ENZIMAS DE RESTRIÇÃO

Endonucleases de restrição

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 PONTOS PRINCIPAIS:

Enzimas de restrição são enzimas que reconhecem e cortam

sequências curtas de DNA. Cada enzima reconhece uma ou
mais sequências alvo e corta o DNA nestas sequências.

Muitas enzimas de restrição fazem cortes escalonados,

produzindo terminações com DNA fita simples (pontas
adesivas). No entanto, algumas produzem extremidades com
cortes DNA fita dupla.
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SÍTIO EcoR1
RECONHECE LIGAÇÕES A-G
 Se outro pedaço de DNA tiver terminação correspondente (por
exemplo, porque ele também foi cortado pela EcoRI), as
terminações podem se juntar por pareamento de bases
complementares.
Enzimas que deixam terminações de fita única
produzem extremidades adesivas

Extremidades adesivas são úteis em clonagem porque seguram

dois pedaços de DNA que podem ser ligados pela DNA ligase.
Nem todas as enzimas de restrição produzem extremidades adesivas.
Algumas são "cortadoras bruscas" que cortam no meio de uma
sequência alvo e não deixam terminação. A enzima de restrição SmaI
é um exemplo de enzima que faz cortes bruscos:

Podem ser unidos um ao outro pela DNA ligase. No entanto, fragmentos

deste tipo são mais difíceis de se ligarem porque não há terminações de
fita única para manter as moléculas de DNA na posição.
DNA ligase
Na replicação de DNA, o trabalho das ligases é
unir fragmentos de DNA recém sintetizados
para formar uma fita sem emenda. As ligases
usadas na clonagem de DNA fazem
basicamente a mesma coisa. Se dois pedaços
de DNA tiverem terminações
complementares, a DNA ligase pode juntá-las
para fazer uma molécula intacta.
DNA ligase
DNA RECOMBINANTE
DOMINGO, 10 DE FEVEREIRO DE 13 12
CONSTRUÇÃO DE UM PLASMÍDIO RECOMBINANTE

Gene alvo
Gene alvo

Sítio EcoR1 Sítio EcoR1

Plasmídeo
Sítio EcoR1
 CONSTRUÇÃO DE UM PLASMÍDIO RECOMBINANTE

Objetivo é usar a enzima EcoRI para inserir o gene no

plasmídeo.

Primeiro: digestão (corte) do fragmento do gene e o do

plasmídeo com EcoRI.

Este passo produz fragmentos com extremidades adesivas

CONSTRUÇÃO DE UM PLASMÍDIO RECOMBINANTE

Gene alvo
Gene alvo

Plasmídeo
CONSTRUÇÃO DE UM PLASMÍDIO RECOMBINANTE

Em seguida, pegamos o fragmento de gene e um plasmídeo

linearizado (aberto) e os combinamos com a DNA ligase. As
extremidades adesivas dos dois fragmentos unem-se por
pareamento de bases complementares
CONSTRUÇÃO DE UM PLASMÍDIO RECOMBINANTE

Gene alvo

Plasmídeo
CONSTRUÇÃO DE UM PLASMÍDIO RECOMBINANTE

Uma vez que eles foram unidos pela DNA ligase, os

fragmentos se tornam um único pedaço de DNA
intacto. O gene alvo agora está inserido no plasmídeo,
fazendo um plasmídeo recombinante.
CLONAGEM
MOLECULAR
ENGENHARIA GENÉTICAI

DOMINGO, 10 DE FEVEREIRO DE 13 15
P Cromossomo
Plasmídeo

Bactéria

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ENZIMA DE
RESTRIÇÃO

DOMINGO, 10 DE FEVEREIRO DE 13

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ENZIMA DE
RESTRIÇÃO

DOMINGO, 10 DE FEVEREIRO DE 13

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 GENE DE
Enzima derestrição INTERESSE

17
GENE DE
INTERESSE

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GENE DE
INTERESSE

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DOMINGO, 10 DE FEVEREIRO DE 13

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20
ENGENHARIA
BACTERIANA
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TRANSGÊNESE

O processo de alteração do material

genético de uma espécie pela introdução
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de uma ou mais sequências

de genes provenientes de outra espécie
TRANSGÊNESE

Transgene se refere ao material genético extraído de

determinado ser vivo e que é introduzido em outro.

Transgênico, por sua vez, se refere ao organismo que foi

geneticamente modificado.
Desenvolvimento de vegetais resistentes a pragas e de
melhor qualidade.

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Transgenia: produção de insulina humana
 PLANTAS
• Plasmídio da bactéria
Agrobacterium
• Multiplicação do
DNA
• Injeção do DNA
em planta
 BIBLIOTECAS
MOLECULARES
 BIBLIOTECAS
Conjunto de todos os genes de uma determinada espécie
MOLECULARES
armazenados na forma de moléculas de DNA recombinante.
BIBLIOTECAS MOLECULARES
Bibliotecas Genômicas

- Formadas a partir de DNA genômico

- DNA genômico pode ser quebrado mecanicamente

ou enzimaticamente em pedaços menores

- Clonados em fagos e plasmídios.

BIBLIOTECAS GENÔMICAS
 Bibliotecas Moleculares
 Bibliotecas cDNA (DNA complementar)

- Representa o conteúdo de mRNA de uma

célula/tecido- Transcriptoma
- Clonagem apenas das mensagens dos genes.
- É mais seletiva
- Isolamento de genes específicos
 Bibliotecas de cDNA
Dependente da síntese de um cDNA a partir de um mRNA
- Transcriptase reversa

Extração de
RNA total
 Bibliotecas de cDNA
RNA total

Purificação do
mRNA
DNA Genômico x cDNA