FUNGOS MICORRIZICOS ARBUSCULARES NO CRESCIMENTO

E METABOLISMO DE PLANTAS MEDICINAIS

MESTRANDA: RAYANE MONIQUE SETE DA CRUZ

ORIENTADORA: Prof. Dra. SILVIA GRACIELE HÜLSE DE SOUZA

COORIENTADOR: Prof. Dr. ODAIR ALBERTON
CAPITULO I

Crescimento vegetal, conteúdo e composição do óleo

essencial da Salvia officinalis (Lamiaceae) inoculada com
micorrizas sob diferentes doses de fósforo
 INTRODUÇÃO

• A Salvia officinalis (Lamiaceae),

vem do latim que significa
"curar" e se destaca para a
popularidade desta planta na
medicina tradicional.

• Grande potencial na produção de

óleo essencial.

• Grande potencial antioxidante.

• Presença de tujonas e cânfora

atribui a esta planta caráter tóxica
quando utilizada indevidamente.
• A associação com FMAs faz com que as plantas cresçam e se desenvolvam
melhor devido a maior absorção de fósforo (P) e água pelas raízes.

• O fator edáfico mais

importante sobre o
funcionamento da simbiose
micorrízica é a
disponibilidade de P no solo.

• Claroideoglomus etunicatum
(sin. Glomus etunicatum)

• Rhizophagus clarus (sin.

Glomus clarum)
OBJETIVO

Avaliar o crescimento vegetal e conteúdo do OE da sálvia

inoculada ou não com o FMA Rhizophagus clarus e/ou
Claroideoglomus etunicatum sob diferentes doses de P no solo.
MATERIAL E MÉTODOS
Design experimental
50% de substrato e 50% de areia lavada + vermiculita (1:1) fumigado

As plantas foram inoculadas ou não com FMA

Com alta (200 mg de P kg–1) e baixa (20 mg de P kg–1) aplicação de Fósforo

O delineamento experimental inteiramente casualizado com 8 repetições por tratamento

em um fatorial de 3x2, num  total de 48 unidades experimentais

Trat 1: preparado de substrato + 20 mg P kg–1

Trat 2: preparado de substrato + 200 mg P kg–1
Trat 3: preparado de substrato + R. clarus + 20 mg P kg–1
Trat 4: preparado de substrato + R. clarus + 200 mg P kg–1
Trat 5: preparado de substrato + C. etunicatum + 20 mg P kg–1
Trat 6: preparado de substrato + C. etunicatum + 200 mg P kg–1
Análises da Planta

As plantas colhidas, separadas em parte aérea e sistema radicular

Determinada a altura da planta com fita métrica

As plantas foram secas em estufa até peso constante

Pesadas em balança digital a massa seca da parte aérea (MSPA), massa seca das raízes
(MSR) e massa seca total (MST)

Após a obtenção da MSPA, esta foi moída

Determinação do N da parte aérea (NPA) Determinação do P da parte aérea (PPA)

Análises da Planta

Nitrogênio da parte aérea (NPA)

Método de digestão sulfúrica a 450 °C

Destilação pelo método de Kjeldahl

Titulação com HCl 0,05 N

Fósforo da parte aérea (PPA)

Mufla para incineração a 500 °C por 4 horas.

Esfriar, adicionar 10 mL de HCl 1 mol L-1 e posicionam-se os cadinhos em chapa aquecida

sob exaustor, a 70°C por 10 min

Após o P é estimado por colorimetria com molibdato de amônio + ácido ascórbico em

espectrofotômetro usando filtro vermelho e comprimento de onde de 660 nm
Densidade de esporos do FMA

Sub-amostras de 10 g de substrato, peneiramento úmido malha de 0,710 mm e 0,053 mm

Centrifugação em água (3000 rpm por 3 minutos) e em sacarose 50% (2000 rpm por 2
minutos)

Peneiramento úmido em malha 0,053 mm

Contagem dos esporos

Colonização radicular por FMA

Raízes finas no comprimento de 1,5 cm

Lavadas e clareadas em KOH 10%

Lavadas e acidificadas com HCl 5%

Lavadas e adicionadas de azul de tripan 0,05%

Após as raízes coradas, foram preservadas em lactoglicerol

Verificação da percentagem de segmentos colonizados

Extração e rendimento do óleo essencial

Óleos essenciais extraídos por hidrodestilação com extrator do tipo Clevenger

100 g de folhas de Salvia officinalis para 1000 mL de água destilada

Tempo de destilação de 3 h

O óleo retirado com hexano, filtrado com Na2SO4 (Sulfato de sódio) anidro, armazenado
em frascos âmbar, sob refrigeração e aberto

Rendimento do óleo essencial em % (m/m) corresponde à relação massa/massa pela

medida da densidade
Identificação química do óleo essencial de Salvia por CG/EM

A identificação química do óleo essencial foi realizada por cromatografia gasosa acoplada
a espectro de massa CG/EM, cromatógrafo Agilent 5973 Network Mass Selective
Detector.

O gás carreador foi o hélio numa vazão de 4,8 mL min–1. A quantidade de amostra
injetada foi de 1 µL.

A temperatura da coluna foi programada com temperatura inicial de 40 °C e temperatura

final de 300 °C com rampa de 8 °C min–1. As temperaturas do injetor e do detector foram
de 250 °C e 320 °C , respectivamente.

Os espectros de massa foram registrados a 70 eV com intervalo de massa de m/z 50 a 550

amu e identificados através do programa CG/EM postrum.
Análise estatistica

Análise de variância (ANOVA)

As médias foram comparadas por meio do teste de Duncan (p≤0,05)

Foi utilizado o programa estatístico SPSS versão 22.0 para Windows (SPSS Inc., Chicago,
IL, USA)

Análise de cluster (CA)

Análise de componentes principais (PCA)

Discriminar a composição do óleo essencial

Software '' Statistica v 13.3 ″

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Tabela 1. Densidade de esporos do fungo micorrízico arbuscular (FMA) (no g–1 de solo seco)
e colonização radicular (%) por FMA da sálvia inoculada com o FMA Rhizophagus clarus e ou
Claroideoglomus etunicatum sob diferentes níveis de fósforo.

Tratamentos Esporos Colonização

Controle baixo-P 0,04±0,01c 1,52±0,29c
Controle alto-P 0,05±0,01c 0,96±0,02c
R. clarus e baixo-P 3,57±0,37a 30,66±4,97a
R. clarus e alto-P 1,93±0,14b 17,71±2,76b
C. etunicatum e baixo-P 3,85±0,34a 24,64±5,54ab
C. etunicatum e alto-P 2,23±0,19b 17,91±1,18b
Significância <0,001 <0,001
Média ± erro padrão (n=8). Médias seguidas da mesma letra na coluna, não diferem estatisticamente entre si pelo teste de Duncan (p ≤ 0,05).
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Tabela 2. Massa seca da parte aérea (MSPA – g planta–1), massa seca das raízes (MSR g
planta–1), massa seca total (MST – g planta–1), razão entre MSPA/MSR e teor de fósforo da
parte aérea (PPA – mg g–1) e nitrogênio da parte aérea (NPA – mg g–1) da sálvia inoculado
com o FMA Rhizophagus clarus e ou Claroideoglomus etunicatum sob diferentes níveis de
fósforo.

Tratamentos MSPA MSR MST MSPA/MSR P nas folhas N nas folhas

Controle baixo-P
4,02±0,51ab 0,77±0,11b 4,79±0,59ab 0,19±0,02c 4,34±0,18ab 23,28±1,11d
Controle alto-P 4,78±0,57a 1,02±0,08a 5,79±0,57a 0,23±0,03bc 4,45±0,51ab 28,18±0,50bc

R. clarus e baixo-P 3,83±0,12abc 1,06±0,07a 4,89±0,09ab 0,28±0,03b 3,93±0,01bc 30,98±1,10a

R. clarus e alto-P 3,28±0,15bc 1,17±0,09a 4,45±0,17c 0,36±0,03a 4,73±0,09a 27,82±0,91bc

C. etunicatum e baixo-P 2,77±0,34c 0,57±0,04b 3,34±0,32c 0,23±0,03bc 3,64±0,05c 25,90±0,01c

C. etunicatum e alto-P 3,10±0,09bc 0,35±0,02c 4,45±0,10bc 0,11±0,01d 3,59±0,07c 29,50±0,01ab

Significância 0,003 <0,001 <0,001 <0,001 0,020 <0,001

Média ± erro padrão (n=8). Médias seguidas da mesma letra na coluna, não diferem estatisticamente entre si pelo teste de Duncan (p ≤ 0,05).
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Tabela 3. Caracterização química (%) do óleo essencial da sávia com duas doses de P (20 e
200 mg kg–1 de solo) e inoculada ou não com o fungo micorrizico arbuscular (FMA)
Rhizophagus clarus e ou Claroideoglomus etunicatum.

• 67 compostos no OE
Tratamento α-thujone β- thujone camphor α-humulene viridiflorol Manool
T1 16,53 9,67 13,92 8,11 6,64 21,13
T2 17,68 10,89 12,94 7,03 5,49 13,78
T3 16,48 4,89 11,67 10,38 6,43 30,89
T4 20,03 10,32 16,67 6,81 5,54 14,95
T5 15,85 4,19 10,89 10,58 8,77 25,26
T6 16,54 7,53 14,65 8,71 10,06 26,69

T1 T2 T3 T4 T5 T6
Total identificado % 99,79 99,74 99,92 99,58 99,55 99,93

T1: Controle baixo-P; T2: Controle alto-P; T3: R. clarus e baixo-P; T4: R. clarus e alto-P; T5: C. etunicatum e baixo-P e T6: C.
etunicatum e alto-P.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.2

a
b

0.42

c
d d d

Figura 1. Conteúdo de óleo essencial (%) da sálvia inoculada com o FMA Rhizophagus clarus
e ou Claroideoglomus etunicatum sob diferentes níveis de fósforo.
Colunas seguidas da mesma letra, não diferem significantemente entre si pelo teste de Duncan (p ≤ 0,05). Barras = erro
padrão.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Tabela 4. Caracterização química (%) dos componentes majoritários do óleo essencial de S.
officinalis com duas doses de P (20 e 200 mg kg–1 de solo) e inoculada ou não com o fungo
micorrizico arbuscular (FMA) Rhizophagus clarus e ou Claroideoglomus etunicatum.

Tratamento α-thujone β- thujone camphor α-humulene viridiflorol Manool Yield

T1 16,53 9,67 13,92 8,11 6,64 21,13 0,45
T2 17,68 10,89 12,94 7,03 5,49 13,78 0,92
T3 16,48 4,89 11,67 10,38 6,43 30,89 3,82
T4 20,03 10,32 16,67 6,81 5,54 14,95 4,2
T5 15,85 4,19 10,89 10,58 8,77 25,26 0,48
T6 16,54 7,53 14,65 8,71 10,06 26,69 0,42

Média 19,80 5,76 16,35 4,31 6,18 8,49 1,33

Erro padrão 0,96 0,52 0,75 0,34 0,54 1,13 0,07
Amplitude 1,2-49,7 0,1-38,5 1,3-38 0,11-14,1 0,1-21,77 0,3-28,13 0,22-2,8
Observações (n) 106 105 105 86 85 50 62
T1: Controle baixo-P; T2: Controle alto-P; T3: R. clarus e baixo-P; T4: R. clarus e alto-P; T5: C. etunicatum e baixo-P e T6: C.
etunicatum e alto-P.
 RESULTADOS E DISCUSSÃO
W a rd `s m e th o d
E u c lid e a n d is ta n c e s
7

6
L in k a g e D is ta n c e

5
Manool ↓

0
T4 T2 T3 T6 T5 T1

Figura 2. Dendrograma de agrupamento hierárquico obtido na análise de agrupamento dos

óleos essenciais da sálvia inoculado com o FMA Rhizophagus clarus e ou Claroideoglomus
etunicatum sob diferentes níveis de fósforo com base nos dados da Tabela 3.
T1: Controle baixo-P; T2: Controle alto-P; T3: R. clarus e baixo-P; T4: R. clarus e alto-P; T5: C. etunicatum e baixo-P e T6: C.
etunicatum e alto-P.
 RESULTADOS E DISCUSSÃO

M an o o l

2
P C A 2: 4,48%

α - H um ule n e
Vir idif lo r o l
C a r y o p h y lle n e
E p im a n o o l
Variância total de 98,04% C ß- P
a rMyT
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t
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y reel-uje ao cba
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ß- T h ujo n e
-2

-1 4 -1 2 -1 0 -8 -6 -4 -2 0 2 4

P C A1: 93,56%

Figura 3. Uma representação biplot do óleo essencial (OE) das plantas sálvia inoculado com o
FMA Rhizophagus clarus e ou Claroideoglomus etunicatum sob diferentes níveis de fósforo
de acordo com a análise de componentes principais (PCA).
 CONCLUSÕES

• Conclui-se que houve uma interação entre os fungos micorrízicos

arbusculares (FMAs) e o P adicionado no subtrato. A adição de P
ao substrato resultou no aumento da massa seca da sálvia.

• O conteúdo de OE foi aumentado com a inoculação do FMA R.

clarus, principalmente nas plantas cultivadas com alta adição de
P no substrato. A composição química do OE apresentou como
componentes majoritários α-thujone, β- thujone, camphor, α-
humulene, viridiflorol e mannol.

• O composto manool aumentou consideravelmente, passando da

média geral de 8,46% para até 30,89% com a inoculação do FMA
R. clarus.
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CAPITULO II

Análises fitoquímicas de Cymbopogon citratus (D.C.) Stapf

coinoculado com micorrizas e Azospirillum
 INTRODUÇÃO

• Cymbopogon citratus (D.C.) Stapf

popularmente conhecido como
capim limão.

• O conteúdo de óleo essencial (OE)

das folhas de capim limão é
amplamente utilizado devido ao seu
alto teor de citral que possui um
forte aroma de limão

• Metabólitos secundários em plantas

pode mudar em resposta a uma série
de condições ambientais.

• Para um melhor desenvolvimento da

planta é crescente o uso de fungos
micorrízicos arbusculares (FMAs).
• Os FMAs formam associação simbiótica
mutualística com as raízes da maioria das
espécies de plantas superiores.

• O FMA pode levar a aumento da

biossíntese de fitoquímicos promotores da
saúde (polifenóis, carotenóides,
flavonoides e fitoestrogênios) e para uma
maior atividade de enzimas antioxidantes

• As rizobactérias promotoras de
crescimento de plantas (RPCP) estão entre
os grupos microbianos que podem
favorecer a germinação de esporos de
FMAs devido à produção de alguns
compostos como CO2, etileno, amoníaco,
aminas, álcoois, compostos de enxofre
• Apesar de os benefícios dos FMAs e RPCP serem conhecidos
isoladamente, não se tem conhecimento de estudos com a planta
capim limão coinoculadas com FMA e a RPCP A. brasilense,
principalmente quando se trata das respostas fitoquímicas da planta
frente a essa coinoculação.
OBJETIVO

Avaliar as respostas fitoquímicas tais como: açucares totais e

redutores, fenólicos, flavonoides e DPPH e o comportamento do
rendimento e composição química dos componentes majoritários
do óleo essencial do capim limão, quando inoculados com A.
brasilense e os FMAs Rhizophagus clarus e Claroideoglomus
etunicatum.
MATERIAL E MÉTODOS
Design experimental
O solo utilizado no experimento foi coletado na fazenda experimental da UNIPAR

Peneirado em malha 4 mm e esterilizado em autoclave por 1 hora, a 120 °C

mudas jovens de capim-limão, com aproximadamente 20 cm

O delineamento experimental inteiramente casualizado com 8 repetições por tratamento

em um fatorial de 2x3, num  total de 48 unidades experimentais

Trat 1: solo autoclavado

Trat 2: solo autoclavado + R. clarus
Trat 3: solo autoclavado + C. etunicatum
Trat 4: solo autoclavado + A. brasilense
Trat 5: solo autoclavado + R. clarus + A. brasilense
Trat 6: solo autoclavado + C. etunicatum + A. brasilense
Determinação dos açúcares totais e redutores
Açúcares totais foi realizada pelo método fenol sulfúrico

A leitura da absorbância foi realizada em espectrofotômetro a 540 nm.

Açúcares redutores foram quantificados pelo método Dinitrosalicilato – DNS adaptado

para microplacas

A leitura da absorbância foi realizada em espectrofotômetro a 540 nm.

Foi utilizada curva de calibração previamente estabelecida utilizando glicose como

padrão.
Determinação do teor de fenólicos, flavonoides e atividade antioxidante DPPH

Os fenólicos totais foram determinados colorimetricamente utilizando o reagente de

Folin-Ciocalteu. Curva padrão com ácido gálico.

Leitura foi realizada em espectrofotômetro a 760 nm.

O teor de flavonóides totais foi determinado a partir da formação de um complexo

flavonóide-alumínio. Curva padrão de quercetina.

Leitura foi realizada em espectrofotômetro a 425 nm.

A atividade antioxidante dos extratos de folhas de plantas e antioxidantes padrão foi

avaliada com base no efeito sequestrador de radicais livres de DPPH (2,2-difenil-1-
picrilhidrazila)

Leitura foi realizada em espectrofotômetro a 515 nm.

Extração e rendimento do óleo essencial

Óleos essenciais extraídos por hidrodestilação com extrator do tipo Clevenger

100 g de folhas de C. citratus para 1000 mL de água destilada

Tempo de destilação de 3 h

O óleo retirado com hexano será filtrado com Na2SO4 (Sulfato de sódio) anidro,
armazenado em frascos âmbar, sob refrigeração e aberto

Rendimento do óleo essencial em % (m/m) corresponde à relação massa/massa pela

medida da densidade
Identificação química do óleo essencial de Capim Limão por CG/EM

A identificação química do óleo essencial foi realizada por cromatografia gasosa acoplada
a espectro de massa CG/EM, cromatógrafo Agilent 5973 Network Mass Selective
Detector.

O gás carreador foi o hélio numa vazão de 4,8 mL min–1. A quantidade de amostra
injetada foi de 1 µL.

A temperatura da coluna foi programada com temperatura inicial de 40 °C e temperatura

final de 300 °C com rampa de 8 °C min–1. As temperaturas do injetor e do detector foram
de 250 °C e 320 °C , respectivamente.

Os espectros de massa foram registrados a 70 eV com intervalo de massa de m/z 50 a 550

amu e identificados através do programa CG/EM postrum.
Análise Estatística

Análise de variância (ANOVA)

As médias foram comparadas por meio do teste de Duncan (p≤0,05)

Foi utilizado o programa estatístico SPSS versão 22.0 para Windows (SPSS Inc., Chicago,
IL, USA)

Análise de cluster (CA)

Análise de componentes principais (PCA)

Discriminar a composição do óleo essencial

Software '' Statistica v 13.3 ″

RESULTADOS E DISCUSSÃO
Tabela 2. Açúcar redutor (µg/g de massa fresca) (ACR), açúcar total (mg/g de massa fresca)
(ACT), flavonoides (mg/g de massa fresca) (FLAV), fenóis (µg/g de massa fresca) (FEN) e
atividade antioxidante DPPH (%) (DPPH (%)) de Cymbopogon citratus Stapf, inoculado com
fungos micorrizicos arbusculares R. clarus e/ou C. etunicatum na presença e ausência de
Azospirillum®

Tratamento ACR ACT FLAV FEN DPPH (%)

T1 0,18 ± 0,00 b 69,10 ± 5,25 b 174,50 ± 14,28 c 754,98 ± 29,07 b 60,60 ± 1,88 c

T2 0,19 ± 0,00 b 75,83 ± 11,54 b 391,88 ± 99,77 b 671,37 ± 58,14 b 170,80 ± 6,85 b

T3 0,21 ± 0,00 a 67,44 ± 3,01 b 598,80 ± 17,80 a 741,95 ± 30,95 b 203,80 ± 7,91 b

T4 0,21 ± 0,00 a 66,93 ± 8,47 b 416,88 ± 52,12 b 697,53 ± 34,47 b 263,22 ± 21,19 a

T5 0,19 ± 0,00 b 126,65 ± 23,30 a 390,22 ± 31,04 b 646,69 ± 56,14 b 190,32 ± 8,50 b

T6 0,20 ± 0,00 ab 71,93 ± 9,58 b 552,05 ± 37,42 ab 1600,16 ± 139,45 a 177,50 ± 12,44 b
Média ± desvio padrão (n=8). Médias seguidas da mesma letra na coluna, não diferem estatisticamente entre si pelo teste de Duncan (p
≤ 0,05).
T1: Controle; T2: R. clarus; T3: C. etunicatum; T4: A. brasilense; T5: R. clarus e A. brasilense e T6: C. etunicatum e A. brasilense.
 RESULTADOS E DISCUSSÃO
Tabela 3. Caracterização química (%) dos componentes majoritários e rendimento do óleo
essencial de C. citratus inoculado ou não com o fungo micorrizico arbuscular (FMA)
Rhizophagus clarus e ou Claroideoglomus etunicatum, na presença e ausência de
Azospirillum brasilense.
Tratamento β-mirceno Isoneral Neral Geraniol Citral Rendimento
T1 6,72 2,3 29,82 4,97 43,27 0,68
T2 6,83 2,28 29,95 6,19 45,44 0,34
T3 7,32 2,13 28,47 6,56 43,11 0,20
T4 8,36 1,93 26,9 5,84 40,13 0,52
T5 8,01 1,87 27,57 7,43 40,68 0,44
T6 9,5 2,39 42,17 2,81 30,36 0,75

Mean 5,09 0,46 26,76 3,03 58,35 0,87

SD 4,47 0,40 8,40 2,52 28,55 0,36
SE 0,78 0,09 1,20 0,43 5,83 0,05
Amplitude 0,24-13,9 0,09-1,56 5-39,25 0,4-11,87 7,34-88,29 0,46-2,7
N 33 18 49 34 24 54
T1: Controle; T2: R. clarus; T3: C. etunicatum; T4: A. brasilense; T5: R. clarus e A. brasilense e T6: C. etunicatum e A. brasilense.
Mean: media, SD: desvio padrão; SE: erro padrão; Amplitude: diferença entre o maior e o menor valor e N: número de observações
 RESULTADOS E DISCUSSÃO
W ard `s m et h o d
E u c lid e a n d is t a n c e s
2 ,0

Neral Citral
1 ,5
L in k a g e D is ta n c e

1 ,0

0 ,5

0 ,0
T6 T5 T4 T3 T2 T 1

Figura 1. Dendrograma de agrupamento hierárquico obtido na análise de agrupamento dos

óleos essenciais do capim limão inoculado com o FMA Rhizophagus clarus e ou
Claroideoglomus etunicatum sob presença e ausência de Azospirillum brasilense com base
nos dados da Tabela 2.
T1: Controle; T2: R. clarus; T3: C. etunicatum; T4: A. brasilense; T5: R. clarus e A. brasilense e T6: C. etunicatum e A.
brasilense.
 RESULTADOS E DISCUSSÃO
0,8

0,6 C it ra l

0,4

Ge ra n io l
0,2
T 3T 5
P C A 2 : 3 ,2 9 %

T2 T4 S e lin -6 -e n -4 .a lp h a .-o l
T1 Is o n e ra l
0,0
ß -m irc e n o

-0 , 2
Variância total de 99.86%
T6
-0 , 4

-0 , 6

N e ra l
-0 , 8

-1 , 0
-5 -4 -3 -2 -1 0 1 2 3
P C A 1: 96 ,5 7 %

Figura 2. Uma representação biplot do óleo essencial (OE) das plantas de capim limão
inoculado com o FMA Rhizophagus clarus e ou Claroideoglomus etunicatum sob presença e
ausência de Azospirillum brasilense de acordo com a análise de componentes principais
(PCA).
T1: Controle; T2: R. clarus; T3: C. etunicatum; T4: A. brasilense; T5: R. clarus e A. brasilense e T6: C. etunicatum e A.
brasilense.
 CONCLUSÕES

• A coinoculação entre o FMA C. etunicatum e A. brasilense

modificou a composição química do OE, apresentando o neral
como majoritário e aumentando o conteúdo do OE, destacando-
se também como principal precursor de fenóis totais.

• Atualmente, pouco se sabe sobre a coinoculação de FMAs e RPCP

no metabolismo de plantas medicinais como o capim limão,
entretanto o presente estudo ressalta a importância da aplicação
dos mesmos de acordo com as exigências comerciais e/ou
medicinais para qual se destina o cultivo.
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AGRADECIMENTOS
OBRIGADA !

“Feliz aquele que transfere o que sabe e aprende o que ensina...”

“Estamos todos matriculados na escola da vida, onde o mestre é o tempo.”

Cora Coralina