BIOQUÍMICA ANIMAL PROF(A).

ALINE
AULA PRÁTICA - 5
DISCENTE:__________________________________________________________
Enzimas

Roteiro

A atividade enzimática pode ser avaliada medindo-se a velocidade de consumo do substrato

ou a velocidade de aparecimento do produto. Esta atividade depende de vários fatores, tais
como o tempo de reação, a concentração da enzima, a concentração do substrato, a
temperatura, o pH do meio e a presença de cofatores e/ou inibidores.

Para exemplificar estes conceitos, nesta aula prática será avaliada a atividade da amilase
salivar. A α-amilase é encontrada nos animais (sangue, saliva e suco pancreático), plantas,
fungos e bactérias. Esta enzima é um endo-amilase e hidrolisa as ligações glicosídicas do
amido, glicogênio, poli e oligossacarídeos ao acaso. Como resultado da ação não ordenada
da amilase salivar, obtém-se rapidamente uma mistura complexa de produtos de
hidrólise que incluem: amido solúvel, maltodextrinas, maltoses e, eventualmente,
glicose. Na boca, a amilase salivar tem participação na digestão de carboidratos. A
amilase pancreática é a maior responsável pela digestão glicídica no duodeno. Esta
enzima é também normalmente encontrada no soro e a elevação de sua atividade
enzimática sérica pode auxiliar no diagnóstico de diversas patologias pancreáticas
(obstrução, tumores, pancreatite aguda, etc).

O amido é composto pela amilose (não-ramificada) e amilopectina (ramificada). A amilose

forma micelas hidratadas que adsorvem IODO, presente na solução de lugol, em suas
espirais helicoidais, apresentando coloração azul-violeta.

Existem, no mínimo 4 isoenzimas da amilase no plasma de cães e 7 nos humanos. Existe

amilase em vários tecidos (glândulas salivares, cérebro e pulmão) exceto no fígado. Seu
nível é 6 vezes maior no pâncreas e no duodeno do que nos outros tecidos.
A elevação da amilase no plasma é indicativo de pancreatite em cães, obstrução intestinal,
falha renal, obstrução urinária, neoplasias do pâncreas, obstrução das glândulas salivares e
administração de drogas (cortisol, opiáceos). Também pode aparecer amilase na urina nos
casos de pancreatite, lesões das glândulas salivares e insuficiência renal.
Vários tecidos, como intestino, rins e útero, apresentam atividade de amilase, e, por isso,
os pesquisadores preferem considerar que o diagnóstico de pancreatite em cães seja dado
só quando o valor ultrapassar 3 ou 4 vezes os valores de referência.
Objetivos:

1. Avaliar a ação da amilase salivar sobre o seu substrato (amido);

2. Determinar a alfa-amilase no plasma.

Reação 1

Preparação da Amostra: amilase salivar: coletar aproximadamente 3mL de saliva filtrada

em gaze e fazer uma diluição com solução salina (NaCl 0,9%) na proporção de 1:10.

Procedimento: Preparar 2 tubos de ensaio contendo 1 colher pequena de amido como

substrato, em seguida, adicione ao tubo 1 água destilada e ao tubo 2 a enzima (solução de
saliva diluída), homogeneizar por 1 minuto com suaves agitações casuais.

Adicionar uma gota de lugol e agitar.

Observar e comparar os resultados.

Explicar a reação.
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Reação 2

Amostra: plasma obtido livre de hemólise.

Reagente: substrato tamponado.

Procedimento: Adicionar em um tubo de ensaio 1mL do substrato tamponado e colocar em

banho-maria a 37ºC por 3 minutos, adicionar 20µL da amostra e colocar em banho-maria
por mais 5 minutos. Transferir o conteúdo para cubeta e fazer a leitura inicial disparando
simultaneamente o cronômetro. Repetir as leituras após 30seg, 60seg e 1:30seg.

Calcular a média das diferenças de absorbância por minuto e utilizar para cálculo do
resultado.

Condições da reação: leitura em 405nm.

Resultados:

Tempo 0:________

Tempo 1 (30seg):_______

Tempo 2 (60seg):_______

Tempo 3 (1:30seg):______
Tempo 3 – Tempo2 =______

Tempo 2 – Tempo 1 =______

Tempo 1 – Tempo 0 =______

Média das absorbâncias:___________

Cálculo:

Amilase (U/L) = médias das absorbâncias X 3954

Resultado :_____________

Valor de Referência para Humanos

Amilase Plasma: < 125U/L

Questionário

1. Explique como a concentração de substrato pode interferir na velocidade da

reação.
2. Faça um gráfico, que evidencie o efeito da temperatura na atividade enzimática.
3. Explique por que a desnaturação implica na perda da atividade enzimática.
4. O que são enzimas?
5. Como as enzimas são aplicadas na área médica e médica veterinária?
6. Desenhe e identifique os componentes de uma reação enzimática.
7. Conceitue COFATOR e COENZIMA.
8. Quais os fatores que alteram a atividade das enzimas?
9. Defina “pH ótimo” e “temperatura ótima”.
10. Qual o conceito de “sítio ativo”?
11. Como as enzimas se classificam? Quais são as classes e tipos de reações que
catalisam?
12. Quais as propriedades das enzimas?
13. Conceitue: (a) estado de transição e (b) energia de ativação.
14. Conceitue Km e explique a afinidade da enzima pelo substrato em relação ao Km.
15. O que você entende por Vmáx?
16. Qual o efeito da concentração enzimática na velocidade da reação?
17. Cite os tipos de inibição enzimática e explique a diferença entre eles.
18. O metanol, por ação da enzima álcool desidrogenase, é convertido a formaldeído, um
produto extremamente tóxico. A intoxicação por metanol pode ser tratada por
ingestão de doses elevadas de etanol. Como se justifica essa terapia?
19. Quais os modelos de interação enzima-substrato? Explique.