Atividade 1

Explique o que é o paradoxo de Levinthals e quais as dificuldades inerentes ao enovelamento de

proteínas que dificultam a produção de proteínas e enzimas de novo.

Como já sabemos, existem um conjunto de 20 aminoácidos que são encontrados nas proteínas dos
seres vivos, esses aminoácidos se juntam e formam ligações peptídicas dentro de nossos organismos
para desempenhar suas respectivas funções. A ligação entre dois aminoácidos ocorre de forma que o
c-terminal de um aminoácido se liga ao c-terminal do outro, neste processo ocorre a liberação de uma
molécula de água e a formação de uma ligação entre esses resíduos. Nessas ligações ocorre a
formação de ângulos, Phy e Psi, estes possibilitam que as ligações possuam um certo grau de
flexibilidade pela rotação em sua estrutura.

Devido a essa flexibilidade e possibilidade de rotação, a proteína consegue se enovelar e assim

alcançar o estado de proteína funcional, isto é, estado onde a proteína consiga desempenhar sua função
de proteína.

Ensaio para Paradoxo de Levinthal

Considerando que uma proteína tenha apenas 100 aminoácidos e que cada resíduo possa adotar apenas
duas conformações, para cima e para baixo, teríamos cerca de 2​100 conformações possíveis para
determinada proteína.

Se essa proteína levasse cerca de 1ps para passar de uma conformação para outra, levaria cerca de 3.9
x 10​10 anos, no mínimo, para a proteína conseguir atingir o seu estado nativo, visto isso, seria
matematicamente impossível que essa proteína alcançasse esse estado apenas por mudanças aleatórias
em sua estrutura. Hoje sabemos que esse mecanismo é impossível de acontecer, ademais, o tempo
médio de enovelamento de uma proteína depois que a mesma é produzida dentro da célula ou de um
sistema artificial, ocorre na ordem de milisegundos a microsegundos.

Para produção de novas proteínas, inicialmente seria necessário entender como a estrutura primária da
proteínas iria se enovelar, para assim, alcançar determinado potencial energético que correspondesse
ao estado em que a proteína fosse capaz de desempenhar a sua função proteica. Visto que o
entendimento do processo de enovelamento ainda é pequeno, a síntese de novas proteínas ainda é
considerada utópica.

Atividade 2

A figura abaixo se refere a um tipo específico de modificação enzimática. Quais as vantagens e

desvantagens deste tipo de processo. Se necessário, faça uma pesquisa na internet para
responder a esta questão com mais propriedade.

Modificações químicas de determinada proteína cujo o objetivo era elucidar as relações

proteína/estrutura presentes no sistema. Neste processo, geralmente, ocorre a ligação de determinada
substância em um resíduo de aminoácido que reage com a substância, buscando assim, o entendimento
da atividade daquele proteína e posterior melhora da mesma.
O processo funciona por meio de uma ligação covalente ou ligação cruzada de uma parte do
aminoácido que resulta em sua modificação química. Essa ligação pode ocorrer com material insolúvel
em água, fixação da enzima em matriz e formação de ligações cruzadas na mesma, onde esse processo
evita que a proteína, sob condições de estresse, se desdobre.

Esse tipo de ligação, por exemplo, pode aumentar a estabilidade funcional de determinada enzima sob
condições ruins como; alta temperatura, baixa agitação e em solventes, quando comparadas com sua
forma nativa. Outro exemplo é a inutilização da enzima por modificações estruturais que afetam o sítio
ativo da mesma, culminando na perda de sua atividade.

Independentemente do resultado do processo, o mesmo se torna empírico por não elucidar se o

resultado é baseado na modificação em si do aminoácido ligado ou em modificações estruturais da
proteína como um todo por suas reações com o ligante. Em síntese, muitas vezes esperamos
determinado resultado pela modificação de um aminoácido específico, porém, estes resultados podem
mudar de acordo com a resposta estrutural da proteína junto ao modificador químico.

Atividade 3

O que são mutações sítio-dirigidas e qual a utilidade deste tipo de ferramenta no

desenvolvimento de enzimas "engenheiradas"?

Mutações localizadas em regiões específicas de determinado aminoácido buscando o aperfeiçoamento

em sua atividade ou parâmetro cinético de uma enzima, por exemplo. Existem diversas forma de se
realizar o processo de mutação, dentre eles temos a mutação sítio-dirigido por PCR que foi criada
como um método para produção de mutantes via inserção ou deleção de regiões de pares de bases,
com inserção ou não de enzimas de restrição, resultando assim em produtos de interesse do
pesquisador.

Outra forma de realizar esse tipo de processo é por meio de um vetor bacteriano, onde o pesquisador
retira determinada sequência do DNA bacteriano e substitui por uma sequência mutante que produzirá
um produto de interesse.

Seguindo exemplo citado em aula, podemos relacionar a atividade de determinada enzima presente em
um detergente com a sua estrutura nativa e mutada. Em um cenário onde determinado resíduo, Met
222, da enzima Substitulina têm sua atividade influenciada negativamente pela ação de oxidantes,
mutações sítio-dirigidas podem ser utilizadas para normalizar a atividade catalítica desta enzima, ou
seja, por meio de métodos de biologia molecular é possível deletar esse resíduo de (Met 222) da
enzima e substituir pontualmente por outro resíduo que faça com que a atividade não seja assim
influenciada de forma negativa. Esse processo pode ser utilizada industrialmente para obtenção de
enzimas “engenheiradas” mais eficientes para atuação em seus processos específicos.
 Atividade 4

Quais as principais diferenças entre os métodos de engenharia de proteínas

relativos às chamadas abordagens teóricas (ou design racional) ou experimental
(ou design aleatório)?

Abordagem teórica ou design racional

Baseado em conhecimentos pré estabelecidos como; base de dados de proteína, artigos e literatura
acerca da enzima em que o pesquisador estiver trabalhando. Esse tipo de design aborda de forma
precisa determinada proteína, isto é, neste tipo de processo pode-se realizar mutações pontuais para
formação de produto/atividades de interesse por meio de um processo denominado mutagênese
sítio-dirigida.

Abordagem experimental ou design aleatório

​Nesse caso ocasionalmente o pesquisador têm uma enzima, proteína, onde aquele não conhece
especificamente como funciona o mecanismo de atuação, estrutura e características próprias daquela
enzima, visto isso, experimentos devem ser realizados não considerando características pontuais e
específicas da enzima em questão.

Atividade 5

Descreva os princípios das técnicas de DNA shuffling e Evolução Dirigida. Cite um exemplo de
enzima industrial desenvolvida ou aprimorada através de cada uma destas técnicas. Se
necessário, faça uma pesquisa na internet para responder a esta questão.

A técnica de DNA shuffling necessita de sequências homólogas que servirão de base para a produção
de moléculas recombinantes denominadas Biblioteca de DNA shuffling. Nesse processo, graças a
similaridade entre as sequências iniciais, outros fragmentos poderão recombinar de forma a produzir
fragmentos híbridos e melhorados quando comparados as sequências homólogas iniciais.

O processo de DNA shuffling pode ser dividido em quatro etapas denominadas; seleção dos
homólogos, quebra enzimática dos genes, ciclos de PCR sem a adição de primers para que ocorra
recombinação e amplificação das sequências por PCR com adição de primers.

Etapa de seleção

Nessa etapa os genes devem ser escolhidos para criação da biblioteca, tamanho dos fragmentos,
temperatura de reação e quantidade de processos de PCR, todos atuaram de forma a influenciar a
diversidade gênica do processo em questão.
Etapa de fragmentação

O processo pode ocorrer de duas formas, a primeira acontece pela ação de enzimas randômicas, DNase
I, que atua na fragmentação da fita em posições aleatórias. A segunda é baseada na fragmentação não
randômica, ou seja, pela utilização de enzimas de restrição que atuarão em regiões específicas da fita
de DNA, podendo assim prever o número de fragmentos e tamanho dos mesmos. Vale salientar que no
processo randômico, o número de fragmentos e tamanho dos mesmos não são quantificados com
exatidão. Ainda no processo de fragmentação, a técnica de eletroforese em gel de agarose se torna
essencial para purificação do intervalo de interesse da proteína.

Etapa de ciclagem de PCR

Nessa etapa os fragmentos resultantes dos homólogos pode se recombinar e formar híbridos, gerando
assim DNA para a biblioteca. Outro parâmetro atuante na etapa é a reação cíclica de desnaturação,
pareamento e extensão do fragmento para obtenção do produto desejado.

Na fase de desnaturação, a dupla fita de DNA inicial é submetida a altas temperaturas que quebram as
ligações de hidrogênio entre as fitas produzindo assim duas fitas simples.

Posteriormente ocorre a fase de pareamento onde os fragmentos desnaturados irão parear novamente,
nesta etapa pode ocorre pareamentos homoduplex, quando os fragmentos unidos são derivados do
mesmo homólogo e heteroduplex, quando os fragmentos unidos são derivados de homólogos
diferentes. Quanto maior a taxa de heteroduplex, maior a diversidade gênica resultante do processo.

Por fim o processo de extensão é realizado por meio de enzima DNA polimerase que de fato irá
formar a dupla fita de DNA.

Etapa de amplificação

Fragmentos resultantes do processo anterior são submetidos a uma reação de PCR para amplificação
dos fragmentos recombinados. Finalmente os fragmentos são clonados e adicionados a biblioteca de
recombinantes.

DNA shuffling de inibidores de alfa-amilase

Existem dois tipos de inibidores de alfa-amilase em Phaseolos vulgares, onde a Zabrotes subfasciatus é
inibida pelo inibidor dois (α-AI-2), já a α-amilase pancreática de porca é inibida pelo inibidor um
(α-AI-1).
Por meio de uma método teórico ou design racional, mutagênese sítio dirigidas promoveram a
produção de quatro tipos de mutantes de α-AI-2. Destes mutantes duas alças foram identificadas como
importantes no processo de determinação de especificidade, porém, apenas essas mudanças não foram
o suficientes para sanar todas as necessidades para com a enzima. Neste cenário a técnica de DNA
shuffling foi utilizada para produção de diversas variedades de recombinantes utilizando os homólogos
α-AI-2 e α-AI-1. Por fim os mutantes foram clonados em vetores de expressão, fagos e transformados
em E. coli para análise das mutações, os resultados mostraram eficiência no processo e os clones
foram introduzidos na biblioteca de DNA shuffling.

Evolução dirigida

As estratégias utilizadas na evolução dirigida se baseiam na promoção de ciclos mutagênicos de

recombinação e triagem das propriedades desejadas em determinada enzima. Esse tipo de processo
pode utilizar diversas técnicas, como; reações de cadeia polimerase propensa a erros, DNA shuffling e
mutagênese por saturação.

Na primeira, genes clonados durante a PCR serão modificados em áreas pontuais aleatórias. Para que
erros aconteçam, modificações nas reações condicionais são realizadas de forma que os
oligonucleotídeos sejam inseridos com o maior número de erros pela enzima DNA pol. As
modificações reacionais vão diminuir a propriedade de pareamento de bases, dessa forma, a taxa de
mutação aumenta a uma taxa de 10​4​ ~10​3​ por base replicada por ciclo.

A técnica de mutagênese por saturação consiste na randomização de aminoácidos em determinadas

posições da estrutura primária da proteína, isto é, ocorre a substituição de um códon ou um conjunto
deles, que são responsáveis pela síntese da determinada proteína, por uma variante.

Basicamente os processos envolvidos na evolução dirigida são similares aos processo do DNA
shuffling, utilizando enzimas de restrição e PCR com ou sem adição de primers, visto isso, uma das
diferenças entre as duas técnicas é que na segunda, a partir de menos clones é possível encontrar mais
características desejáveis quando comparada a primeira que de vários clones são filtradas as
características desejadas.

De todos os clones gerados no processo, alguns são selecionados e submetidos a outras cargas de
processos cujo objetivo é filtrar as características desejadas pelo pesquisador, visto isso, quanto maior
a quantidade de processos direcionados a enzima, maior a filtragem dessas enzimas e menor a
quantidade de clones no final do processo.

Evolução dirigida na síntese de sitagliptina

Esse fármaco é utilizado no tratamento de diabetes do tipo II, onde por meio de modificações no sítio
catalítica da enzima ω-transaminase, maiores quantidades de substratos passaram a ser aceitos pela
mesma.

Neste processo foram realizados 27 mutações com o objetivo de acomodar uma cetona precursora de
prositagliptina no sítio catalítico da enzima, essas mutações utilizaram diversas bibliotecas e foram
responsáveis pelo aumento do menor bolsão da enzima e uma série de mutagêneses em vários trechos
da mesma.

Quando comparada com a enzima anterior, a nova apresentou um rendimento maior de 10% e
aumento de 56% na sua produtividade.