UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS

INSTITUTO DE QUMICA

DEPARTAMENTO DE QUMICA ANALTICA

Determinao de Cafena em gua potvel e superficial por

HPLC-UV aps extrao e pr-concentrao por LLE e SPE

&

Caracterizao de bebidas alcolicas destiladas por Cromatografia

Gasosa: Determinao do teor em etanol por GC-FID e
Identificao dos Constituintes Minoritrios por GC-MS + HS-
SPME

Prof. Coordenador: Fbio Augusto

Prof. Auxiliares: Tamires Valim Marques

Henrique Caracho Ribeiro

Marcia Kaori Kasahara RA: 156541

Matheus Luis Romero RA: 156733

Matias Orlando Miranda RA: 191807

2 semestre/2016
SUMRIO

1. Experimento 1+2: Determinao de Cafena em gua potvel e superficial por

HPLC-UV aps extrao e pr-concentrao por LLE e SPE..............................1
1.1. Introduo Terica e Objetivos......................................................................1
1.2.Parte experimental...........................................................................................2
1.3.Resultados e Discusso....................................................................................2
1.4.Concluso........................................................................................................6
1.5.Referncias Bibliogrficas...............................................................................6
2. Experimento 3 + 4: Caracterizao de bebidas alcolicas destiladas por
Cromatografia Gasosa: Determinao do teor em etanol por GC-FID e
Identificao dos Constituintes Minoritrios por GC-MS + HS-SPME...............7
2.1. Introduo Terica e Objetivos......................................................................7
2.2.Parte experimental...........................................................................................8
2.3.Resultados e Discusso...................................................................................8
2.4.Concluso......................................................................................................13
2.5.Referncias Bibliogrficas.............................................................................13
1. EXPERIMENTO 1 + 2: Determinao de Cafena em gua potvel e superficial por
HPLC-UV aps extrao e pr-concentrao por LLE e SPE

1.1. INTRODUO TERICA E OBJETIVOS

A presena de certas substncias no meio ambiente tornou-se cada vez mais

preocupante 1, devido ao fato de que a atividade antropomrfica utiliza a gua e descarta em
seus efluentes vrios compostos que alteram o ciclo e a qualidade da gua 2.
Uma dessas substncias a cafena, presente em bebidas e medicamentos. Seu consumo
aumentou bastante e sua ingesto excessiva malfica para a sade. Apesar da cafena ter sido
detectada em guas naturais h 30 anos, somente em 1996 Ogunseitan, O. props a cafena
como marcador qumico de contaminao antropomrfica 3.
Foram desenvolvidos muitos mtodos para analisar cafena em guas, mas a maioria
consiste em: 1) preparao da amostra e pr-concentrao da mesma; 2) identificao e 3)
quantificao. Neste experimento, empregaremos o mtodo de LLE (Extrao Lquido-Lquido)
e SPE (Extrao em Fase Slida) para realizar a preparao da amostra e pr-concentrao do
analito, para posterior comparao. Para a identificao e quantificao utilizaremos o HPLC
(Cromatografia Lquida der Alta Eficincia).
A tcnica de LLE (Extrao Lquido-Lquido) consiste em uma tcnica de extrao e
pr-concentrao exaustiva por partio, no qual empregado dois solventes imiscveis, e
promovido a agitao para que a extrao ocorra, e o analito passe de uma fase para a outra por
afinidade.
J o SPE (Extrao em Fase Slida) uma tcnica de extrao e pr-concentrao
tambm exaustiva porm por adsoro, no qual empregado um sorvente slido 4. A SPE
apresenta quatro etapas bsicas. A primeira o condicionamento do cartucho, que consiste em
usar o eluente adequado para disponibilizar os stios ativos e ajustar as foras dos solventes de
eluio com o da amostra, seguido da extrao dos analitos da amostra. Depois, a lavagem do
cartucho para eliminar os interferentes e por ltimo, a eluio dos analitos de interesse para
anlise 5.
A Cromatografia Lquida de Alta Eficincia uma tcnica que permite fazer
separaes, identificao e quantificao. empregada uma fase mvel lquida e a fase
estacionria, e os analitos so separados pela afinidade com a fase estacionria.
Este experimento visa o preparo de amostras via LLE e SPE e sua comparao, alm de
determinar a concentrao de cafena em amostras de gua.

1
1.2. PARTE EXPERIMENTAL

No experimento de Extrao Lquido-Lquido (LLE), para uma melhor extrao na

amostra de gua do lago, adicionamos NaCl slido, sendo possvel separar a fase orgnica da
fase aquosa, pois durante o experimento a fase orgnica tinha muitas bolhas. No experimento de
Extrao em Fase Slida (SPE) no houve modificaes no roteiro.

1.3. RESULTADOS E DISCUSSO

Nos experimentos de Extrao Lquido-Lquido e Extrao em Fase Slida foram

obtido os seguintes valores:

Tabela 1: Tabela com os resultados obtidos no experimento de LLE

concentrao
(g/L) rea do pico
400 26098
800 51857
1200 79004
1600 104511
2000 130298

Tabela 2: Tabela com os resultados obtidos em SPE

concentrao (g/L) rea do pico

400 26098
800 51857
1200 79004
1600 104511
2000 130298

E a partir destes valores construiu-se a curva analtica.

2
 Curva analtica obtida para o experimento de LLE
140000
120000
100000
rea do pico

80000
60000 y = 63,281x - 3402,4
40000
R = 0,9829
20000
0
0 500 1000 1500 2000 2500
concentrao (g/L)

Figura 1: Curva analtica obtida no experimento de LLE

Curva analtica obtida no experimento de SPE

140000
120000
rea do pico

100000
80000 y = 65,264x + 37,4
60000
40000 R = 0,9999
20000
0
0 500 1000 1500 2000 2500
concentrao (g/L)

Figura 2: Curva analtica obtida no experimento de SPE

Tabela 3: Tabela com os resultados das solues brancos

SPE LLE
rea do rea do
soluo pico pico
branco 1 542 688
branco 2 454 960
branco 3 429 822
Desvio padro
branco 59 136
LOD 2,7 6,3
LOQ 9,1 20,8

3
onde LOD (limite de deteco) e LOQ (limite de quantificao) foram calculados pela seguinte
frmula:

3
=

10
=

Para uma melhor anlise da curva de calibrao, foi feito um grfico de resduos. Os
resduos foram calculados da seguinte maneira:

= 1

onde a rea do pico terica foi calculada a partir da equao da reta da curva analtica.

Grfico do resduo obtido durante o

experimento de LLE

0,2000

0,1000
resduo

0,0000
0 500 1000 1500 2000 2500
-0,1000

-0,2000
concentrao (g/L)

Figura 3: Grfico de resduos referente ao experimento de LLE.

grfico de resduos
0,01
0,008
0,006
0,004
0,002
resduo

0
-0,002 0 500 1000 1500 2000 2500

-0,004
-0,006
-0,008
-0,01
concentrao (g/L)

Figura 4: Grfico de resduos referente ao experimento de SPE.

4
 possvel observar que os resduos, apesar de uma maior discrepncia no ponto x =
400 no grfico referente ao LLE e nos pontos x = 800 e x = 1200 no grfico de SPE, so
mnimos, como esperado. Isto significa que se pode assumir o valor da concentrao calculado
pela curva analtica.
Assim, determinou-se a concentrao de cafena nas amostras utilizando a equao da
reta y = 63,251*x 3402,4 para LLE e y = 65,264*x + 37,4 para SPE, onde y representa a rea
do pico e x a concentrao de cafena em g/L, e o valor encontrado de x foi utilizado para
calcular a concentrao de cafena na amostra por:

5
=
300

Tabela 4: Concentraes de cafena calculadas a partir da equao da reta

LLE SPE

amostra rea do concentrao (g/L) amostra rea do pico concentrao

pico (g/L)

14,7 padro 47267 12,1

fortificada 57476
8,8 gua potvel 328 0,1
gua potvel 34430
0,5 gua de rio 11329 2,9
gua de rio 2185

A partir do valor encontrado para a amostra padro e a fortificada podemos calcular a

eficincia de extrao e o fator de pr-concentrao O valor terico para a concentrao de
cafena de 20 g/L. A eficincia de concentrao foi calculada a partir da frmula:

= ( ) 100 5

6
=

onde Cobtido a concentrao encontrada do analito na amostra, Cadicionado a concentrao que

foi adicionada de analito na amostra, Csoluo aps a extrao a concentrao de analito na soluo
feita aps a extrao (obtida na anlise) e Camostra bruta a concentrao do analito na amostra
bruta.

Tabela 5: Valores para eficincia de extrao e fator de pr-concentrao

LLE SPE
eficincia de extrao 73,3 60,3
fator de pr concentrao 44,0 36,2

Pelos valores da tabela acima se pode observar que tanto a eficincia de extrao
quanto o fator de pr-concentrao do mtodo por Extrao Lquido-Lquido foram melhores,
apesar de uma das vantagens do SPE em relao ao LLE ser uma extrao mais completa do
analito e a menos consumo de solventes orgnicos, alm da maior eficincia na separao do

5
analito dos interferentes, procedimento manual mais conveniente, remoo de partculas e
mais fcil de ser automatizado 7. No entanto, a aparelhagem do LLE muito mais simples e
barata, alm dos cartuchos de SPE serem descartveis.
Uma das causas provveis para isto seria a saturao do cartucho, pois as amostras
estavam com bastante material particulado.

1.4. CONCLUSO

As duas tcnicas de extrao SPE e LLE - se mostraram eficazes na separao e na

pr-concentrao da cafena. Talvez uma etapa de filtrao para a remoo do material
particulado melhorasse o desempenho de ambas as tcnicas.

1.5. BIBLIOGRAFIA

1. IDE, Alessandra H. Ocorrncia e avaliao da remoo de produtos farmacuticos por

duas estaes de tratamento de esgotos. 2014. 47p Trabalho de concluso de curso
(Bacharelado em Qumica Tecnolgica com nfase em Qumica Ambiental) Departamento
Acadmico de Qumica e Biologia, Universidade Tecnolgica Federal do Paran, Curitiba,
2014.
2. DEBLONDE, T.; COSSU-LEGUILLE, C.; HARTMANN, P. Emerging pollutants in
wastewater: A review of the literature. International Journal of Hygiene and Environmental
Health, v. 214, p. 442-448, 2011.
3. VIDAL, CRISTIANE et al. A anlise de cafena nas amostras coletadas no Brasil.
Cassiana C. Montagner, Cristiane Vidal, Fernando F. Sodr, Igor C. Pescara e Wilson F.
Jardim, p. 25, 2014.
4. Wells, 2003
5. RAIMUNDO, C. C. M. Ocorrncia de interferentes endcrinos e produtos farmacuticos
nas guas superficiais da bacia do rio Atibaia. 126p. Dissertao (Mestrado em Qumica
Analtica). Instituto de Qumica, Universidade Estadual de Campinas, Campinas, 2007.
6. NASCENTES, Clsia C.; ARRUDA, Marco A. Z.; MANIASSO, Nelson. Experimentos
didticos em qumica analtica envolvendo separao de fases e pr-concentrao. Qum. Nova,
So Paulo, v. 25, n. 3, p. 483-489, May 2002.
7. MAJORS, Ronald E. Solid Phase Extraction. Handbook of Sample Preparation, p. 53-79,
2010.

6
2. EXPERIMENTO 3 + 4: Caracterizao de bebidas alcolicas destiladas por
Cromatografia Gasosa: Determinao do teor em etanol por GC-FID e Identificao dos
Constituintes Minoritrios por GC-MS + HS-SPME

2.1. INTRODUO TERICA E OBJETIVOS

Na indstria de alimentos muito importante o conhecimento sobre a

composio qumica, por exemplo, para o entendimento das caractersticas
organolpticas, assim podendo maximizar seu preo 1. Uma classe de compostos muito
importante a de flavorizantes, responsveis pelas respostas sensoriais, predominantes
em alimentos e bebidas. Tambm podem ocorrer odores desagradveis provenientes de
contaminao microbiana 2. Por isso, a importncia de se analisar tais substncias.
Muitos mtodos instrumentais para a anlise de flavorizantes tm sido
desenvolvidos, mas os processos so basicamente: 1) separao; 2) identificao; 3)
quantificao 3 . Neste experimento, foi utilizado o mtodo de SPME e headspace + GC
MS para identificao dos compostos minoritrios e GC-FID (Cromatografia Gasosa
acoplada Detector de Ionizao por Chama) para quantificao de etanol na amostra.
O mtodo de headspace por SPME (Micro Extrao em Fase Slida) consiste
em uma tcnica de preparao de amostras para determinar compostos volteis em
amostras lquidas ou slidas. Envolve a pr-concentrao do analito ao expor uma fibra
polimrica extratora no headspace, acima da amostra por um perodo de tempo
adequado, para que os compostos volteis sejam adsorvidos na fibra, seguido de uma
injeo no aparelho aonde ser analisado a amostra, para que os compostos sejam
dessorvidos.

Figura 4: Esquema do mtodo HS-SPME

7
 A Cromatografia Gasosa uma tcnica que permite separao, identificao e
determinao de componentes parecidos em misturas complexas. A amostra
dissolvida na fase mvel, que em Cromatografia Gasosa um gs. Esta fase mvel
passa em uma fase estacionria. Os analitos so separados por afinidade com a mesma 4.
O Detector de Ionizao por Chama um dos detectores mais utilizados em GC.
Nele, o eluente que veio da coluna direcionado a uma chama de ar-hidrognio.
Quando pirolisado, muitos compostos orgnicos produzem ons e eltrons, no qual
produzem corrente eltrica. A deteco envolve monitorar a corrente produzida por
essas espcies 4.
Em Espectrometria de Massas, o instrumento faz a degradao das molculas
dos compostos, ionizando-os. Depois, realiza o scan da massa durante toda a corrida
cromatogrfica, os dados so processados, gerando um espectro massa/carga (m/z),
sendo possvel assim analisar e identificar vrios compostos 4.
Este experimento visa a identificao dos constituintes minoritrios por HS-
SPME + GC-MS e a quantificao de etanol em bebidas alcolicas por GC-FID, alm
de estudar os fundamentos da tcnica a partir dos experimentos 4.

2.2. PARTE EXPERIMENTAL

No experimento de identificao de constituintes minoritrios, ao invs de

adicionar NaCl na amostra decidimos no colocar, visto que a resposta do solvente era
muito intensa no GC-MS chegando a prejudicar a anlise. Isto se deve ao fato que, ao
adicionarmos NaCl, diminumos a atividade da gua, aumentando a atividade de outros
constituintes, inclusive do lcool.

2.3. RESULTADOS E DISCUSSO

O detector de ionizao em chama (FID) como o prprio nome diz, mensura os ons
formados durante a combusto de compostos orgnicos. Para isso, necessrio preparar
solues padro da substncia de interesse, a fim de montar uma curva de calibrao e deste
modo, quantizar o analito presente na amostra.
Na Tabela abaixo, esto os dados obtidos a partir da anlise de etanol na amostra Natu
Noblis Blended Whisky.

8
Tabela 1: Resultados obtidos pela anlise de etanol em amostra pelo FID.
% de etanol na rea do pico de rea do pico de n- Razo entre a rea
amostra etanol butano de etano e a rea de
n-butano
2 165,28 727,09 0,22
2 136,34 614,80 0,22
2 152,01 633,60 0,24
4 259,47 417,52 0,62
4 325,83 523,96 0,62
6 538,84 575,67 0,94
6 481,14 520,94 0,92
8 699,63 594,85 1,18
8 642,54 536,14 1,20
10 1093,06 724,78 1,51
10 509,97 332,38 1,53
10 767,39 504,00 1,52

Como os dados da Tabela 1, foram feitos dois grficos, os quais um no

foi considerado o padro interno, e o outro o considerou.

Figura 1: Curva de calibrao sem o padro interno.

9
Figura 2: Curva de calibrao com o padro interno.

A equao da reta para a curva de calibrao sem o padro interno de y = (82 12)x
(11 86) e apresenta coeficiente de correlao r = 0,88645 enquanto que a da curva analtica
com o padro interno de y = (0,157 0,03)x (0,05 0,02) e coeficiente de correlao r =
0,99778. Portanto, enquanto a curva analtica sem o padro interno apresenta linearidade
regular, a curva com o padro interno apresentou uma grande melhora na linearidade da reta.
Desta maneira, a curva a ser utilizada para melhor anlise quantitativa de etanol na amostra a
do grfico da Figura 2.
Lembrando que para realizar este tipo de anlise, necessrio que a concentrao do
analito de interesse esteja dentro dos pontos utilizados na curva de calibrao, sendo necessrio
as vezes, pr concentrar ou pr diluir a amostra.
Abaixo est a tabela com os dados de rea do pico para o etanol e n-butano da amostra:

Tabela 2: Valores de rea dos picos de etanol e n-butano da amostra.

rea do pico de etanol rea do pico de n-butano (rea etanol)/(rea n-
butano)
342,07 443,00 0,77
437,12 561,12 0,78

10
 Utilizando a equao obtida no Grfico 2, foram obtidos as seguintes porcentagens na
amostra diluda:
Replicata 1=5,23%
Replicata 2=5,27%

Deste modo, a porcentagem mdia de etanol na amostra diluda :

Mdia de etanol na amostra=5,25%

Considerando que 1,3mL da amostra foi diluda em um balo de 10mL, haviam ento,
0,525mL de etanol neste contedo de 1,3mL.
Deste modo, o resultado da % de etanol na amostra de:

% de etanol na amostra=(40,40,2) %

Na identificao dos constituintes minoritrios volteis da amostra, foi utilizada a tcnica de

espectrometria de massas, a qual consiste em medir a massa molecular e a massa de fragmentos
derivados da clivagem da molcula, permitindo determinar praticamente todos os componentes
presentes no headspace.
Estes constituintes volteis em sua maioria so steres e aldedos, os quais fazem parte da
primeira do primeiro destilado da bebida e tambm algum terpeno. A presena destes
compostos dependendo da quantidade, influenciam diretamente na qualidade da bebida.
Abaixo est o cromatograma obtido pelo GC:

Estrutura 2 Estrutura 5

Estrutura 1
Pico Estrutura 3 Estrutura 4
morto
[Digite
uma
cita
Figura 3: Cromatograma da amostra de whisky
o do
docu
Os espectros de massas encontram-se em anexo, sendo que as estruturas
mento
correspondentes aos picos encontrados esto listadas abaixo:
ou o
resum
o de 11
um
ponto
intere
ssante
Figura 4: Estrutura do octanoato de etila (estrutura 1)

Figura 5: Estrutura do decanoato de etila (estrutura 2)

Figura 6: Estrutura do Tridecanoato de etila (estrutura 3)

Figura 7: Estrutura do 7-metxi-3,7-trimetil-octanal (estrutura 4)

Figura 8: Estrutura do Dodecanoato de 2,3-bis(acetiloxi)propila (estrutura 5)

Sendo estes, os compostos que foram eludos nesta ordem pelo GC. Deste modo, nota-
se que os steres que eluram primeiro possuem massa molar menos elevada do que os steres
que eluram por ltimo, e os compostos que saram depois dos steres maiores, possuem
ramificao, o que aumenta a interao com a fase estacionria do GC.
Os steres eram esperados de sarem no espectro de massas, pois eles fazem parte da
fermentao da bebida. Os outros compostos encontrados podem ter sido colocados para dar
aroma bebida.
Era esperada a apario de algum terpeno no espectro, os quais do algum aroma
caracterstico e propriedades antioxidantes s bebidas, o que prolonga a validade, porm o
mtodo ainda no estava otimizado quando a anlise foi feita, e alguns componentes
importantes podem no terem sido detectados.
Alm disso, notou-se a presena de compostos com grupos siloxanos, indicando que ou
a fibra do SPME ou a coluna cromatogrfica estava sofrendo a sangria, ou seja, estava
ocorrendo perdas da fibra/coluna.
Em seguida, foi calculado o ndice de reteno de cada composto identificado e seu erro
percentual a parir das frmulas:

log( ())log( ())

= 100 [( log( ) + ] 5
())log( ())

= 100 ( )

12
onde IR o ndice de reteno de Kovts, tRA o tempo de reteno ajustado do analito em
questo, tRn o tempo de reteno ajustado do analito do pico posterior ao analito A, t RN o
tempo de reteno ajustado do analito do pico anterior ao analito A e n o nmero de carbonos
do analito do pico anterior.
Logo, foi possvel verificar que o ndice de reteno obtido a partir do experimento
apresentou uma baixa exatido. Uma possvel causa para isto seria que a coluna estava perdendo
grupos siloxanos, e o tempo de reteno foi prejudicado, acarretando erros no clculo do ndice
de reteno.

Tabela 3: Compostos identificados no cromatograma e seus respectivos tempo de reteno,

ndice de reteno calculado e terico e seu erro percentual

tempo
ndice de ndice de
de erro
Composto reteno reteno
reteno percentual
calculado terico
ajustado
octanoato de etila 1,417 9,492784364 12136 99
decanoato de etila 4,117 981,4927698 14246 31
Tridecanoato de etila 6,575 1144,800194 16977 33
7-metxi-3,7- No foi
-
trimethil-octanal 12,983 1427,417219 encontrado
Dodecanoato de 2,3- No foi
-
bis(acetiloxi)propila 13,392 1113,879951 encontrado

2.4. CONCLUSO

O mtodo GC-FID foi muito eficaz para a quantificao do teor alcolico na amostra
whisky. No entanto, para o experimento de identificao de compostos minoritrios para uma
melhor anlise talvez fosse melhor utilizar outro tipo de coluna.

2.5. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS

1. BUGLASS, Alan J. Chemical Composition of Beverages and Drinks. Handbook of

Food Chemistry, p. 225-300, 2015.

2. AUGUSTO, Fabio; E LOPES, Alexandre Leite; ZINI, Claudia Alcaraz. Sampling

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Analytical Chemistry, v. 22, n. 3, p. 160-169, 2003.

3. CHAMBERS, Edgar; KOPPEL, Kadri. Associations of volatile compounds with

sensory aroma and flavor: the complex nature of flavor. Molecules, v. 18, n. 5, p.
4887-4905, 2013.

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4. HOLLER, F. James; SKOOG, Douglas A.; CROUCH, Stanley R. Princpios de
anlise instrumental. Bookman, 2009.

5. VIEGAS, M. C.; BASSOLI, D. G.; Quim. Nova, Vol. 30, No. 8, 2031-2034, 2007

6. DA CUNHA NBREGA, Ian Carneiro. ANLISE DOS COMPOSTOS VOLTEIS DA

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7. MENESES, Afram Domingos Silva de et al. PROCESSO BIOTECNOLGICO PARA

APROVEITAMENTO DE SORO OBTIDO NA PRODUO DO QUEIJO DE
COALHO. 2009.

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