moléculas de DNA
Prof. Dr. Francisco Prosdocimi
>gi|33869444|gb|BC008730.2| Homo sapiens hexokinase 1, mRNA (cDNA clone MGC:1724 IMAGE:3163058), complete cds

GGCTGCGGAGGACCGACCGTCCCCACGCCTGCCGCCCCGCGACCCCGACCGCCAGCATGATCGCCGCGCA GCTCCTGGCCTATTACTTCACGGAGCTGAAGGATGACCAGGTCAAAAAGATTGACAAGTATCTGTATGCC

ATGCGGCTCTCCGATGAAACTCTCATAGATATCATGACTCGCTTCAGGAAGGAGATGAAGAATGGCCTCT CCCGGGATTTTAATCCAACAGCCACAGTCAAGATGTTGCCAACATTCGTAAGGTCCATTCCTGATGGCTC

TGAAAAGGGAGATTTCATTGCCCTGGATCTTGGTGGGTCTTCCTTTCGAATTCTGCGGGTGCAAGTGAAT CATGAGAAAAACCAGAATGTTCACATGGAGTCCGAGGTTTATGACACCCCAGAGAACATCGTGCACGGCA

GTGGAAGCCAGCTTTTTGATCATGTTGCTGAGTGCCTGGGAGATTTCATGGAGAAAAGGAAGATCAAGGA CAAGAAGTTACCTGTGGGATTCACGTTTTCTTTTCCTTGCCAACAATCCAAAATAGATGAGGCCATCCTG

ATCACCTGGACAAAGCGATTTAAAGCGAGCGGAGTGGAAGGAGCAGATGTGGTCAAACTGCTTAACAAAG(...)

TGACAGGCCTTCTGGGCCTCCAAAGCCCATCCTTGGGGTTCCCCCTCCCTGTGTGAAATGTATTATCACC

AGCAGACACTGCCGGGCCTCCCTCCCGGGGGCACTGCCTGAAGGCGAGTGTGGGCATAGCATTAGCTGCT TCCTCCCCTCCTGGCACCCACTGTGGCCTGGCATCGCATCGTGGTGTGTCAATGCCACAAAATCGTGTGT

CCGTGGAACCAGTCCTAGCCGCGTGTGACAGTCTTGCATTCTGTTTGTCTCGTGGGGGGAGGTGGACAGT CCTGCGGAAATGTGTCTTGTCTCCATTTGGATAAAAGGAACCAACCAACAAACAATGCCATCACTGGAAT

TTCCCACCGCTTTGTGAGCCGTGTCGTATGACCTAGTAAACTTTGTACCAATTCAAAAAAAAAAAAAAAAAA
 PCR
a reação em cadeia da polimerase
Prof. Dr. Francisco Prosdocimi

http://dotsub.com/view/538a719f-927b-4192-8e95-18a92a
9e95a5
 Coloração das moléculas
• Brometo de etídio
– Agente intercalante do DNA
• Cancerígeno!
– Composto fluorescente à luz UV
– Gel de agarose
• Prata
– Gel SDS-PAGE
• PoliAcrilamide Gel Electrophoresis
– Melhor resolução
• Coomassie blue, etc
 Figura Exclusão - Observe que um dos alelos (banda) do
Figura Inclusão - Observe que um dos alelos (banda)
filho é proveniente da mãe. O outro alelo, no entanto, difere

do filho é proveniente da mãe e o outro alelo dos alelos do suposto pai. Neste caso, ocorreu uma

exclusão de paternidade.
proveniente do suposto pai. Neste caso, a

paternidade fica comprovada

Eletroforese de Proteínas Séricas –padrão policlonal

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 Indicações para realizar eletroforese

Hiperviscosidade sérica de proteínas séricas

Anemia sem explicação

Dor coluna tóraco-lombar

Fraqueza, fadiga, osteopenia,

Lesões osteolíticas

Fraturas espontâneas

Insf. Renal

Proteinúria importante em pacientes acima de 40 anos

29

Hipercalcemia
As imunoglobulinas são moléculas multifuncionais,

usadas pelas células para intermediar interações

entre moléculas de antígenos e uma variedade de

mecanismos efetores humorais e celulares.

A molécula de Ig contém 4 polipeptídeos:

Duas cadeias leves idênticas e duas cadeias pesadas idênticas.

Os mamíferos possuem 2 classes de cadeias leves: kappa e

lambda.
30
Nos mamíferos são encontradas 5 classes principais de

cadeias pesadas: mu, delta, gamma, alpha, and

epsilon.

Esses 5 tipos correspondem as 5 classes de

imunoglobulinas:respectivamente: IgM, IgD, IgG,

IgA, and IgE.

31
Eletroforese de Proteínas Séricas e Imunofixação

32
33
 N E i i
Ni
E  i
 E i   Pi E i
N N
Eletroforese
i i

 Fatores que interferem na migração de partículas

- Mobilidade

- Diâmetro

- Peso molecular

- Força iônica

- Viscosidade

- Endosmose

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  N i Ei c2 2 m  2
PV  Ni A mu 2  N A mN i  N A  c 2   N A  average kinetic energy / molecule 
E    3 E i 3  Pi 2E i  3
N i N i

Eletroforese: saída de força

 A saída de força pode

ser de diversos tipos:
- Voltagem constante
(mV)
- Corrente constante
(ampéres)
- Força constante (watts)

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 Eletroforese

 Proteínas: - aminoácidos como eletrólitos

 Proteínas séricas:

- Albumina

- Globulinas (α1, α2, β, δ)

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 Eletroforese

 LipoProteínas – unidade de transporte lipídico

- Ultracentrifugação

- Separação por eletroforese

 Identificação de 4 faixas lipoproteicas

- Quilomicrons

- Lipoproteína Beta

- Lipoproteína Pré-beta

- Lipoproteína Alfa
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 Eletroforese

 Hemoglobina

- Hemoglobina anormais

- Carga elétrica

- Ponto isoelétrico

- Hemoglobina S

- Hemoglobina C

- Talassemia Beta

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 Eletroforese

 Hemoglobina S

- Hemoglobinopatia estrutural

* substituição do ácido glutâmico pela valina

- Indivíduos homozigotos (SS)

- Anemia hemolítica congênita

( anemia falciforme)

- Indivíduos heterozigotos (AS)

- Traço siclêmico

- Geralmente assintomáticos

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40
 Eletroforese

 Hemoglobina C

- Hemoglobinopatia estrutural

* substituição do ácido glutâmico pela lisina

- Indivíduos homozigotos (CC)

- Indivíduos heterozigotos (SC)

- Anemia

- Indivíduos heterozigotos (AC)

- Raros sintomas clínicos

- Detecção para aconselhamento genético

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42
 Eletroforese

 Talassemia Beta

- Depressão parcial ou total na síntese de cadeias beta da hemoglobina A

- Indivíduos homozigotos

- Anemia hemolítica grave

- Indivíduos heterozigotos

- Podem ser: assintomáticos

anemia hipocrômica e microcítica

anemia hemolítica leve/ moderada

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  N i Ei c2 2 m  2
PV  Ni A mu 2  N A mN i  N A  c 2   N A  average kinetic energy / molecule 
E    3 E i 3  Pi 2E i  3
N i N i

Eletroforese: métodos de leitura

Eluição

44
 Eletroforese: métodos de leitura

Densitometria

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A eletroforese de proteínas (EFP) no soro pode ser

solicitada se o paciente apresentar sintomas de:

infecção crônica

doença autoimune

alguma doença com perda de proteínas, como a

enteropatia (uma doença dos intestinos), ou doença

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O teste pode ser usado para excluir outras

doenças como leucemia e mieloma múltiplo. Os

sintomas desses distúrbios são:

fraqueza e fadiga

perda de peso

fraturas ósseas

infecções recorrentes
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OBRIGADA!!!

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