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Determinao de diversos compostos em bebidas por cromatografia de alta

eficincia (HPLC)
Simes, Filipa; Moreira, Filipe; Lobo, Gerson
Licenciatura em Bioqumica, Bioqumica Experimental I, Turma n2, Grupo n4,
DQB/FCUL, Campo Grande Ed. C8, 1749-016 Lisboa)
Resumo
Com este trabalho experimental pretendeu-se identificar a presena de
diversos compostos (benzoato de sdio, sacarina e cafena) em trs amostras de
bebidas, nomeadamente ch, caf e coca-cola. Para isso, recorreu-se tcnica de
cromatografia de alta eficincia, tambm conhecida por HPLC, sendo tambm
possvel, recorrendo ao mtodo do padro externo, a determinao do teor em
cafena.
A partir da cromatografia utilizada detectou-se a presena de sacarina e
cafena na coca-cola; de cafena no ch e de cafena na amostra de caf. A nica
amostra padro que no foi possvel identificar por comparao dos tempos de
reteno foi o benzoato de sdio.
Quanto determinao da concentrao de cafena em cada uma das amostras
analisadas, recorreu-se anlise quantitativa, que teve em conta as diferentes
diluies a diferentes concentraes. Construiu-se assim uma curva de calibrao da
rea do pico em funo da concentrao dessas solues - mtodo do padro
externo. Mtodo este usado para calcular o teor de cafena em cada bebida. Verificou-
se pois que a ordem pela qual a bebida que apresenta o maior teor em cafena o
caf (0,29 mg/mL), seguida da coca-cola (0,146 mg/mL) e finalmente do ch (0,813
mg/mL), obtendo-se valores ligeiramente inferiores aos tabelados, possivelmente
devido s diferenas intrnsecas s diferentes marcas de cada produto analisado.

Introduo
A cromatografia lquida de alta eficincia (HPLC) consiste numa fase mvel
(normalmente constituda por uma mistura de solventes) que transportam a amostra
em anlise atravs de uma coluna cromatogrfica, a interaco entre os analitos em
estudo e a coluna determinam a forma como a separao dos vrios analitos ocorre.
Depois de feita a separao a fase mvel conduz os analitos ate um detector que
2

normalmente UV/Vis embora detectores diferentes como os de ndice de refraco
possam ser utilizados.
Existem vrios factores que influenciam a anlise por HPLC, no entanto os
mais importantes so a composio da fase mvel e o tipo de coluna (factores como a
temperatura, fluxo e modo gradiente ou isocrtico, so utilizados na fase de
optimizao de mtodo cromatogrfico).
As primeiras colunas cromatogrficas eram constitudas por partcula de slica
que podiam ou no ser revestidas por diferentes compostos para lhe conferirem
diferentes capacidades separativas. Hoje em dia estas colunas so ainda as mais
utilizadas, no entanto j existem no mercado colunas de base polimrica e que so
utilizadas em gamas de pH mais extremas onde no possvel utilizar slica.
As colunas podem classificar-se em dois grupos: as de fase reversa (C
8
, C
18
),
falando-se em cromatografia de fase reversa, e as colunas de fase normal (slica,
NH
2
), falamos ento de cromatografia de fase normal.
As colunas de fase reversa utilizam-se para separar compostos neutros e a
fase da coluna hidrofbica. Solventes como o acetonitrilo, o metanol e as solues
tampo so usadas como fase mvel.
As colunas de fase normal utilizam-se para amostras em que o analito
hidrofbico sendo a fase estacionria polar e usando para a fase mvel solventes
como o n-hexano, n-heptano ou isopropanol.
Os dois principais mecanismos de separao desta tcnica so a interaco
composto-coluna e a velocidade a que esta interaco ocorre.
Em fase reversa a interaco ocorre entre os grupos funcionais que revestem a
fase estacionria da coluna (normalmente grupos octilsilano C
8
e octadecilsileno
C
18
).
A velocidade a que este mecanismo ocorre tem a ver com a composio da
fase mvel. Fases mveis com grande quantidade de meio aquoso produzem
cromatogramas com tempos de reteno mais elevados. Se aumentarmos a
concentrao de solvente orgnico reduz-se o tempo de anlise. Factores como o pH
da fase mvel podero tambm ter que ser considerados para alguma separao
cromatogrfica.
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Em fase normal quando se esta em presena de colunas polares e eluentes
apolares os mecanismos que se estabelecem para a separao cromatogrfica
baseiam-se na capacidade de se estabelecerem mecanismos de adsoro.
A tabela seguinte mostra por que razo compostos como a acetona, DMF e
DMSO no so utilizados em fases mveis. Os seus cutoff situam-se numa zona de
mximo de absorvncia de um grande nmero de compostos. J a agua e o
acetonitrilo, com mximo a 200 e 190 respectivamente, situam-se numa zona do
espectro onde um nmero muito reduzido de substncias possui absorvncia.
Tabela 1- Absorvncia dos solventes
Solvente UV (nm) Cutoff @ 1AU
cido actico 230
Acetona 330
Acetonitrilo (ACN) 190
Dimetilformamida (DMF) 268
Dimetilsulfxido (DMSO) 268
Dioxano 215
Etanol (EtOH) 210
Metanol (MeOH) 205
N-propanol 210
Iso-Propanol (IPA) 210
Tetrahidrofurano (THF) 215
Agua (H
2
O) 210









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Parte experimental








Pesou-se 1 mg de
sacarina, de
aspartame e de
benzoato de sdio
para bales de 5 mL e
aferiu-se com eluente
Pesou-se 25 mg de
cafena para um balo
de 100 mL e afereiu-se
com a fase mvel
Peprarou-se 5 padres
de cafena diluindo
1,5,10 e 20 mL em
bales de 25 mL.
Aferiu-se com o
eluente
Mediu-se 1 mL de caf
para um balo de 50
mL e aferiu-se com o
eluente
Usou-se um saco de
ch em 500 mL de
gua fervente. Mediu-
se 4 mL para um balo
de 20 mL e aferiu-se
com o eluente
Mediu-se entre 10 a 15
mL de pepsi para um
gobelet e usou-se o
ultra-sons para
desgaseificar a bebida
Aps a
desgazeificao
mediu-se 8 mL para
um balo de 20 mL e
aferiu-se com o
eluente
Filtraram-se as
amostras sob presso
com um filtro de
membrana
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Tratamento de dados

Tempos de Reteno
Tabela 2: Tempos de reteno das amostras padro
Amostras Padro Diluio Tempo de Reteno (min)
Benzoato de Sdio - 15,88
Sacarina - 4,12
Cafena 1 1/25 11,60
Cafena 2 2/25 11,78
Cafena 3 5/25 11,75
Cafena 4 10/25 11,75
Cafena 5 20/25 11,67

Como se prepararam vrias amostras padro de cafena, torna-se necessrio
calcular o valor mdio do t
r
deste padro, sendo ele dado por:

( )

possvel identificar os compostos anteriormente enunciados na tabela nas
amostras estudadas (caf, coca-cola e ch) por comparao dos tempos de reteno
lidos a partir dos cromatogramas.
No caso da coca-cola, verificou-se que ao maior pico do cromatograma
corresponde um t
r
(tempo de reteno) de 11,92 min. Por comparao com a tabela 1
conclui-se que a coca-cola constituda por cafena. No cromatograma desta bebida
possvel observar um pico menor, com um t
r
= 4,44 min. Assim, do mesmo modo se
conclui que a sacarina outro componente da coca-cola.
Para o ch apenas se detectou um pico evidente, com um t
r
de 11,63 min. Isto
significa que este ch tem cafena na sua composio, o que de esperar dado que o
ch usado foi ch preto.
Por fim, no cromatograma da amostra de caf so visveis diferentes picos,
destacando-se um maior ao qual est associado um t
r
de 11,62 min. Os restantes
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picos no tm valores de tempos de reteno que possam ser comparados com a
tabela 1.
Note-se que de todos os padres preparados o benzoato de sdio foi o nico
que no foi detectado nas amostras de ch, coca-cola e caf, uma vez que nenhum
dos picos presentes nos respectivos cromatogramas tinha a ele associado um valor de
t
r
igual ou semelhante a 15,88 min.
Observando todos os cromatogramas, presentes em Anexo conclui-se acerca
da sua resoluo. Os cromatogramas tm uma boa resoluo quando tm uma boa
selectividade e um alargamento de banda pequeno.
Neste caso em particular, verifica-se que todos eles tm um alargamento de
banda pequeno e, no geral, uma boa selectividade. Para o cromatograma da amostra
do caf pode ser considerado que a selectividade relativamente pior, j que os picos
esto prximos, no entanto so perceptveis, o que permite concluir que se trata de um
cromatograma com uma boa resoluo.
Por comparao dos valores de t
r
de cada constituinte das amostras com o valor
de t
r
obtido para a cafena padro, pode-se aferir que todas as amostras possuem
cafena na sua constituio, correspondendo esta apenas ao ltimo pico de cada
amostra tabela 3.

Tabela 3 : Tempos de reteno (tr) e reas dos picos correspondentes identificao da cafena
nos cromatogramas das amostras preparadas a partir de diversas bebidas (ch, caf e coca-cola).
Bebida t
r
/min
pico
/mm
2
t
r
(padro
de
cafena)/min

Composto
identificado
Caf 11,62 50000000
11,72
Cafena
Ch 11,63 8271500 Cafena
Coca-
Cola
11,92 21197000 Cafena

Tendo em conta a tabela 3 , observa-se que os tempos de reteno no
coincidem totalmente, podendo esta discrepncia dever-se ao erro inerente ao
aparelho de medio.

Utilizando o mtodo do padro externo, foi possvel determinar a concentrao
de cafena em cada uma das amostras. Construiu-se para tal uma curva de calibrao
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por regresso linear, atravs do mtodo dos mnimos quadrados, a partir da
representao grfica da rea dos picos em funo da correspondente concentrao
de cafena.
Sabendo que para a soluo me se diluiram 25,5 mg de cafena em 100 mL de
eluente, calculou-se a concentrao de cafena presente em cada soluo diluda de
padro de cafena:

Sabendo que para a primeira soluo se dilui 1mL (V
i
) de soluo me de
cafena em 25mL (V
f
) possvel determinar a concentrao da soluo preparada.

Procedendo-se de forma anloga para as restantes diluies efectuadas, as
concentraes calculadas so apresentadas na tabela 4.


Tabela 4- concentrao das solues obtidas por diluio da soluo me de cafena (0,25mg/mL), e
respectivos tempos de reteno (tr) e rea do pico.
Diluio V
soluo me

[Cafena]
(mg/mL)
T
r

rea do
pico
1 1 0,01 11,6 4216100
2 2 0,02 11,78 9733400
3 5 0,05 11,75 21891000
4 10 0,1 11,75 27070000
5 15 0,2 11,67 37968000


De modo a determinar a concentrao de cafena nos 3 compostos analisados
por HPLC, aplicou-se o mtodo do padro externo, relacionando-se graficamente
(grfico I) as reas de cada pico com as concentraes de cafena conhecidas (tabela
4). Obtm-se pois a curva de calibrao representada na figura 1.

8


Figura 1-Curva de calibrao referente ao mtodo do padro externo, obtida por regresso linear
atravss a partir da represCurva de calibrado do padro externo, obtida porntao grfica dos resultados
da tabela

Neste caso, confirma-se a existncia de linearidade entre as grandezas em
estudo pois o R
2
obtido 0,892 (valor prximo de 1, correspondente s correlaes
perfeitas).
Utilizando os valores das reas dos picos de cafena de cada amostra,
determinou-se a concentrao (x), substituindo-se y pelas reas obtidas nos
cromatogramas.

No caso da amostra de ch substitumos o valor de y e obtm-se:

y = 2E+08x + 8E+06
R = 0.892
0
5000000
10000000
15000000
20000000
25000000
30000000
35000000
40000000
45000000
0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25

r
e
a

d
o

p
i
c
o

U
A

[Cafena] (mg/mL)
Series1
Linear (Series1)
9

Tabela 5- concentrao de cafena de cada uma das amostras estudadas, em funo das respectivas
reas de pico e tempos de reteno.
Amostra [cafeina]/(mg/mL)
caf 0,2100
cha 0,0014
coca-cola 0,0660

Como as amostras so preparadas atravs de diluies necessrio recalcular a
concentrao de cafena nas bebidas em estudo.

Sabendo que

E sabendo tambm que, por exemplo, para o ch foram utilizados 4 mL num
volume final de 20 mL, tiramos que:

Sabendo que esta concentrao est contida numa solulo de 500mL,
multiplica-se este volume com a respectiva concentrao, para calcular a massa total
de cafena presente em soluo.

Tendo uma massa inicial de 1,5g, torna-se, ento, possvel calcular o teor real
de cafena presente no equivalente a uma saqueta de ch.

()

Efectuando os mesmos clculos para as restantes amostras, obtemos o quadro
seguinte.

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Tabela 6 Concentraes originais de cafena nas amostras
Amostra
[Cafena]
(mg/mL)
Volume final da
soluo (mL)
Volume inicial da
amostra (mL)
[Cafena] Inicial
(mg/mL)
Teor cafena
(mg
cafena
/g
amostra
)
Ch 0,0014 20 10 0,007 2,33mg/g=0,2%
Coca-Cola 0,0660 20 8 0,165 0,17mg/g=1,7%
Caf 0,2100 50 1 10,5 52,42mg/g=5,2%

Pela observao da tabela 6, verificamos que o caf a bebida que contem
uma maior concentrao de cafena.



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Concluso

Este trabalho teve como objectivo principal a identificao da presena de
cafena em amostras tais como caf, ch e coca-cola, bem como o seu teor nestas
bebidas.
Aps o seu estudo por HPLC, foi realizada uma anlisa dos cromatograma
obtidos. Por comparaao dos tempos de reteno de cada pico obtido com o tempo de
reteno obtido para o padro de cafena, verifica-se a existncia de um pico a que
corresponde um t
r
caracterstico da cafena em todas as amostras, confirmando assim
a sua presena em cada uma das bebidas. Para a sacarina verifica-se a existncia de
um pico na coca-cola e para o benzoato de sdio no se verifica qualquer pico nas
trs amostras.
Em seguida recorreu-se ao mtodo do padro externo para determinar o teor de
cafena de cada amostra de bebida. Para tal, construiu-se uma curva de calibrao a
partir da representao grfica das reas dos picos em funo da concentrao de
cafena (mg/mL). Assim, tendo por base a equao da recta obtida, conhecendo-se as
reas correspondentes ao pico da cafena, assim como as diluies efectuadas na
preparao de cada amostra, concluiu-se que a bebida mais concentrada em cafena
o caf (10,5), seguida da coca-cola (0,165) e finalmente o ch (0,007).
Relativamente ao teor de cafena presente em cada amostra, verificou-se que o
caf apresenta a maior percentagem de cafena em mg
cafena
/g
amostra
(5,2%).
Apesar de os resultados obtidos serem ligeiramente diferentes dos tericos,
subestimando a concentrao de cafena, possivelmente por estes valores
dependerem da marca e do modelo do produto testado (podendo se assim explicar a
diferena mais significativa do valor obtido para o ch), foi possvel determinar a
ordem relativa esperada de concentrao em cafena das bebidas.


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Bibliografia
Reversed phase HPLC application guide, Macherey-Nagel
Braga Morais, Zilda; Mtodos cromatogrficos, licenciatura em anlises clinicas
e de sade pblica, Escola Superior de Sade Egas Moniz, 2008-2009


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Anexos





Figura 1- Cromatograma coca-cola e ch
Figura 2- Cromatografia da sacarina e da cafena padro 1
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Figura 3- Cromatogramas da cafena padro 2 e 3

Figura 4- cromatogramas da cafena padro 4 e 5