Visão geral: Clonagem

de DNA
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EM13CNT304

Definição, finalidade e os
passos básicos da clonagem do
DNA.

Pontos Principais:
Clonagem de DNA é uma técnica da biologia molecular para fazer
muitas cópias idênticas de um pedaço de DNA, tal como um gene.

Num experimento típico de clonagem, um gene alvo é inserido num

pedaço circular de DNA chamado do plasmídeo.

O plasmídeo é introduzido em bactérias através de um processo

chamado transformação, e bactérias portadoras do plasmídeo são
selecionadas utilizando-se antibióticos.

As bactérias com o plasmídeo correto são utilizadas para produzirem

mais DNA do plasmídeo ou, em alguns casos, induzidas a expressar o
gene e produzir proteína.

Introdução
Quando você ouve a palavra “clonagem,” você pode pensar na clonagem
de um organismo inteiro, como a ovelha Dolly. Porém, o significado
de clonar alguma coisa é fazer uma cópia geneticamente exata dela. Num
laboratório de genética molecular, o que é clonado com maior frequência é
um gene ou um pequeno pedaço de DNA.
Se sua amiga bióloga molecular disser que sua "clonagem" não está
funcionando, ela quase certamente estará falando acerca da cópia de
pedaços de DNA, não de estar fazendo a próxima Dolly!

Visão geral da clonagem de DNA

Clonagem de DNA é o processo de fazer várias cópias idênticas de um
pedaço específico de DNA. Num procedimento típico de clonagem de
DNA, o gene ou outro fragmento de DNA de interesse (talvez um gene
para uma proteína humana de interesse médico) é primeiramente inserido
numa peça circular de DNA chamada plasmídeo. A inserção é feita
utilizando-se enzimas que “cortam e colam” DNA, e produz uma molécula
de DNA recombinante, ou seja, DNA montado a partir de fragmentos de
várias fontes.

Em seguida o plasmídeo recombinante é introduzido em bactérias. As

bactérias contendo plasmídeo são selecionadas e cultivadas. Conforme
elas se reproduzem, replicam o plasmídeo e o transmitem para seus
descendentes, produzindo cópias do DNA que ele contém.

Qual a finalidade de produzir várias cópias de uma sequência de DNA num

plasmídeo? Em alguns casos, precisamos de muitas cópias de DNA para
realizar experimentos ou construir novos plasmídeos. Em outros, o pedaço
de DNA codifica uma proteína útil, e as bactérias são usadas como
"fábricas" para produção dessa proteína. Por exemplo, o gene da insulina
humana é expresso em bactérias E. coli para produzir a insulina usada
pelos diabéticos.

[Mais sobre insulina e diabetes]

Etapas da clonagem do DNA
A clonagem do DNA é utilizada para várias finalidades.Como exemplo,
vejamos como a clonagem do DNA pode ser utilizada para sintetizar uma
proteína (como a insulina humana) nas bactérias. As etapas básicas são:

1. Cortar e abrir o plasmídeo e "inserir" o gene. Esse processo baseia-se

em enzimas de restrição (que cortam o DNA) e na DNA ligase (que
une/cola o DNA).

2. Inserir o plasmídeo na bactéria. Utilizar a seleção por antibiótico para

identificar as bactérias que pegaram o plasmídeo.

3. Cultivar lotes de bactérias portadoras de plasmídeo e usá-las como

"fábricas" para fazer a proteína. Colher a proteína das bactérias e
purificá-la.

Vamos dar uma olhada mais detalhada em cada etapa.

1. Cortando e colando DNA

Como pedaços de DNA de diferentes fontes podem ser unidos? Um
método comum utiliza dois tipos de enzimas: enzimas de restrição e DNA
ligase.

Um enzima de restrição é uma enzima cortadora de DNA que reconhece

uma sequência alvo específica e corta o DNA em dois pedaços neste sítio
ou próximo a ele. Muitas enzimas de restrição produzem extremidades
cortadas com saliências curtas de fita simples. Se duas moléculas tiverem
saliências correspondentes, elas podem parear bases e permanecer
juntas. Contudo, elas não irão se combinar para formar uma molécula de
DNA intacta até que sejam unidas pelo DNA ligase, que sela as lacunas
do eixo do DNA.
[Veja o diagrama das enzimas de restrição e da DNA ligase]

Nossa meta na clonagem é inserir um gene alvo (p.e., para insulina

humana) num plasmídeo. Usando uma enzima de restrição
cuidadosamente escolhida, digerimos:

O plasmídeo, que tem um único local de corte

O fragmento do gene alvo, que tem um sítio de restrição (de corte)
próximo a cada extremidade

Então, combinamos os fragmentos com DNA ligase, que os une para fazer
um plasmídeo recombinante contendo o gene.

2. Transformação e seleção bacteriana

Os plasmídeos e outros DNA podem ser introduzidos nas bactérias, como
as inofensivas E. coli utilizadas em laboratório, num processo
chamado transformação. Durante a transformação, é dado um choque
(por exposição a alta temperatura, por exemplo) a células bacterianas
especialmente preparadas que as encoraja a incorporar DNA estranho.

[Por que um choque de calor faz bactérias incorporarem DNA?]

Um plasmídeo geralmente tem um gene de resistência aos antibióticos,
que permite que as bactérias sobrevivam na presença de um antibiótico
específico. Assim, as bactérias portadoras de plasmídeo podem
ser selecionadas em placas com nutrientes contendo o antibiótico. As
bactérias sem plasmídeo morrerão, enquanto bactérias portadoras de
plasmídeo podem viver e reproduzir-se. Cada bactéria sobrevivente dará
origem a um grupo pequeno, como um ponto, ou colônia, de bactérias
idênticas em que todas carregam o mesmo plasmídeo.

Nem todas as colônias irão necessariamente conter o plasmídeo certo.

Isso acontece porque, durante uma ligação, fragmentos de DNA nem
sempre ficam "colados" exatamente da maneira que queremos. Em vez
disso, devemos coletar o DNA de várias colonias e ver se cada uma
contém o plasmídeo certo. Métodos como digestão por enzima de restrição
e PCR/RCP são comumente usados para checar os plasmídeos.

3. Produção de proteína
Uma vez que encontramos uma colonia de bactérias com o plasmídeo
certo, podemos cultivar uma grande cultura de bactérias portadoras do
plasmídeo. Nesse momento, damos às bactérias um sinal químico que as
instrui a produzir a proteína alvo.

As bactérias servem como mini "fábricas," produzindo grandes

quantidades de proteína. Por exemplo, se nosso plasmídeo continha o
gene da insulina humana, as bactérias começariam a transcrição do gene
e a tradução do RNAm para produzir muitas moléculas da proteína insulina
humana. [Mais sobre a expressão de genes humanos em bactérias]
Uma vez que a proteína tenha sido produzida, as células bacterianas
podem ser abertas para liberá-la. Existem muitas outras proteínas e
macromoléculas flutuando nas bactérias além da proteína alvo (por
exemplo, a insulina). Devido a isso, a proteína alvo deve ser purificada,
ou separada dos outros conteúdos das células por técnicas bioquímicas. A
proteína purificada pode ser usada para experimentos ou, no caso de
insulina, administrada aos pacientes. 
[É assim tão simples produzir insulina?]

Usos da clonagem de DNA

As moléculas de DNA construídas a partir de técnicas de clonagem são
utilizadas para vários propósitos em biologia molecular. Uma curta lista de
exemplos inclui:

Biofarmacêuticos. A clonagem do DNA pode ser usada para produzir

proteínas humanas com aplicações biomédicas, como a insulina
mencionada acima. Outros exemplos de proteínas recombinantes
incluem o hormônio do crescimento humano, que é ministrado a
pacientes incapazes de sintetizá-lo, e o ativador de plasminogênio
tecidual (tPA/ APt), que é usado para tratar derrames e prevenir
coágulos sanguíneos. Proteínas recombinantes como estas.
frequentemente são produzidas em bactérias.

Terapia genética. Em algumas desordens genéticas, os pacientes não

possuem a forma funcional de um gene particular. A terapia genética
tenta fornecer uma cópia normal do gene para as células do corpo do
paciente. Por exemplo, a clonagem do DNA foi usada para construir
plasmídeos com uma versão normal do gene que é não funcional na
fibrose cística. Quando os plasmídeos foram liberados nos pulmões
 dos pacientes com fibrose cística, a função pulmonar deteriorou menos
rapidamente2 .
Análise genética. Em laboratórios de pesquisa básica , os biólogos
geralmente usam a clonagem de DNA para construir versões artificiais,
recombinantes dos genes que os ajudam a compreender como é a
função normal dos genes num organismo. [Veja um exemplo]
Estes são apenas alguns exemplos de como a clonagem de DNA é usada
atualmente na biologia. A clonagem de DNA é uma técnica muito comum
usada numa enorme variedade de aplicações de biologia molecular.