Métodos Instrumentais de Análise

Trabalho Experimental 3: Determinação da cafeína no café por

HPLC

Autores:
-Arthur Prado;
-Daniela Pascoal;
-Djeniffer Santos.

Data: 04/11/2022.
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 Resumo
No trabalho 3, o objetivo é determinar a cafeína numa solução de café a partir do HPLC.
HPLC é uma técnica de separação e purificação das substâncias em uma mistura. Para
tal, demos seguimento ao procedimento preparando a nossa solução amostra, tendo já
as soluções padrão de cafeína prontas. A seguir a injeção, por ordem crescente, das
soluções padrão nomeadamente de concentração: 30, 60, 90, 120 e 150, e a preparação
da nossa amostra necessária a ser quantificada, injetamo-la no aparelho de HPLC, em
média 80 microlitros. Efetuamos a leitura das áreas dos respetivos picos, já tendo uma
estimativa do tempo de retenção da cafeína (Tr = 1.174min). Após esta sequência, deu-
se lugar aos cálculos, a fim de obtermos a concentração da cafeína da amostra. A partir
do cálculo da curva de calibração, encontrando os parâmetros “a” e “b” foi possível
obter o valor da concentração. Pudemos observar e concluir que a área é proporcional
á concentração, pois aumentando a concentração da cafeína também se obtinha
aumento da área (diretamente proporcional). E, por conseguinte, obtivemos a
quantidade de cafeína em gramas de café.

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 Índice
Resumo ..............................................................................................................................2
1.Introdução ......................................................................................................................4
2.Procedimento experimental ..........................................................................................5
2.1. Equipamento Utilizado……………………...………………………………………………………………5
2.2.Reagentes……………………………………………………………………………………………………..……6
3.Resultados e discussão ..................................................................................................7
4.Conclusão .......................................................................................................................9
5.Bibliografia .......................................................................................................... ….……10

Índice de elementos
Fig.1 ...................................................................................................................................5
Tabela.1 .............................................................................................................................7
Gráfico.1 ...........................................................................................................................7
Gráfico.2 ................................................................................................................... ………8

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 Introdução
Quantificar a cafeína no café é a proposta para o presente trabalho. Para tal foi utilizado
o método de separação de compostos químicos em solução- cromatografia líquida de
alta performance- HPLC (high performance liquid chromatography).
Os principais componentes da cromatografia líquida são: a bomba, que movimenta a
fase móvel e a amostra através da coluna; uma coluna, que contêm a fase estacionária,
geralmente formada por partículas de sílica, porosas, esféricas e diâmetro em torno de
35 μm, e um detetor que mostra os tempos de retenção das moléculas, sendo que o
tempo de retenção varia de acordo com as interações da amostra com as fases
estacionária e móvel.
Esta técnica consiste no bombeamento das soluções incluindo a fase móvel através de
uma coluna, onde encontra-se a fase estacionária. E a partir da interação das soluções
com estas duas fases, dá-se a separação dos componentes. Uma vez que cada composto
possui suas propriedades específicas, logo, é o responsável pelas diferentes interações.
E isto resulta na sua separação, onde cada composto sai da coluna (passando pelo
detetor) no seu tempo; denominado- tempo de retenção- o tempo que decorre entre o
momento da injeção e detenção.
Os resultados são apresentados no sistema de dados- um registrador. Onde é possível
verificar e apontar as áreas dos picos do componente em estudo, ignorando todos os
outros possíveis picos, estes são considerados interferências/lixo para a análise.

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 Procedimento experimental
Equipamento utilizado: o cromatógrafo líquido utilizado no laboratório LQA-
Laboratório Química Analítica, trata-se de um HPLC Jasco Extreme equipado com
detetor UV-VIS e coluna Nucleosil C18 (150 mm x 4.60 mm) a operar nas seguintes
condições:
-Fase móvel: Acetonitrilo/Água (50:50 em volume);
-Caudal: 0.5 ml/min
-Comprimento de onda: 254 nm.

Fig.1-Esquema de um sistema HPLC

Os componentes de um cromatógrafo líquido são: reservatório, bomba, válvula de

injeção, coluna cromatográfica, detetor e o registrador.
A fase móvel que é o solvente de acetonitrilo é mantido no reservatório e é bombeado
por uma bomba controlada por um microprocessador. O injetor introduz rapidamente
a amostra no sistema com uma rutura mínima do fluxo de solvente. A coluna contém a
fase estacionária, onde a amostra em estudo é retida e cada componente interage de
forma diferenciada com o material ali contido, gerando diferentes velocidades levando
assim a separação no decorrer do trajeto. O detetor (neste caso UV-VIS), é um
dispositivo conectado na saída da coluna onde emite um sinal elétrico, o qual é registado
de maneira continua a composição da amostra, gerando um cromatograma, mostra o
tempo de detenção das moléculas e mede a absorção de luz dos compostos em certo
comprimento de onda, compreendido entre as regiões visível e ultravioleta do espectro

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eletromagnético. E por fim temos o sistema de aquisição de dados ou registrador que
basicamente regista e apresenta os resultados obtidos em todo o processo.
E é assim que com este aparelho consegue-se executar processos como separação e
purificação de compostos.
Reagentes:
- 5 soluções padrão de cafeína com as seguintes concentrações: 30, 60, 90, 120 e 150
mg/L.
Soluções que permitem a construção da curva de calibração e faz ser possível
determinar a concentração da cafeína da amostra.
- Solução de acetonitrilo/água (50:50), solvente da fase móvel
- Pó de café e água para preparar a amostra de café.
As soluções padrão já haviam sido previamente preparadas, ficou ao nosso cargo
preparar a amostra que seria estudada, com auxílio dos materiais do laboratório como
balança para medição da massa do café, goblés, micropipeta para a transferência da
solução, proveta, balão volumétrico, placa de aquecimento e barra de agitação (para
efetuar a mistura, dissolver o pó na água), também seringas e espátula. Após este
processo de preparação a nossa amostra estava pronta a ser injetada.
Tendo apto o equipamento, todos os reagentes necessários e fazendo uso da técnica de
HPLC, demos seguimento almejando os resultados.
Com uma seringa fomos introduzindo as soluções no aparelho através do injetor.
Rodando o injetor da posição “LOAD” para posição “inject” inicia-se automaticamente a
aquisição do espetro. Após momentos, com a análise já completa repetíamos o
procedimento. Assim deu-se a injeção de todas as soluções padrão por ordem crescente
de concentração e posterior a estes a amostra. A seguir a leitura dos resultados
apresentados no registrador efetuamos os cálculos. Calculamos a concentração da
amostra de café, regressão linear bem como o coeficiente de determinação e auxiliados
pela curva de calibração obtivemos o resultado da concentração de cafeína no café.

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 Resultados e discussão
Resultados experimentais – Análise das soluções padrão de cafeína

Área de pico de cafeína

Concentração(mg/l) Ánalise1
30 955731

60 1829947

90 2618742

120 3441829

150 4090201

Tabela.1

Fizemos um gráfico com os mesmos resultados com o objetivo de averiguar a veracidade

dos mesmos e obtivemos o seguinte:

y = 26269x + 223043
R² = 0,9976 Curva de calibração
area Linear (area)

4500000
4000000
3500000
3000000
Área do pico

2500000
2000000
1500000
1000000
500000
0
0 20 40 60 80 100 120 140 160
Concentrações (mg/L)

Gráfico.1

A curva de calibração permite afirmar que os resultados obtidos possuem uma

proporção lógica.
Regressão linear: 𝑦 = 26269𝑥 + 223043, onde a=26269 e b=223043

Coeficiente de correlação: 𝑅 2 = 0.9976

O resultado experimental da análise da amostra preparada foi um pico de área =
3478851 (counts). Comparando esta área com a das soluções padrão conseguimos ter

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uma noção da concentração do material: entre as concentrações [120,150]. E com todos
os dados já disponíveis devemos obter a concentração da cafeína.
Cálculo da calibração: Área=f (concentração)
Novo gráfico da área em função da concentração, incluindo dados da amostra:

Curva de calibração
4500000
4000000
3500000
3000000
2500000
2000000
1500000
1000000
500000
0
0 2 4 6 8 10

Gráfico.2

á𝑟𝑒𝑎 = 𝑎 ∗ 𝑐𝑐𝑎𝑓𝑒í𝑛𝑎 + 𝑏

𝑐𝑐𝑎𝑓𝑒í𝑛𝑎 = 123,94 𝑚𝑔/𝐿

Sabendo a massa do café utilizado na amostra, e com o resultado da concentração
conseguimos determinar a concentração de cafeína presente na solução inicial, e
expressamos este resultado em mg de cafeína/g de café.
O resultado em mg de cafeína/g de café = 50,61. Para um grama de café tem-se presente
50,61mg de cafeína.
Segundo pesquisas apurou-se que numa xícara média de 240 ml de café, contêm cerca
de 96 miligramas de cafeína. Numa outra fonte encontramos que de acordo com a
organização governamental norte-americana USDA, 237ml de café fresco – típico café
americano filtrado - contém 95 miligramas de cafeína.
Portanto a média ronda os valores de 95/96 miligramas, o que nos faz afirmar que
ocorreu algum tipo de interferência nos nossos resultados que fez com que
obtivéssemos um resultado erróneo, um resultado que não condiz com a proporção já
firmada através das informações fornecidas por outras pesquisas. Porque não faz
nenhum sentido lógico ter 50,61 miligramas de cafeína em cada grama de café, sendo
que em 237ml de café que equivalem a 86,5 gramas (segundo o Conversor-de-
Medidas.com) contêm 95 miligramas de cafeína.
O erro pode ter sido causado por: má desenvoltura do aparelho, contaminações ou erro
nos cálculos, o que faria ser necessário repetir a análise para obter resultados mais
concisos e verdadeiros.

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 Conclusão
O presente trabalho tinha por objetivo quantificar ou determinar a quantidade de
cafeína presente numa amostra de café. Recorrendo a técnica de análise onde os
componentes de uma mistura são separados de compostos contidos numa fase móvel
líquida por interação com uma fase estacionária- HPLC “Hig-Performance Liquid
Chromatography”.
Esta separação dá-se fazendo uso da diferença de velocidades de migração com que os
componentes são transportados através de uma fase estacionária por uma fase líquida-
fase móvel, que no nosso caso é a acetonitrilo/água.
Se uma amostra contiver vários compostos, cada composto na amostra passará um
tempo diferente na coluna de acordo com a sua composição química, ou seja, cada um
terá um tempo de retenção diferente. Pudemos constatar que tempo de retenção é um
aspeto importante aquando da análise da área dos picos, é basicamente a quantidade
de tempo que um composto gasta na coluna depois de ter sido injetado. Afirmamos ser
um fator primordial para a identificação de um certo componente.
A partir da análise dos resultados obtidos pelo cromatograma, e cálculos conseguimos
o seguinte: a concentração da cafeína em mg/L da solução injetada = 124, (valor
correspondente á área do pico obtida); e sabendo a massa, em gramas, de café usada
na solução inicial = 0.49, expressamos o valor da concentração em mg de cafeína/g de
café = 50,61.
Embora os valores não estão em total concordância com valores tabelados devido a
erros experimentais, atingimos o objetivo teórico do trabalho, o que verifica a eficiência
do método utilizado- a técnica de cromatografia líquida de alta performance.

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 Referências bibliográficas
[1] RIBEIRO, António, C4 Introdução aos métodos cromatográficos, IPB,2022;
[2] MARINHO, Vânia, “Sabe quanta cafeína tem o seu café?”, 27/02/17
[3] Centro de Soluções Analíticas – CSA, “Conceitos Básicos em Cromatografia Liquida
| HPLC”, 21/06/2019
[4] Autores desconhecidos, 1 mililitro de café em gramas (conversor-de-medidas.com),
(desde 2014).

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