ENZIMAS DE RESTRIÇÃO

Prof. Juliana Vitoria Messias Bittencourt

 CLONAGEM DE DNA

Clonagem de DNA é uma técnica da biologia molecular

para fazer muitas cópias idênticas de um pedaço de DNA.

Num experimento típico de clonagem, um gene alvo é

inserido num pedaço circular de DNA chamado do
plasmídeo/vetor.

O plasmídeo é introduzido em bactérias através de um

processo chamado transformação, e bactérias portadoras
do plasmídeo são selecionadas.
Uso biotecnológico

Trata-se de uma maneira de construir

moléculas de DNA recombinantes usando uma
alternativa não convencional

TECNOLOGIA DO DNA RECOMBINANTE

CLONAGEM DE DNA
BIOLOGIA SINTÉTICA
ENZIMAS DE RESTRIÇÃO
 A descoberta da DNA ligase
• 1960: recombinação de
DNA ocorre em células
– Reparo de danos ocorridos
por luz UV

• 1967, Martin Gellert

– Extratos de E. coli produziam
fagos lambda circulares
– Purificação da DNA ligase!

• Circularização de
genomas
 Endonucleases de restrição
• 1968, Paul Arber sugere a existência de
enzimas existentes em bactérias que atuassem
como proteção à infecção por fagos
– Essas enzimas cortariam o DNA do fago em sítios
específicas
– Endonuclease R

• 1968
– Meselson & Yuan: EcoRI

• 1970
– Smith & Kelly: nova endonuclease descoberta
em H. influenzae -- HindIII
– Confirmação da hipótese de Arber, enzima corta
DNA exógeno mas não DNA celular
– Descoberta do sítio específico de corte pela
enzima (AAGCTT)
DESCREVA O PROCESSO DA FIGURA ABAIXO
 Mapa de restrição
• 1971 - Kathleen Danna and
Daniel Nathans

• Ensaio de digestão: Usam a

endonuclease R (EcoRI) para
cortar o DNA do fago SV40

• Fragmentos tinham tamanho

constante e, logo, podiam ser
facilmente separados em uma
eletroforese!
– Verificado o fato de que a enzima
corta em sítios específicos
 Ensaio de digestão
• Adicione DNA + tampão +
endonuclease de restrição

• Deixe digerindo num banho a

determinada temperatura por
determinado tempo

• 1 unidade de enzima de restrição

digere 1 µg DNA em 1h00

• Caixa de truques do biólogo

molecular contém: DNA ligase +
enzimas de restrição + ...
 Vetores de clonagem
• ~1970: Trabalho com plasmídeos

• Peças de DNA circulares e não cromossomais

encontradas em bactérias
– E às vezes trocadas por elas

• 1970

Descobriu um método segundo

o qual uma E. coli adquiriria um 

Stahen Cohen, 1936-
plasmídeo conhecido como pSC101
• pSC101: contém um gene que 

confere resistência ao anti-

biótico tetraciclina
 PLASMÍDEO ENCONTRA
ENDONUCLEASES
• Cohen junta-se a Boyer, especialista em
enzimas de restrição

Herbert Boyer, 1936

• Trabalharam com dois plasmídeos,
– P1 confere resistência a tetraciclina
– P2 confere resistência a kanamicina

EcoRI

EcoRI
• Experimento
– Corte os dois plasmídeos com enzimas de restrição
– Incube-os com DNA ligase P1 P2
– Teste a presença de bactérias duplamente
resistentes no meio
• Este talvez tenha sido obtiveram o primeiro K T

EcoRI
Digestão +
organismo recombinante feito propositalmente K ligação

por um ser humano

P1/2

EcoRI
 COHEN & BOYER
• 1973
– Inseriram genes de Xenopus laevis em E. coli e
verificaram que os genes estavam ativos nas
bactérias depois de várias gerações da bactéria.

– Como as bactérias reproduziam-se rapidamente,

poderiam ser utilizadas para produzir genes de
grandes mamíferos em larga-escala

– Constroem um organismo capaz de combinar e

replicar a informação genética de diferentes
espécies!
O que, então, era possível fazer?
 DISCUSSÕES ÉTICAS
• 1974
– Paul Berg (juntou SV40 com fago lambda e

se arrependeu) alerta para o perigo da 

biotecnologia e sugere uma moratória

• 1975
– Conferência Asilomar
– Moratória de 16 meses ao DNA recombinante
– Bomba atômica da biologia?

• Watson acha que a natureza já fez muitos 


mais experimentos, por muito mais tempo 

e muitos mais jeitos do que podemos 

imaginar e nada de muito significativo 

aconteceu...
– Se fosse causar algum dano, a natureza 

per se já teria causado...
 CLONAGEM DE FRAGMENTOS DE
DNA
• Enzimas
– enzimas de restrição
– DNA polimerases
– DNA ligase/Topoisomerases
– Fosfatases

• Vetores
– Plasmídios
– Fagos
– Cosmídeos
– BACS/YACS
– Vírus, bacteriófagos

• Hospedeiros
– Escherichia coli
– Levedura
– Células animais
– Células vegetais
 VETOR PLASMIDIAL
• Origem de replicação
• Marcador - Gene repórter
• Sítio de restrição - sítio clonagem
 LIGAÇÃO DO DNA EXÓGENO AO
PLASMÍDEO
• Produção da molécula
de DNA recombinante

• Plasmídeo + DNA
cortado do organismo
de interesse

• Ligação das
extremidades coesivas
TRABALHOS PARA PRÓXIMA AULA

EM UMA LAUDA DESCREVA A TÉCNICA

DE PCR COM AS SUAS PALAVRAS, A
PARTIR DO ENTENDIMENTO DE NO
MÍNIMO TRÊS REFERÊNCIAS
BIBLIOGRÁFICAS SOBRE O ASSUNTO.
ADICIONALMENTE, FINALIZE ESTA
LAUDA COM UM ESTUDO DE CASO DE
SEU INTERESSE.
ELETROFORESE
Técnica de Eletroforese em gel
•Eletroforese em gel  é uma técnica de separação de  moléculas  que envolve a
migração de  partículas  em um determinado gel durante a aplicação de
uma  diferença de potencial. As moléculas são separadas de acordo com o seu
tamanho, pois as de menor  massa  irão migrar mais rapidamente que as de
maior massa.

Por enzimas de restrição

 Técnica de Eletroforese em gel
•Eletroforese em gel  é uma técnica de separação de  moléculas  que envolve a
migração de  partículas  em um determinado gel durante a aplicação de
uma  diferença de potencial. As moléculas são separadas de acordo com o seu
tamanho, pois as de menor  massa  irão migrar mais rapidamente que as de
maior massa.

eletrodo eletrodo Fragmento (ou Fragmento (ou

negativo positivo banda) de DNA banda) de DNA
maior menor

DNA fragmentado
por enzimas de
restrição tempo
gel decorrido
Técnica de Eletroforese em gel
•Eletroforese em gel  é uma técnica de separação de  moléculas  que envolve a
migração de  partículas  em um determinado gel durante a aplicação de
uma  diferença de potencial. As moléculas são separadas de acordo com o seu
tamanho, pois as de menor  massa  irão migrar mais rapidamente que as de
maior massa.
Amostras de DNA + enzimas
de restrição gel
“Pocinho”

Cada amostra é colocada num pocinho e se

desloca no gel sob ação da corrente elétrica.

Resultado

http://www.youtube.com/watch?v=CpnPLk5b2fU
Técnica de Eletroforese em gel
•Eletroforese em gel  é uma técnica de separação de  moléculas  que envolve a
migração de  partículas  em um determinado gel durante a aplicação de
uma  diferença de potencial. As moléculas são separadas de acordo com o seu
tamanho, pois as de menor  massa  irão migrar mais rapidamente que as de
maior massa.
Técnica de Eletroforese em gel
•Eletroforese em gel  é uma técnica de separação de  moléculas  que envolve a
migração de  partículas  em um determinado gel durante a aplicação de
uma  diferença de potencial. As moléculas são separadas de acordo com o seu
tamanho, pois as de menor  massa  irão migrar mais rapidamente que as de
maior massa.
Técnica de Eletroforese em gel
•Eletroforese em gel  é uma técnica de separação de  moléculas  que envolve a
migração de  partículas  em um determinado gel durante a aplicação de
uma  diferença de potencial. As moléculas são separadas de acordo com o seu
tamanho, pois as de menor  massa  irão migrar mais rapidamente que as de
maior massa.
•Aplicação: teste de paternidade, perícia criminal, diagnósticos de doenças, etc.
Técnica de Eletroforese em gel
•Eletroforese em gel  é uma técnica de separação de  moléculas  que envolve a
migração de  partículas  em um determinado gel durante a aplicação de
uma  diferença de potencial. As moléculas são separadas de acordo com o seu
tamanho, pois as de menor  massa  irão migrar mais rapidamente que as de
maior massa.
•Aplicação: teste de paternidade, perícia criminal, diagnósticos de doenças, etc.
Técnica de Eletroforese em gel
•Eletroforese em gel  é uma técnica de separação de  moléculas  que envolve a
migração de  partículas  em um determinado gel durante a aplicação de
uma  diferença de potencial. As moléculas são separadas de acordo com o seu
tamanho, pois as de menor  massa  irão migrar mais rapidamente que as de
maior massa.
•Aplicação: teste de paternidade, perícia criminal, diagnósticos de doenças, etc.

Exemplo de aplicação de
eletroforese na identificação de
um criminoso
Técnica de Eletroforese em gel
•Eletroforese em gel  é uma técnica de separação
de moléculas que envolve a migração de partículas em
um determinado gel durante a aplicação de
uma  diferença de potencial. As moléculas são
separadas de acordo com o seu tamanho, pois as de
menor massa irão migrar mais rapidamente que as de
maior massa.
•Aplicação: teste de paternidade, perícia criminal,
diagnósticos de doenças, etc.

Exemplo de aplicação de
eletroforese na identificação de
um criminoso
GENE
 Amostra
Padrão em
Homozigoto
pares de
bases (pb)
Pólo (-)

200

170

140

Fragmento de GENE
Restrição com 110
125 pb

80

50

20

Pólo (+)

Gel de Eletroforese
 Amostra Amostra
Padrão em
Homozigoto Heterozigoto
pares de
bases (pb)
Pólo (-)

200

170

Fragmento de 140
Restrição com
180 pb GENE
110

80

50

20

Pólo (+)

Gel de Eletroforese
 Amostra
Amostra Homozigoto
Padrão em
Homozigoto Afetado
pares de
bases (pb)
Pólo (-)

200

170

Fragmento de 140
Restrição com
180 pb GENE
110

80

50

20

Pólo (+)

Gel de Eletroforese