CHROMA CLASS

THIAGO MAGON

cuida d os co m a
coluna na
cro m at ogr af ia
líquida

DETALHES QUE VÃO FAZER A DIFERENÇA

NO SEU DIA-A-DIA ANALÍTICO
O Chroma Class nasceu com o propósito de
levar o conhecimento para as pessoas,
somos pesquisadores, desenvolvemos
métodos para ajudar a criar um mundo
melhor e uma ciência mais colaborativa.

Hoje apresentamos um método capaz de

conectar não apenas moléculas, mas
também pessoas. Criamos conexões, uma
conexão que não liga apenas o Thiago e o
Bruno, mas sim uma conexão que liga a
ciência às pessoas, uma conexão que liga
você com o mundo!

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 SUMÁRIO

INTRODUÇÃO 04

EQUILIBRANDO A COLUNA 05

LIMPEZA DE COLUNAS 06

FLUSH 08

SOLVENTES LIMPEZA x COLUNAS 08

CONCLUSÃO 10

PERGUNTAS FREQUENTES EM HPLC 11

REFERÊNCIAS 13

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 INTRODUÇÃO

A vida útil de uma coluna cromatográfica está diretamente

relacionada com os cuidados implementados pelo usuário, no uso
do sistema. Não apenas com uso, mas também com a limpeza e
com o armazenamento da coluna. Porém, é necessário levar em
consideração que a coluna tem uma vida útil limitada e em um
determinado momento não será mais possível recuperá-la.

A maioria das colunas suportam entre 500 e 3.000 injeções sem

apresentar problemas, mas há relatos de casos de colunas que
foram danificadas após 30 injeções, bem como colunas que
aguentaram (mostrando eficiência) 12.000 injeções. Tudo isso
depende da maneira como a coluna cromatográfica é usada e
muito mais que isso, como ela é cuidada.

Detalhes que são essenciais para o dia-a-dia analítico, como:

cuidados com a qualidade de solvente no preparo da fase móvel,
cuidados com a qualidade dos aditivos, cuidados com a filtração
da fase móvel, cuidados com o preparo e limpeza das amostras,
cuidados com os limites de pH da coluna, cuidados com os limites
de volume de injeção da coluna, entre outros detalhes que vamos
alinhar durante o decorrer desse guia de limpeza de colunas.

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04
 EQUILIBRANDO A COLUNA

Toda coluna cromatográfica precisa do equilíbrio químico com a

fase móvel para atingir o resultados de separação esperado. A
ativação da coluna cromatográfica nova e a mudança de fase
móvel precisa de 15 a 20 volumes da coluna para estabelecer o
equilíbrio físico-químico. Você sabe como calcular o volume de
uma coluna e o tempo mínimo de equilíbrio?

Segue exemplo:

Coluna de dimensões de 100mm x 4.6mm (comprimento x

diâmetro)

Volume = π x r² x C = π. (4,6/2)² x 100 = 1661 mm³

1mm³ = 1µL
Então, temos volume da coluna = 1661 µL
1µL = 0,001mL
Então, temos volume da coluna = 1,66mL

A uma vazão de 1mL/min

Tempo de equilíbrio (20Vol) ≅33 minutos
Baixe outro exemplo clicando AQUI

Vamos considerear 20 volumes da coluna para o equilíbrio

completo do sistema e para que não tenha variação entre injeções,
ok? Ainda assim, a maneira mais clara de observar que tudo está
equilibrado é fazendo duas injeções de uma mesma amostra e
observar se o tempo de retenção é o mesmo entre as injeções.

Caso o tempo de retenção não seja o mesmo entre as duas

injeções, considere aumentar o tempo de equilíbrio ou aumentar
(se possível) o fluxo de fase móvel.

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05
 LIMPEZA DE COLUNAS

As colunas normalmente possuem um manual de cuidados e uso

(baixe um exemplo clicando AQUI). Cada fabricante traz suas
recomendações de armazenamento e limites de uso para as
colunas manterem a eficiência, por isso é recomendável que
sempre seja realizada a leitura do manual. No entanto, alguns
cuidados e recomendações podem ser dados como forma de
aumentar a vida útil da coluna.

Na cromatografia de fase reversa, com o uso de tampão na fase

móvel, o primeiro cuidado a ser tomado é o de remoção total do
tampão logo após a rotina analítica.

1 - Para a remoção total dos sais da coluna e do sistema

cromatográfico, passe um fluxo de água ultrapura 95%: 5%
orgânico pela coluna, 40 volumes. Dê preferência a um fluxo
reduzido para que o processo seja assertivo, por exemplo um fluxo
de 0,5mL/min.

2 - Restaure as condições e ative os sítios ativos das colunas

com a passagem de 20 volumes da coluna com uma solução de
50:50 água/orgânico, fluxo de 0,5mL/min.

3 - Para finalizar a limpeza e a restauração completa da

condições ótimas da coluna, passe mais 20 volumes de uma
solução de 100% orgânico, fluxo de 0,5mL/min.

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06
 LIMPEZA DAS COLUNAS

Importante mencionar que há alguns cuidados básicos com o

desenvolvimento do método que podem ajudar a evitar problemas
em sua coluna:

Verifique se a fase móvel é compatível com a

concentração de tampão que está utilizando.

Reduza a força iônica se necessário.

Considere aumentar a proporção aquosa do

método.

Considere fazer a mistura de tampão e orgânico

previamente. Assim você terá certeza que nada
precipitará no momento da análise.

No uso de fase reversa e gradiente com mudança

de proporção entre tampão para orgânico
durante a corrida cromatográfica, evite mudança
rápida e mudança para 100% de orgânico.

Após a retirada total do tampão das colunas a maneira mais

comum e eficaz de manter a vida útil da coluna é o de fazer um
flush na coluna como forma de limpeza e armazenamento. Mas o
que é um flush? Nada mais do que passar um fluxo de 20 volumes
pela coluna de solvente orgânico 100%, acetonitrila ou metanol.
O flushing é um procedimento que vai ajudar a aumentar o tempo
de vida útil da coluna e deve ser usado sempre ao final do uso
diário da mesma. As colunas com diferentes ligantes, bases ou
características podem ter outros solventes como recomendação de
flush como podem observar após o procedimento abaixo:

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07
 Flush

1 - Desconecte a saída da coluna do detector.

2 - Passe pela coluna 20 volumes de solvente de limpeza.

3 - Desconecte a coluna, tampe bem as extremidades e guarde

adequadamente.

SOLVENTES LIMPEZA x COLUNAS

As recomendações abaixo são de flushs em sequência e os

solventes utilizados devem ser de pureza grau HPLC.

Flush = 20 volumes = 20Vol

a) Colunas de fase reversa - (C18, C8, C4, Phenyl, CN)

Passo 1 - Livre-se do tampão antes de mais nada.
Passo 2 - Acetonitrila ou metanol. (20Vol)
Limpeza com inversão da coluna, veja o tópico "perguntas
frequentes".

b) Colunas de fase reversa usadas em análises de proteínas e

pepitídeos
Passo 1 - Livre-se do tampão antes de mais nada.
Passo 2 - Faça um gradiente de água com 0,1% TFA para
acetonitrila com 0,1% TFA. A variação do gradiente deve ser de
90:10 água 0,1% TFA: ACN 0,1% TFA para 10:90 água 0,1% TFA:
ACN 0,1% TFA. (20Vol)
Limpeza com inversão de da coluna, veja o tópico "perguntas
frequentes".

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08
 SOLVENTES LIMPEZA x COLUNAS

c) Colunas de sílica sem ligantes

Passo 1 - Álcool Isopropilíco (20Vol)
Passo 2 - Metanol (20Vol)
Passo 3 - Acetato de etila (20Vol)

d) Colunas de fase normal (CN, NH2, Diol)

Passo 1 - Clorofórmio (20Vol)
Passo 2 - Álcool Isopropilíco (20Vol)
Passo 3 - Diclorometano (20Vol)
Passo 4 - Hexano (20Vol)

e) Colunas de troca iônica - aniônica (SAX, WAX)

Passo 1 - Água ultrapura (20Vol)
Passo 2 - Metanol (20Vol)
Passo 3 - Clorofórmio (20Vol)
Passo 4 - Metanol (20Vol)
Passo 5 - Água Ultrapura (20Vol)

f) Colunas de troca iônica - catiônica (SCX, WCX)

Passo 1 - Água Ultrapura com 4 injeções de 200µL de DMSO
durante o flush (20Vol)
Passo 2 - Tetrahidrofurano (20Vol)

g) Colunas de permeação em gel ou exclusão de tamanho

Passo 1 - Verifique em qual solvente a coluna estava armazenada
quando adquirida, qual solvente o fabricante armazenou a coluna.
Passo 2 - Normalmente a amostra é solubilizada na fase móvel
antes de injeções, mas caso a coluna esteja contaminada,
recomenda-se passar pela coluna 20 volumes do solvente de
origem da coluna.
Passo 3 - Reestabeleça o equilíbrio com solvente da rotina de
análise. (20Vol)

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09
 CONCLUSÃO

Muitos problemas observados na rotina de análises

cromatográficas podem ser evitadas com ações simples como as
citadas e recomendadas anteriormente. Pequenos bons hábitos e
procedimentos evitarão picos com variação de tempo de retenção,
variação de pressão, entupimento, picos fantasmas, anomalia de
picos e falta de reprodutibilidade entre injeções.

Caso os procedimentos recomendados não sejam suficientes para

evitar problemas com as colunas, é normal que uma nova pré-
coluna ou coluna seja instalada para seguir com as análises,
lembre-se que a colunas cromatográficas são consumíveis e
devem ser trocadas de tempos em tempos.

Ainda assim, em casos específicos de danos nas colunas com

poucas injeções, procure investigar qual é a origem do problema
para não continuar "matando" as colunas.

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 Perguntas Frequentes em HPLC

1 - Posso inverter a coluna para fazer limpeza?

Sim, para a maioria das colunas. Por exemplo, colunas de fase

reversa, de tamanhos de partículas de 3.5µm e 5.0µm, podem ser
invertidas para a limpeza após as tentativas iniciais de limpeza
no sentido correto. Mas alguns cuidados são importantes, ao
inverter a coluna para fazer uma limpeza, desconecte a tubulação
de saída da coluna da entrada do detector. Com essa ação você
evita entupimento do detector caso tenha o desprendimento de
alguma partícula que estava entupindo a coluna.
Colunas de tamanho de partícula abaixo de 2.5µm e colunas de
GPC caso sejam invertidas podem sofrer danos no leito fluídico e
após a limpeza na posição invertida pode perder eficiência de
separação.

2 - Se a pressão da coluna aumentar gradativamente, o que devo

fazer?

Fazer uma limpeza da coluna e do sistema com o cuidado de não

precipitar mais nenhuma partícula no equipamento e na coluna.
Provavelmente o aumento contínuo de pressão no sistema é
proveniente de precipitação de componentes presentes na fase
móvel, geralmente acontece na mistura de proporções erradas
entre solução tampão e solventes orgânicos.

3 - Posso instalar uma coluna nova para testar a pressão do

sistema?

Sim, mas considere fazer essa ação somente após a limpeza do

sistema ou caso contrário você pode danificar a nova coluna.

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 Perguntas Frequentes em HPLC

4 - Solventes e aditivos grau PA podem ser usados na fase móvel?

Não, se você deseja ter resolução, eficiência e retenção adequada

dos compostos, é sempre importante usar solventes e aditivos
grau HPLC e de qualidade. Além disso, o uso de solventes e
aditivos grau PA podem inferir nas análises, causar entupimento,
danos na coluna cromatográfica e ao HPLC.

5 - Posso usar a coluna de HPLC no sistema de UPLC™?

Essa resposta é complexa, está baseada na relação de tamanho de

partícula das colunas, volume da coluna e volume de dispersão
dos sistemas cromatográficos. Porém, é possível inferir sobre o
assunto: as transferências de métodos entre sistemas devem ser
acompanhadas não só da troca de colunas, mas sim do volume do
sistema, volume de injeção, volume da célula de detecção e do
tamanho de partícula da coluna.
Alguns equipamentos possuem volumes de dispersão, volume de
injeção e volume da célula do detector compatíveis para uso de
colunas de HPLC mesmo sendo denominado UPLC™ ou UHPLC,
por último, tivemos o lançamento de sistemas de volumes de
dispersão intermediários e que suportam mais pressão que os
HPLCs. Portanto, para a transferência de métodos entre
equipamentos, recomendamos o uso de uma calculadora de
escalonamento entre colunas cromatográficas, de HPLC para
UPLC™ e vice-versa, além disso, as informações devem ser claras
sobre limites de injeção, volume do sistema e volume da célula
de detecção. Com essas informações iniciais, ficará mais fácil
adequar todos os parâmetros cromatográficos e obter o melhor
resultado analítico.

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 Perguntas Frequentes em HPLC

6 - Ao iniciar o fluxo do HPLC eu posso aumentar de uma vez o

fluxo de 0 para 1mL/min ou preciso aumentar gradativamente, por
exemplo de 0,1 em 0,1mL/min até chegar a 1mL/min?

Depende, a melhor opção é sempre aumentar o fluxo

gradativamente, assim você preserva a vida útil da coluna
cromatográfica e evita a precipitação de partículas caso esteja
usando tampão como fase móvel. Há alguns casos que você
necessariamente deve aumentar o fluxo de forma gradativa, como
por exemplo: em colunas usadas a altas temperaturas (60 a 90ºC)
ou quando se usa colunas de gel na cromatografia de exclusão por
tamanho, caso contrário o dano na coluna é certo.
Atualmente, os próprios HPLCs fazem a evolução gradativa de
fluxo, basta ser programado adequadamente via software. As
colunas atuais, principalmente para colunas de fase reversa,
possuem tecnologia suficiente para aguentar o impacto de iniciar
o fluxo de fase móvel de forma abrupta.

Referências
1. Ghost peaks in

reversed-phase gradient HPLC: a review and

update - Stuart Williams - Received 10 June 2004; received in
revised form 2 July 2004; accepted 7 July 2004
2. HPLC Troubleshooting Guide - ACE HPLC columns - John
Dolan - www.ace-hplc.com (em 08/05/2022)
3. C. Hawkins and J. W. Dolan LCGC 21 (2003) 1134-1138
4. R.D. Morrison and J. W. Dolan, LCGC 23 (2005) 566-574.
5. Normal Phase HPLC Column Cleaning and Regeneration -
www.phenomenex.com - consulta em 04/05/2022

www.chromaclasscom.br

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