RESUMO BIOTECNOLOGIA TEÓRICA

Enzimas Hidrolíticas
Glicosilases
- Enzimas que tem carboidrato como substrato
- Promovem hidrolise de ligações glicosídicas
- Fischer (cadeia aberta)
- Haworth (cadeia fechada)
- Classificadas em:
- monossacarídeos: glicose, galactose, frutose
- oligossacarídeos: maltose, sacarose, lactose
- polissacarídeos: celulose, quitina, amido, glicogênio
- De maior importância: AMILASE (substrato: amido)
- Amido:
- Principal reserva de carboidratos nas plantas (trigo/milho/cevada/arroz)
- Teor mais elevado no grãos que as raízes
- Unidade básica: glicose
- Polissacarídeos: amilose (15-25%) (ligações alfa-1,4) + amilopectina
(75-85%) (ligações alfa-1,4 e alfa-1,6)

- Amilase:
- Responsável pela hidrolise do amido -> resulta em pequenos polímeros
de glicose
- Usado na indústria têxtil, papel, celulose, detergente, ração animal,
indústria farmacêutica
- Dois mecanismos de ação:
- Endoamilases: de dentro pra fora, capazes de hidrolisar ao acaso as
ligações no interior das cadeias
- Exoamilases: de fora para dentro, atuando nas extremidades dos
substratos pela extremidade não redutora

- Classificação conforme especificidade:

1. Alfa-amilase
- Endoenzima que catalisa alfa-1,4
- Produz polímeros de glicose de baixo PM (alfa dextrina,
maltose, glicose)
- Presente em fungos e bactérias
- Cofator: Ca2+ -> mantem conformação da enzima (protege
contra desnaturação)
- pH ótimo: 6-7 em mamíferos e 5-6 em fungos
- Temperatura ótima: 55-70°C (de origem bacteriana são +
termoestáveis)
 2. Beta-amilase
- pH ótimo: 5-6
- temperatura ótima: aproximadamente 30 °C
- Combinação de alfa com beta aumenta concentração de
açúcares fermentescíveis
3. Glicoamilase
- Exoenzima que hidrolisa polissacarídeos de alto PM (ligações
alfa-1,4 e alfa-1,6)
4. Alfa-glicosidase
- Exoenzima que hidrolisa alfa-1,4 e alfa-1,6 de cadeias
pequenas (maltose e etc)
- Produtos: degradação completa do amido -> glicose
5. Desramificantes (pululanases e isoamilase)
- Endoenzimas que catalisam alfa-1,6
- Pululanase tipo 1 (alfa 1-,6), tipo 2 (alfa 1,4 e 1,6)
- Isoamilase -> substrato: dextrina
- Produto: transformação de amilopectina em amilose
6. Ciclodextrina-glicosil-transferase (CGTase)
- Endoenzima que catalisa alfa-1,4 e depois catalisa ciclização do
oligossacarídeo formado
- Produto: ciclodextrina com 6/7/8 unidades de glicose
- Obtenção: Bacillus macerans
- Aplicação da amilase:
- Panificação: alfa-amilase
- Fúngica é mais usada que a bacteriana por ser mais termolábil
- Atividade e estabilidade depende do cofator íons cálcio
- Objetivo: aumentar o teor de açúcares fermentescíveis disponíveis
para a levedura para ter fermentação uniforme com CO2 moderad
- Suco de frutas: amiloglicosidase ou alfa-amilase ácida
- Objetivo: evitar turvação do produto pela precipitação do amido da
fruta
- pH ótimo entre 3-4
- Indústria de alimentos
- Produção de xaropes e maltodextrinas: usados como estabilizantes,
gomas, na confeitaria, para refrigerante, meios de cultura, etc
- Indústria farmacêutica: ciclodextrinas
- Tem superfície exterior polar -> usada em transportes de fármacos
e ativos cosméticos
- Aumenta solubilidade/velocidade de dissolução (aumenta
biodisponibilidade)
- Protege os fármacos da decomposição por hidrólise/oxidação
- Fixação de compostos voláteis (reduz perda por evaporação)
- Reduz toxicidade por diminuir contato direto com fármaco
- Dextram-sacarase: catalisa hidrólise da sacarase e em seguida da
polimerização das unidades de glicose pelas ligações alfa-1,6 e alfa-1,3 ->
forma dextrano (alto PM)
 - Usado como expansor de plasma sanguíneo, em soluções oftálmicas,
carreador de íons Ferro, veículo de contraste e agente espessante
- Invertase: catalise hidrólise de sacarose produzindo açúcar invertido (glicose
+ frutose)
- Glicose: 70% da doçura da sacarose
- Frutose: 50% mais doce que a sacarose
- Invertido é mais doce/solúvel que a sacarose -> usado em balas pra
evitar cristalização (farmacêutica: xarope simples)
- Pectinase: catalisa a hidrólise de substâncias pécticas (presente na parede
celular dos vegetais)
- Substâncias pécticas: polissacarídeos de ácido galacturônico com
ligações alfa-1,4 -> classificados em ácido péctico ou pectina
- Responsável pela consistência/turbidez/aparência dos sucos de fruta
- Reduz viscosidade, aumenta rendimento, reduz tempo de filtração
- Celulase e Hemicelulase: catalisa hidrólise de celulose (alto PM) e
hemicelulose (ramificada, menor que celulose, moléculas variadas), ambas são
fibras insolúveis não digeridas
- Celulase é multienzimática: endoglucanase, exoglucanase,
celobiohidrolase e celiobiase
- Hemicelulase é um grupo genérico: galactanases, xilanases,
xiloglucanases, mananases
- Usadas na extração de suco de frutas

Lipases
- Lipídios como substrato (ésteres de ácidos graxos com álcoois variados)
- Principal: triglicerídeos
- Glicerol esterificado com 3 moléculas de ácidos graxos
- Função: energia e reserva energética
- Modificação enzimática: lipases
- Catalisam a hidrólise de ligações éster, liberando ácidos carboxílicos e
álcoois (em ambiente com restrição de agua podem catalisar esterificação ou
interesterificação)
- Produtos da hidrólise de triglicerídeos:
- Diglicerídeos, monoglicerídeos, ácidos graxos livres, glicerol
- Propriedades:
- pH ótimo: 4-9
- Temperatura ótima: até 70 °C
- Estabilidade: soluções aquosas neutras ou solventes orgânicos
- Não precisa de cofator
- Especificidade:
- Não específicas: catalisam a hidrólise de triglicerídeos de modo aleatório
(produtos: DAG, MAG, glicerol, ácidos graxos livres)
- Específicas (lipases 1,3-específicas): catalisam liberação de ácidos
graxos das posições 1 e 3 dos glicerídeos
- Lipases ácido graxo específicas: catalisam a hidrólisa de tipos
específicos dos ácidos graxos
- Fonte de obtenção: plasma sanguíneo, saliva, suco pancreático ou leite de
animais, plantas oleaginosas e MOs
- Detergente: maior consumidor
- pH: 10-11
- °C: 30-60
- Resistência aos componentes da formulação e baixa especificidade
pelo substrato
- Exemplos: lipolase e lumafast (lipase recombinante)
- Indústria de alimentos: panificação (textura/volume/maleabilidade/coloração),
lacticínios (produção de aroma/acelerar maturação do queijo), produção de
emulsificante
- Indústria farmacêutica: enzimas digestivas, emulsificantes, aromas e
substancias emolientes (cosmético), obtenção de ácidos graxos poli-
insaturados (usado em produtos dietéticos, tratamento de patologias
cardiovasculares/autoimunes/inflamatórias)
- Tratamento de efluentes:
- Pré-tratamento (frigoríficos, abatedouros)
- Objetivo: reduzir carga lipolítica do resíduo (reduz até 60%)
- Vantagens: simples e fácil no controle do processo, independe da
concentração de poluente, usado em amplas faixas de
pH/temperatura/salinidade

Tecnologia de Fermentações
- Processos anaeróbicos que envolve ação de MOs em material açucarado,
formando etanol de CO2
- Agora: processo em que MOs catalisam as transformações de um dado
substrato em um produto desejado
- Fermentação clássica: produção de alimentos e bebidas
- Conhecimento da atividade de MOs, possibilidade de vários substratos, uso
de MOs para produção controlada
- Fermentação industrial: exploração econômica das potencialidades dos MOs
na obtenção de produtos
- Produtos obtidos:
- Biomassa microbiana: produto de células secas de MOs cultivados
em larga escala (usada na alimentação humana e animal, com grande
quantidade de proteínas e vitaminas)
- Alimentos e bebidas: pães, queijos, picles, bebidas alcoólicas
fermentadas
- Enzimas: proteases, amilases, pectinases, hemicelulases/celulases,
lipases
- Vacinas: muitas são produzidas por fermentação bacteriana (usada
o próprio MO ou toxina)
- Metabólitos: MOs que produzem vários metabólitos (aminoácidos,
vitaminas, pigmentos, esteroides, atb, solventes orgânicos, polissacarídeos)
- Energia: etanol, metano
- Depuração da agua, tratamento de efluente, biopesticidas
- Vantagens: diminui custos de produção, fornece substâncias mais fácil e mais
puras, menor carga poluidora, diversos substratos
- Esquema geral de um bioprocesso

1. Microrganismo (engloba MO selecionado, preparo do inóculo)

- Bactérias: onipresentes na natureza, habilidades sintéticas variam entre
espécies autotróficas (precisa de composto inorgânico) e heterotróficas, ricas
em produção de enzima
- Fungos: amplamente espalhados, com metabolismo aeróbio e sendo
divididos entre bolores e leveduras
- Vírus: menores MOs, cultura feita pra testar antivirais e produção de
vacinais
- Temperaturas cardeais: termófilos (60° C), criófilas (10° C) e mesófilas (20-
40 °C)
- Fontes de obtenção: isolamento em recursos naturais, compra em
coleções de cultura, obtenção de mutantes naturais ou MOs recombinantes
- Características desejáveis: fácil cultivo e manutenção, elevada eficiência,
permitir acúmulo de produto no meio, não produzir substâncias incompatíveis,
não ser patogênico, não ser muito exigente
- Preparo do inóculo: etapa laboratorial e industrial
- Inóculo: volume de suspensão de MO de concentração adequada pra
garantir fermentação em dado volume de mosto (meio de cultivo)
- Escala laboratorial: tubos de ensaio, erlenmeyes, frascos
- Escala industrial: germinadores
2. Meio de cultivo (mosto)
- Mosto: todo líquido que pode sofrer fermentação em condições econômicas
- Condições nutricionais: que favorecem crescimento celular
- Aspectos econômicos: relacionados à matéria-prima (custo, sazonalidade,
custo do transporte, estabilidade, armazenamento, fornecedores)
- Escolha do mosto:
- Deve ser adequada a geração do produto de interesse e a atividade
metabólica dos MOs
- Precisa fortificar a matéria-prima com o que falta e retirar o que inibe a
conversão de substrato em produto
- Mosto pode ser obtido por meios naturais (composição química não
definida e complexa) ou sintéticos (substâncias químicas conhecidas)
- Meios sintéticos tem reprodutibilidade dos resultados e fácil
separação porém custo elevado
- Requisitos básicos do mosto:
- Satisfazer necessidades nutricionais dos MOs
- Fornecer condições de acúmulo de produto
- Ter componentes de fácil aquisição e composição uniforme
- Propiciar fácil extração e purificar
- Não ser oneroso
- Composição do mosto:
- Deve proporcionar energia (açúcar ou luz), carbono (as
autotróficas precisam de CO2), oxigênio (aeróbios precisam de O2,
anaeróbicos não precisam), hidrogênio, nitrogênio (amônia ou sais), fósforo,
enxofre, potássio, magnésio, vitaminas e micronutrientes
3. Esterilização e/ou Desinfecção
- Deve ser realizada para todos os equipamentos/mostos/ar usados no
processo de fermentação
- Esterilização: destruição/inativação de todas as formas de vida
microbianas
- Desinfecção: destruição de determinados MOs (reduz/inibe crescimento
mas não esteriliza)
- Agentes físicos: calor úmido (mosto/equipamentos), calor seco, filtração do
ar, pressão, raios UV, radiação ionizante
- Agentes químicos: ácidos ou bases, sais, ozônio, halogênios, álcoois,
éteres, antibióticos
- Esterilização do mosto:
- Objetivo: evitar consumo de nutrientes uteis por MOs contaminantes,
evitar formação de produto de metabolismos de MOs contaminantes que
possam alterar a fermentação
- Tratamento térmico:
- Calor úmido: mais eficiente (promove destruição de proteínas e
dissolve lipídeos, com alta capacidade de penetração), vapor de água sob
pressão), podendo ser de forma direta (injeção do vapor no meio) ou indireta
(via camisas ou serpentinas), podendo ser descontinua (batelada) ou continua
- Batelada: todo conteúdo do biorreator é esterilizado em uma operação só
(mosto e biorreator simultâneo), devendo ter serpentinas e sistema de agitação
de 121-125 °C por 30-40 minutos após preencher o fermentador com mosto
não estéril -> injetar vapor até 121 °C e fechar registro de vapor e injetar água
de refrigeração
- Vantagens: esterilização do meio de cultura e do fermentador ao
mesmo tempo, diminui risco de contaminação na transferência
- Desvantagens: tempo de esterilização é grande (pode decompor
nutrientes termosensíveis), tempo não produtivo muito alto, problemas de
corrosão pelo contato prolongado com o meio aquecido
- Processo contínuo de esterilização: preparo do caldo não estéril pra circular
através de trocadores de calor para aquecer até a temperatura de esterilização
(depois, caldo é recebido no tanque de fermentação previamente esterilizado)
- Vantagens: tempo que o mosto fica em temperatura elevada é
pequeno, ciclos de esterilização curtos (<10min), menor destruição dos
nutrientes, pequena área, fácil limpeza, menor risco de contaminação
metabólica
- Calor seco (160-180 °C de 1 a 2 horas)
- Remoção física: filtração ou centrifugação (caro)
- Esterilização do ar: remoção física ou destruição do MO
- Radiação: apenas UV (220-300nm), baixo poder de penetração
(tempo de exposição longo), alto custo, inadequado pra processo fermentativo
- Aquecimento: calor seco, requer temperatura/tempo elevados na
temperatura de esterilização (resistência dos MOs), reator de grande porte,
usado em laboratórios
- Filtração: mais adequada para altas vazões (baixo custo e
disponibilidade de filtros), usadas em escala industrial e laboratorial, uso de
filtros de lã de vidro/polietileno/silicone
- Esterilização de equipamentos:
- Físicos:
- Calor seco: tubulações, biorreatores com ou sem meio de
cultura
- Calor úmido (estufa >150°C): vidrarias, metais e sólidos
resistentes ao calor
- Radiação UV
- Químicos: limpeza com líquidos ou gases que matam ou danificam
capacidade reprodutiva do MO (hipoclorito, fenóis, formaldeído)
- Menos comum e menos eficientes que calor úmido, usados
em equipamentos que não suportam aquecimento
4. Aparelhagem
- Germinadores ou incubadores: multiplicação dos MOs em escala industrial
- Biorreatores, fermentadores, dornas: ambiente controlado para
crescimento de MO para obter o produto
- Devem ser resistência a corrosão e força mecânica
 - Escala laboratorial: ligas metálicas, aço inoxidável, vidro, plástico
- Escala industrial: aço inoxidável
5. Processo fermentativo
- Descontinuo simples (batelada)
- Adição de mosto esterilizado e MO na dorna no início da fermentação
sem adição de substrato e retirada de produto até final da fermentação (tempo
morto para carga, descarga, lavagem e esterilização)
- Método antigo, simples, empregado em alimentos, bebidas,
medicamentos
- Processo fechado (sem contaminação), pode adicionar ar,
antiespumantes, controle de pH
- Descontínuo alimentado
- Um ou mais nutrientes são adicionados ao fermentador durante o
cultivo, permanecendo até final da fermentação
- Usado para obter antibióticos, aminoácidos, enzimas
- Introduz MO, seguindo de adição gradual do mosto, sem retirar nada
- Contínuo
- Adição do meio de cultura e retirada do caldo, tendo volume e
concentração constante
- Não tem tempo morto, pode ser operado por longo período de tempo
- Vantagem: maior produtividade, obtém caldo bioprocessado uniforme
- Desvantagem: maior investimento, possibilidade de mutação
genética, sistema aberto (contaminação)
- Semicontínuo
- Após final da fermentação, parte do caldo é retirado para separar
produto, adicionando ao biorreator mesmo volume de meio de cultura para
adicionar o substrato (meio fermentado serve de inóculo pro mosto)
- Obter antibióticos
- Reduz tempo ocioso e reduz custo da produção
- Pode ser fermentação em
- Estado líquido: superfície ou submerso
- Presença de grande quantidade de água
- Vantagens: controle de pH/temperatura/oxigênio/produto/substrato
- Superfície: biomassa na superfície do meio liquido, em contato com
o ar que fornece oxigênio pra produção microbiana, transferindo nutrientes por
difusão
- Submerso: MO se desenvolve no interior do meio de fermentação
(agitado), oxigênio suprido por compressores, é a maioria, é melhor por poder
ter maior volume de meio e absorção de nutrientes mais eficiente
- Estado sólido
- MOs sobre ou no interior de partículas em matriz solida
- Suporte sólido pode atuar como fonte de nutrientes
- Substratos agrícolas: arroz, trigo, milho, soja
6. Separação de produto e subproduto
- Recuperação e purificação
- Downstream processing
- Alta qualidade e velocidade do produto final, taxa de recuperação
eficiente, baixo custo
- Etapas da purificação dependem:
- Localização do produto: intra ou extracelular
- Características FQ do produto: tamanho, densidade, carga elétrica
- Características FQ do meio: viscosidade, densidade, impurezas
- Aplicação final do produto: grau de pureza, técnicas mais elaboradas
e custo
7. Tratamento de efluentes
- Das águas residuais que vem de incorporação no meio de cultivo,
lavagem de equipamentos, águas de sistemas, etc -> contaminadas por
resíduo
- Resíduos de composição variada, complexos (níveis de tratamento)
- Pode ser método físico (gradeamento, peneiramento, separação,
flotação), químico (produtos químicos, precipitação), biológico (lodo ativado) ou
combinação

Biofármacos
- Moléculas complexas de alto PM obtidas de fluidos biológicos/tecido de
origem animal/procedimentos biotecnológicos pela manipulação ou inserção de
DNA recombinante ou alteração de genes
- Exemplos: vacinas, soros, anticorpos monoclonais, citocinas, hormônios de
crescimento, células para transplante
- Principais representantes:
- Hormônios: insulinas, hormônios de crescimento
- Citocinas: interferons (alfa, beta, gama), eritropoietina (citocina), fator de
crescimento de colônias de granulócitos, interleucinas
- Heparinas: produto biológico não proteico (mistura de açúcares) extraída
da mucosa intestinal de porcos
- Trombolíticos: dissolução de trombos
- Fatores anti-hemofílico: para coagulação do sangue
- Anticorpos monoclonais: glicoproteínas produzidas por um único clone de
linfócitos B
- Medicamentos imunobiológicos: soros hiperimunes, vacinas
- Relevância clínica:
- Imunização ativa/passiva artificial: vacinas e soros hiperimunes
- Alternativas para tratamento de doenças: DM, CA, asma, dermatite,
Crohn, fibrose cística, lúpus, etc
- Condições agudas e cardiovasculares: tromboembolismo, IAM, AVC
- Diagnóstico: anticorpos monoclonais
- 1970: DNA recombinante -> 1982: inuslina recombinante humana (1º
biofármaco aprovado) -> 1986: 1º anticorpo monoclonal para rejeição de
transplante
- Biofármacos:
- Medicamentos produzidos por biossíntese em células vivas e de alta
complexidade estrutural
- Maior fonte de inovação da indústria farmacêutica (diversos produtos)
- Biofármacos blockbusters: de grande sucesso (adalimumab, rituximab,
insulina glargina, etc)
- Diferença entre medicamentos sintéticos e biofármacos:
- Origem, complexidade, tamanho, replicação, estabilidade, via de adm.,
aplicação clínica, custo de produção, imunogenicidade
- Problema da imunogenicidade:
- Macromoléculas: proteínas/glicoproteínas -> potencial
imunogênico
- Intensidade variável e imprevisível (pode ter redução de
eficácia, alteração farmacocinética, reação de hipersensibilidade, quebra de
tolerância imunológica)
- Ensaios clínicos devem ter avalição do potencial imunogênico

- Replicação de biofármacos
- Medicamentos sintéticos são mais fáceis de criar cópias com alto grau
de pureza (genéricos e similares)
- Biofármacos tem alta complexidade estrutural (ás vezes não é totalmente
conhecida)
- Produzidos em sistemas vivo e sujeitos a micro-heterogeneidade
(variações entre moléculas do P.A. que são inevitáveis) -> não pode ter réplica
- Biossimilares: cópias autorizadas após expiração da patente
- Mesmo perfil molecular com evidência que não há diferença clínica
significativa
- Desenvolvidos por estudos de comparabilidade (qualidade,
eficácia, segurança) -> comparação direta do candidato a biossimilar com o
produto referência já aprovado pelos mesmos estudos e procedimentos
- Produtos biológicos não são intercambiáveis (custo 65-85% do
originador -> redução menos pronunciada em relação aos genéricos químicos)
- Biofármaco ideal
- Alta afinidade pelo alvo e alta atividade e estabilidade no pH do corpo ->
planejamento de bio-betters por modicação pós expressão (aumentar ½ vida,
reduzir toxicidade e imunogenicidade, etc)
- Baixa taxa de eliminação quando por IV
- Baixa resposta imunológica e pouca inativação dos constituintes dos
fluidos
- Tecnologias da produção de biofármacos
- Tecnologia do DNA recombinante
- Modificação direta do genoma do organismo alvo pela introdução de
DNA exógeno com função conhecida
- Síntese proteica: transcrição do DNA -> RNAm -> tradução -> proteína
- Modificações pós-traducionais (MPT): modificações covalente após
síntese da proteína (exemplos: clivagem, glicosilação, fosforilação, etc) ->
fazem dobramento, transporte, direcionamento ao alvo
- Tecnologia de anticorpos monoclonais (fusão celular ou hibridomas)
- Antes disso, os anticorpos eram isolados do soro sanguíneo
(produzidos por clones de LB) que reagiriam com vários epítopos do antígeno
(anticorpos policlonais) -> baixa pureza
- Anticorpos monoclonais são de um único clone de LB -> localizam o
antígeno de forma especifica e precisa
- Aplicação na oncologia, doenças auto-imunes, rejeição de
transplante, teste diagnóstico
- Hibridomas: células conjugadas produzidas pela fusão de linfócitos
humanos com célula de mieloma
- Produção de biofármacos
- Upstream processing: construção do DNA recombinante de interesse e
desenvovlimento da linhagem celular (seleção do clone que produz a proteína
de interesse)
- Cultivo celular em biorreatores: expansão celular (garrafas, frascos,
erlenmeyers sob agitação) e produção de biofármaco (biorreatores de grande
escala, feito por batelada ou contínuo)
- Downstream processing: isolamento da proteína pura para purificação do
biofármaco (filtração, rompimento celular, ultrafiltração, métodos
cromatográficos) -> 80% do custo de produção
- Formulação: formulação e envase para comercialização (adição de
estabilizadores)
- Classificação de gerações
- 1ª geração: proteínas com sequência de aminoácidos idêntica as
proteínas nativas de um corpo sadio (usado pra reposição de nível circulante)
- 2ª geração: versões modificadas para propriedades terapêuticas
melhoradas (ação mais rápida ou lenta, alterar tempo de ½ vida, alterar
imunogenicidade)