PRÁTICA 2 –TERMOESTABILIDADE DA ENZIMA α-AMILASE

Introdução
As enzimas são moléculas de proteína bastante grandes e complexas que agem
como catalisadoras em reações bioquímicas (IT Alfa Amilase, 2010).
As amilases são enzimas que catalisam a hidrólise de ligações α-1-4 glicosídicas
de polissacarídeos, como glicogênio, amido ou seus produtos de degradação. Sobre o
amido, atuam liberando diversos produtos, incluindo dextrinas e progressivamente
pequenos polímeros compostos de unidades de glicose. Produzida na saliva e no
pâncreas, a amilase também é produzida por diversos fungos, bactérias e vegetais (IT
Alfa Amilase, 2010).
As amilases são divididas em dois grupos: as endoamilases e exoamilases. As
endoamilases catalisam hidrólises de forma aleatória no interior da molécula do amido.
Essa ação causa a formação de ramos lineares de oligossacarídeos de cadeias de
vários comprimentos e dessa forma quebram as ligações glicosídicas α-1,4 presentes
na parte interna (endo) das cadeias de amilose ou amilopectina. A α-amilase é a
endoamilase mais conhecida. As exoamilases hidrolisam exclusivamente ligações
glicosídicas α-1, 4, como a β-amilase ou ambas as ligações α- 1,4 e α-1, 6, como
amiloglicosidase e glicosidase. Outros exemplos de exoamilases são a ciclodextrina
glicosiltransferase e a α-amilase maltogênica (IT Alfa Amilase, 2010).
A Amilase, como todas as outras enzimas, funciona como um catalisador, ou
seja, não é alterada pela reação, mas a torna mais fácil, reduzindo a quantidade de
energia necessária para que ocorra. A Amilase digere os amidos catalisando a hidrólise,
que é a quebra feita pela adição de uma molécula de água. Desta maneira, o amido
mais a água se torna em maltose (que é o equivalente a duas moléculas de glicose
unidas). Outras enzimas então fracionam a maltose em glicose, que é absorvida pelas
paredes do intestino delgado, e depois de ser levada para o fígado é usada como
energia (IT Alfa Amilase, 2010).
Além de catalisar a quebra de moléculas de amido, a Alfa-Amilase Fúngica é
uma multi-enzima capaz de fazer mais de 30 funções enzimáticas, entre elas a quebra
de moléculas de gordura e proteína. Também é capaz de converter uma quantidade de
amido em maltose 450 vezes maior que seu próprio peso. A α-Amilase catalisa a
hidrólise de gorduras, transformando-as em glicerol e ácidos graxos, as proteínas em
proteoses e derivados do amido em dextrina e açúcares mais simples. Possui pH de
atividade próximo de 7,0 (IT Alfa Amilase, 2010).
Objetivo
Estudar a termoestabilidade da enzima α-amilase.

Metodologia
Inicialmente deve-se preparar as soluções necessárias para realização dos
experimentos:
• Tampão citrato pH 5,0 (0,1 M);
• Solução de amido gelatinizado (1%);
• Solução enzimática;
• Fase móvel de ácido perclórico (5 mM).

Condução da reação
Primeiramente o extrato enzimático deve ser submetido a aquecimento em
banho-maria a 60, 80 e 100 °C, onde amostras de 50 μL de extrato devem ser coletadas
15, 30, 60, 90 e 120 min. A reação com a enzima deve ser conduzida utilizando 2 mL
de solução de amido gelatinizado (1 %), 50 μL de extrato enzimático de α-amilase e 100
μL de tampão citrato pH 5,0 (0,1 M) a 50 °C durante 15 min. Após este período, 1000
μL do sobrenadante reacional deverá ser transferido para microtubo eppendorfde,
centrifugado a 8.000 rpm por 5 min. Caso a quantificação dos açúcares não seja feita
imediatamente, deve-se armazenar a -18 °C. Deve-se fazer o branco da solução de
amido que está sendo hidrolisado.
A técnica para a quantificação da concentração dos açúcares será a
cromatográfica líquida de alta performance (HPLC - High Performance Liquid
Chromatography). Após o término das reações as amostras deverão ser preparadas
previamente (como mencionado anteriormente), o sobrenadante deverá ser diluído 20
vezes e filtrado utilizando filtros Merck Millipore Express™ de nylon com porosidade
0,22 μm para então ser injetado no HPLC. Será utilizado cromatógrafo ©Shimadzu,
modelo Prominence, com coluna Shim-pack SCR 102HG protegida por pré-coluna SCR
102HG. As substâncias serão visualizadas a partir dos detectores de índice de refração
(RID-20A) e UV-VIS (SPD-20A), mantendo temperatura do forno em 50 °C e fluxo da
fase móvel de ácido perclórico 5 mM em 0,600 mL.min-1.

Referências Bibliográficas
IT Alfa Amilase, ALFA AMILASE, Embrafarma, Pharmaceutical Expertise, 2010.