UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE - FURG

ESCOLA DE QUÍMICA E ALIMENTOS - EQA CURSO

DE QUÍMICA

Bruna Campagnucci
Caroline do Amaral
Suelen Bromberger

Estudo das condições de reação da enzima Peroxidase:

pH e força iônica

Disciplina: Bioquímica de Alimentos II

Professor: Jaqueline Garda Buffon

Rio Grande
2021
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1 OBJETIVO
Padronizar as condições de reação da enzima PO obtida a partir da batata avaliando
pH e força iônica.

2 RESULTADOS E DISCUSSÃO
Para identificar a presença de proteína foi realizada a leitura do branco e do extrato
enzimático diluído 25 vezes após incubação a 37 ºC por 10 min, em espectrofotômetro a 540
nm, ambos em triplicata. Todas as amostras apresentaram coloração azul após incubação,
confirmando a presença de proteína no extrato enzimático. A leitura corrigida da medida de
proteína e a massa de proteína foram apresentadas na tabela 1.

Tabela 1 - Medida de Proteína

Média Extrato Absorbância Média Massa de

Amostra Branco brancos enzimático corrigida absorbância proteína
(mL) diluído (mg/mL) corrigida (mg)
1 0,0768 0,2769 0,2035
0,0734 0,1988 115
2 0,0711 0,2683 0,1949
3 0,0723 0,2715 0,1981

Para o cálculo da média dos brancos utilizou-se a equação:

(1)

Já para o cálculo da absorbância corrigida foi utilizada a fórmula:

𝐴𝐵𝑆 𝑐𝑜𝑟𝑟𝑖𝑔𝑖𝑑𝑎 = (𝐸𝑥𝑡𝑟𝑎𝑡𝑜 𝑒𝑛𝑧𝑖𝑚á𝑡𝑖𝑐𝑜 𝑑𝑖𝑙𝑢í𝑑𝑜) − (𝑀é𝑑𝑖𝑎 𝑏𝑟𝑎𝑛𝑐𝑜𝑠) (2)
E para o cálculo da massa de proteína no extrato diluído foi utilizada a equação da reta resultante
da curva padrão da albumina (3) e o resultado foi multiplicado pelo volume total do tubo de
quantificação da proteína e pelo fator de diluição:
( 𝑦 = 0,2377 ⋅ 𝑥) ∗ 5,5 𝑚𝐿 ∗ 25 (3)

Para calcular a medida de atividade enzimática em relação ao pH e a força iônica,

primeiramente foi realizada a leitura dos brancos em espectrofotômetro a 470 nm. Os resultados
foram apresentados na tabela 2.

Tabela 2 - Média dos brancos

Amostra Branco (mL) Média brancos (mL)
1 0,0578
2 0,0613 0,0596
3 0,0597
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Com o intuito de medir a atividade enzimática da PO em batatas, 1mL de extrato

enzimático diluído foi adicionado a um tubo de ensaio com 1,5 mL de tampão fosfato pH 6, 2
mL de água destilada, 0,5 mL do substrato guaiacol na concentração de 1% e 1 mL de peróxido
de hidrogênio a 0,08%.

Tabela 3 - Medida de atividade enzimática da PO em relação a força iônica.

Concentração Média Média

Exp. do Tampão ABS-Extrato brancos Absorbância absorbância

O tempo e a temperatura são condições que influenciam a atividade enzimática, o

tempo incentiva a maior produção de produto, enquanto houver substrato, e onde tiver maior
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tempo de interação da enzima com o substrato. Já a temperatura possui um valor ótimo e pode
proporcionar maior velocidade da reação a partir do seu aumento, porém somente até atingir o
seu máximo (MOTTA, 2011).
A análise em relação à força iônica foi realizada variando a concentração do tampão
fosfato pH 6. A mistura foi incubada durante 5 minutos a 30 ºC conforme resultados da
avaliação de tempo e temperatura. Após incubação foi realizada a leitura em triplicata no
espectrofotômetro a 470 nm. Os resultados da leitura corrigida foram expressos na tabela 3.

Tabela 4 - Medida de atividade enzimática da PO em relação ao pH.

pH do ABS-Extrato Média Absorbância Média

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Com isso, na tabela 4 foi apresentado os resultados da leitura corrigida em relação ao

pH, onde o pH do tampão fosfato adicionado ao tubo de ensaio foi variado. A mistura também
foi incubada durante 5 minutos a 30 ºC conforme resultados da avaliação de tempo e
temperatura e a leitura foi realizada em triplicata em espectrofotômetro a 470 nm. O
experimento que apresentou maior absorbância na variação de pH foi o experimento 3 com
tampão fosfato pH 5,5.
A partir da média da absorbância corrigida e da massa de proteína foi possível calcular
as unidades por g, mL e mg em relação ao tempo e a temperatura. Os resultados foram
apresentados nas tabelas 5 e 6.

Tabela 5 - Unidades por g, mL e mg em relação a força iônica.

Concentração do
Experimento Tampão Fosfato U/mL U/g U/mg
pH 6 (mM)
1 5 1,2474 2494,74 0,0108
2 10 1,5419 3083,91 0,0134
3 20 1,7847 3569,32 0,0155
4 30 2,0179 4035,79 0,0175
5 40 2,7284 5456,84 0,0237
6 50 2,3689 4737,74 0,0206
7 75 2,0007 4001,50 0,0174
8 100 1,7576 3515,19 0,0153
9 125 1,7499 3499,85 0,0152
10 150 1,7125 3424,96 0,0149

A reação enzimática é influenciada pela quantidade de substrato presente no meio, a

enzima depende da ligação com o substrato, ou seja, pequenas concentrações de substrato
podem dificultar a interação com enzimas no meio, e consequentemente diminuir a velocidade
da reação (MOTTA, 2011). Na tabela 5, foi possível identificar que o experimento 5, com
concentração igual a 40 mM, foi o que desenvolveu a maior atividade enzimática na batata
(0,0237 U/mg). Portanto, é o experimento em que há maior concentração de substrato,
aumentando as interações com as moléculas enzimáticas do meio.
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Tabela 6 - Unidades por g, mL e mg em relação ao pH.

Experimento pH do Tampão U/mL U/g U/mg
fosfato
1 4,5 1,3872 2774,44 0,0121
2 5,0 2,1180 4236,09 0,0184
3 5,5 2,5047 5009,32 0,0218
4 6,0 2,0035 4006,92 0,0174
5 6,5 1,6805 3360,90 0,0146
6 7,0 1,1671 2334,14 0,0101
7 7,5 0,9853 1970,53 0,0086
8 8,0 2,5132 5026,47 0,0219
9 8,5 0,6744 1348,87 0,0059
10 9,0 0,3713 742,56 0,0032

Os resultados foram obtidos através das fórmulas:

𝑈𝑚𝐿−1 = 𝑝𝑟𝑜𝑑𝑢𝑡𝑜 𝑓𝑜𝑟𝑚𝑑𝑜

(4) 𝑣𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒
(5)

(6)
𝑝𝑟𝑜𝑑𝑢𝑡𝑜 𝑓𝑜𝑟𝑚𝑎𝑑𝑜 = ((𝐴𝐵𝑆 ∗ 𝑉𝑟 ∗ 𝐹𝐷 ∗ 1000)/(𝜀 ∗ 𝑅))
(7)
O pH apresenta um valor ótimo, assim como a temperatura, no qual a enzima se mostra
mais ativa, a velocidade da reação diminui à medida que o pH se afasta desse valor ótimo.
Portanto, os estudos referentes ao pH são pertinentes em relação à atividade enzimática
(MARZOCCO, 2015).
Martins et al, 2021 avaliaram e compararam a atividade enzimática da peroxidase em
duas espécies diferentes de butiás, Butia catarinensis e Butia yatay, submetidas a diferentes pH
e temperaturas. Assim, os autores identificaram que as duas frutas analisadas apresentaram
atividade enzimática máxima no pH 5 à 45 ºC. No presente trabalho, podemos identificar na
tabela 6 que o experimento 8 foi o que gerou a melhor atividade enzimática da peroxidase na
batata, onde obteve 0,0219 U/mg.
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3 CONCLUSÃO
Com base nos resultados obtidos no presente trabalho foi possível identificar que o
experimento 5 em relação a força iônica (40 mM) e o experimento 8 em relação ao pH (pH 8,0)
foram os mais adequados para padronizar as condições de reação da enzima PO obtida a partir
da batata

REFERÊNCIAS

MARRZZOCO, A. Bioquímica Básica. Quarta Edição. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan,

2015.
MARTINS, J.; CARDOSO, F.; MELO, EHERTZ, P. Caracterização e Comparação das
Atividades Enzimáticas das Peroxidases (POD) de Butia Catarinenses e de Butia Yatay. VII
Siepex-salão Integrado de Ensino, Eesquisa e Extensão da UERGS. Brasil, 2017.
MOTTA, V. T. Introdução à Bioquímica. Laboratório Autolab LTDA, 2005.