replicação do dna + reação de pcr
Replicação do DNA que isso seja possível, é preciso que na interfase
• Objetivos:
• Apresentar o processo de replicação do DNA e
os seus principais componentes moleculares.
• Caracterizar a técnica de reação em cadeia da
polimerase (PCR), correlacionando-a com a
replicação do DNA in vivo.
• Explicar como a técnica de PCR pode ser utilizada
para o diagnóstico molecular de processos
infecciosos e patológicos.
• Motivo para Replicar
Porque a célula precisa replicar o material genético
(DNA)? Qual a motivação?
• A principal motivação é a divisão celular. Essa
divisão pode ser para renovação, para a
substituição de células perdidas.
• A replicação acontece porque a célula vai fazer
a divisão.
• Pensando nas células somáticas, segundo a
mitose: “As células filhas são geneticamente
iguais às da mãe”. Isso não significa que o DNA
das células filhas é igual ao da célula mãe, porque
ao longo do processo podem ocorrer mutações,
além disso as células filhas são geradas a partir
de uma fita molde, na qual vamos ter nossos
elementos sendo adicionados. Essa afirmativa, na
verdade, quer dizer que as células filhas têm a
mesma carga genética, ou seja, a mesma
quantidade de cromossomos. Então, se a célula
mãe tinha 46 cromossomos, as células filhas
também vão precisar ter 46 cromossomos. Para
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a célula aumente de tamanho, que ocorra a
duplicação dos seus componentes, formando 92
cromossomos, só depois disso ocorre uma
divisão, gerando duas células com a mesma
quantidade de cromossomos inicial (46).
• Vemos então, que antes de dividir a célula
precisou duplicar, porque, segundo a mitose, a
célula filha tem que ter a mesma quantidade de
cromossomo da célula mãe.
• Resumindo: O principal motivo para replicar o
DNA é a mitose. Isso ocorre na Interfase (fase
S) - síntese de DNA.
• Replicação Semi-Conservativa
Uma característica do processo de replicação é o fato
desse evento ser semi-conservativo.
Semi vem de metade. Isso significa dizer que as fitas
novas formadas ao final do processo de replicação
conservam metade do material genético anterior.
O material inicial (representado em roxo) se abre, forma
duas fitas, essas fitas são utilizadas como molde para
formar novas fitas (verde). Nas duas moléculas de DNA
novas que foram formadas vemos que tem a parte velha
(roxo) e a parte nova (verde).
Por esse motivo, não podemos dizer que as moléculas
filhas são completamente idênticas à molécula mãe.
Apenas metade se conserva, é um processo
semiconservativo.
A genética trabalha com hereditariedade e se eu sei que
o processo é semi-conservativo, conseguimos entender
sobre o processo de transmissão de genes e,
1
consequentemente, das características de um indivíduo
para o outro, dentro de uma mesma família.
• Podemos a partir disso entender a transmissão
vertical que ocorre de uma geração para outra,
de genes.
• Essa transmissão de características acontece
porque o DNA é passado de uma geração para
outra, sendo que parte leva características de
quem doou o DNA e outra parte nova.
Podemos associar com transmissão genética de
características, de gene e aspectos de um indivíduo para
outro.
• Existe um ponto específico de início?
Onde começa a replicação? No meio da molécula, nas
extremidades? na ponta? na região 5’ ou 3’?
Se pensamos em modelos procariontes, como bactérias,
temos um genoma mais simples quimicamente e
quantitativamente falando. Ele só tem um cromossomo,
que é circular. O DNA é pequeno em relação ao nosso,
por esse motivo existe apenas um ponto onde o processo
de replicação inicia.
Quando pensamos na nossa espécie, em espécies
eucarióticas, o genoma tende a ter uma complexidade
maior, quimicamente, quantitativamente e
sequencialmente falando. Principalmente na quantidade de
material genético que temos, pois enquanto temos 46 a
bactéria só tem 1.
Se só tivéssemos só um ponto de início para a nossa
replicação de DNA, a interfase (fase S), demoraria muito
tempo. Evolutivamente, conseguimos desenvolver
múltiplas origens de replicação.
No esquema representativo do nosso genoma, imagem B,
temos 4 origens de replicação.
BRUNA, DÁLETE E LARA – 4º SEMESTRE
Isso serve para facilitar, esses pontos acabam se
ampliando até que se encontram e isso gera uma
celeridade na replicação.
• São pontos ricos em adenina e timina. Como
sabemos a adenina se liga com timina e guanina
com citosina. Entre a adenina e timina temos uma
maior facilidade em quebrar as pontes de
hidrogênio, pois temos apenas 2 pontes. Já entre
guanina e citosina, temos 3 ligações de
hidrogênio, tornando mais difícil separar essas
fitas. Por esses motivos, no processo de
separação, quebramos a ligação adenina e timina.
As origens de replicação são ricas em adenina e timina
para facilitar a separação da dupla fita.
Depois vamos formando umas bolhas (bolhas de
replicação) proporcionadas pelo afastamento de uma fita
para outra. E depois vamos avançando em um processo
direcional, de um lado para o outro, até que essas bolhas
se encontrem. No final, vamos ter duas moléculas de DNA
que foram fruto de uma só.
Temos uma real obtida a partir de um microscópio
eletrônico, o qual tem um poder de aumento maior. A
partir dessa imagem conseguimos flagrar as bolhas de
replicação.
Os esquemas mostram essas bolhas aumentando, temos
algumas bolhas pequenas se abrindo, mas que ainda não
sofreram replicação.
Na imagem 2, dentro de algumas bolhas, podemos
perceber uma região avermelhada, que é uma fita nova
sendo sintetizada em cima da amarela. Construída por
ação da polimerase.
Temos regiões já replicadas, enquanto existem regiões
que ainda estão fechadas.
• As regiões fechadas ainda não foram replicadas.
2
A replicação vai avançando e as bolhas vão se
encontrando, e depois temos apenas pequenas áreas
sem replicação, mas que até o final do processo também
serão replicadas. Pois precisamos replicar todo o DNA
para produzir os 46 cromossomos.
Se tivéssemos apenas 1 ponto de início, teríamos que
sempre ir em uma única direção e depois ficar voltando
para esse ponto, deixando o processo mais lento. Como
nós temos vários pontos isso facilita, pois, a replicação
vai acontecendo e as bolhas se encontrando,
consequentemente temos uma celeridade maior nesse
evento.
• Abertura da Dupla-fita
Para a molécula se abrir e depois ser replicada,
precisamos de um repertório enzimático.
• A principal enzima envolvida nesse processo de
abertura da dupla fita é a DNA helicase.
Porque essa enzima é chamada de DNA helicase? Porque
o DNA é uma dupla fita helicoidal. São fitas contorcidas.
A helicase quando quebra as pontes de hidrogênio entre
as fitas complementares do DNA, desfaz o modelo
helicoidal, ou seja, vai linearizando as fitas de DNA,
quebrando as pontes de hidrogênio, ela funciona como um
zíper.
• O problema é que no zíper existem nós,
formados pela estrutura helicoidal da molécula de
DNA, e que acabam gerando uma tensão quando
o zíper passa. E se esse zíper continuar
forçando ele pode gerar uma ruptura na
molécula de DNA. Porque se houver uma
ruptura/lesão na molécula de DNA, a p53 vai
identificar, bloquear o ciclo celular e se a célula
não conseguir reparar, ela vai induzir a apoptose.
Como não queremos que isso aconteça, utilizamos outras
enzimas para evitar esse tipo de lesão.
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• Topoisomerases
Atuam desenrolando e relaxando a molécula de DNA.
Vamos utilizar enzimas da classe das topoisomerases, as
quais fazem giros na molécula de DNA, permitindo que a
helicase continue promovendo o rompimento das pontes
de hidrogênio, sem causar rompimento na fita (quebra
filamentosa).
A topoisomerase atua desenrolando a fita de DNA e,
consequentemente, relaxando essa molécula. Com isso,
evita a quebra filamentosa da molécula de DNA.
• Proteínas ligadoras de fita simples
Temos as proteínas ligadoras de fita simples.
Quando a helicase passa separando uma fita da outra, a
extremidade que ela abriu inicialmente vai tender a se
reaproximar. Porque, como sabemos, se uma fita tem
adenina, na fita complementar vai ter timina, e como
sabemos elas são quimicamente afins, e tendem a se unir
formando ligação de hidrogênio. Esse é um processo
natural não catalítico.
Precisamos evitar essa renaturação, porque precisamos
deixar a fita aberta para que as duas sejam utilizadas
como molde para a construção das novas moléculas.
• Para evitar que uma fita se junte a outra, vamos
às proteínas ligadoras de fita simples (SSB), que
são proteínas muito ávidas, ou seja, muito afins
de quando o DNA é aberto (ou seja, de quando o
DNA se transforma em fita simples). Elas só se
3
 ligam quando o DNA está em uma fita simples.
Representadas, na imagem, como bolinhas roxas.
Essa ligação entre as proteínas ligadoras de fita simples
e as moléculas de DNA que foram recém desnaturadas,
vai impedir o reanelamento das fitas, ou seja, que elas se
reconectem.
• DNA Polimerase
Depois que separamos as fitas podemos utilizá-las como
molde para a formação de novas fitas. A enzima
protagonista desse processo é a DNA Polimerase, ou
seja, ela constrói polímero (polimerização).
• O DNA é um polímero, formado por unidades
monoméricas, chamadas de nucleotídeos.
• Os nucleotídeos são formados por fosfato,
pentose e base nitrogenada, que pode ser
adenina, timina, guanina ou citosina.
A polimerase pega os monômeros e os unem, formando
o polímero que é o DNA.
• Cada ponto na nova fita é um nucleotídeo, é um
fosfato, pentose e base nitrogenada.
Como a polimerase une esses pontos para formar o
polímero DNA? Ela estabelece entre eles ligações
específicas chamadas de ligações fosfodiéster.
• É uma ligação entre o açúcar e o fosfato. O
açúcar de um nucleotídeo com o fosfato de um
nucleotídeo vizinho. Ela vai catalisando essa
reação até o final da cadeia.
Na imagem a polimerase está fazendo a fita vermelha,
com ligações fosfodiéster.
• A polimerase tem 4 tipos de nucleotídeos:
adenina, timina, guanina e citosina. Ela fica com
dúvidas sobre qual vai colocar, então ela olha
para cima, e se o nucleotídeo de cima for C,
existe uma regra que diz que o de baixo deve ser
G. Então ela utiliza a fita antiga como molde para
saber qual nucleotídeo deve colocar naquela
posição.
BRUNA, DÁLETE E LARA – 4º SEMESTRE
Entretanto, essa ligação estabelecida entre fitas
complementares (representada em amarelo) é feita por
ligações de hidrogênio.
A enzima polimerase 3 está na parte superior da imagem
(roxa). Ela começa a adicionar nucleotídeos na
extremidade superior. Porém, ela não adiciona os
primeiros nucleotídeos, ela não é capaz de começar do 0,
ela precisa ter sempre no início da fita superior uma
região 3’ com a hidroxila, só a partir disso ela é capaz de
dar continuidade ao processo e polimerizar a sua nova
fita até o final.
Quem vai colocar a primeira sequência de nucleotídeos, já
que não é a polimerase? É a DNA primase. Que adiciona
o primer, ou iniciador. Esse iniciador é importante para
que a polimerase inicie o processo de replicação e
polimerização do DNA.
• Enzima DNA polimerase
Essa enzima polimerase é um pouco complexa, no que diz
respeito às suas necessidades para trabalhar/funcionar.
Por isso, precisamos entender algumas das suas
características, para, em seguida, entendermos alguns
mecanismos.
Enzima que catalisa a adição de nucleotídeos à
extremidade 3’ de uma fita de DNA.
• A enzima basicamente vai fazer adição de
nucleotídeos do final de uma extremidade que ela
vai encontrar que é a extremidade 3’(linha), por
isso dizemos que o sentido da polimerização é 5’
→ 3’. Se o 5’ está do lado esquerdo e 3’ do lado
direito, a polimerase vai estender nesse sentido.
Ela pega algo que está no 3’ e segue adiante. Ela
nunca vai fazer polimerização para o lado
esquerdo, porque o que tem no 5’ não é
importante para ela. O que importa para a
polimerase está na região 3’, que é a região que
termina com o açúcar.
Precisa de um molde.
4
 • Sempre olha para a complementar para saber
qual o nucleotídeo deve colocar. Se tem adenina,
coloca timina, se tem guanina, coloca citosina.
O mecanismo de polimerização é no sentido 5’ → 3’.
• A enzima trabalha nesse sentido fazendo a
polimerização, só que esse não é o único trabalho
da enzima. Ela trabalha em sentido oposto
fazendo a revisão, revertendo erros.
Incapaz de fazer DNA do zero (precisa ter extremidade
3’OH livre).
Possui mecanismo de correção de erros no sentido 3’
→5’.
• No sentido 5-3 a enzima tem função de
exonuclease, ela vai corrigir possíveis erros.
• Enzima DNA-Polimerase Necessita de um Primer
O mecanismo de polimerização do DNA apresenta dois
problemas:
Solução:
• Uma enzima chamada primase sintetiza um
PRIMER (10 nucleotídeos) de RNA.
• Ao final do processo de replicação o primer é
removido.
DNA primase adiciona um primer ou iniciador, que é
importante para que a polimerase inicie o seu processo
de replicação/polimerização do DNA.
A seta verde na imagem, que representa o início da
molécula, não foi a polimerase que produziu. Quem fez
isso foi a primase. Ela coloca um primer de RNA, que é
um oligonucleotídeo iniciador com cerca de 10
nucleotídeos. Mas por que é um primer de DNA? Porque
a polimerase precisa da região 3’-OH livre, ela precisa
desse substrato. Por isso o último nucleotídeo tem essa
característica. Por que não poderia ser um primer de
DNA? Existem diferenças entre o açúcar de DNA e RNA:
BRUNA, DÁLETE E LARA – 4º SEMESTRE
A polimerase precisa de uma hidroxila. Quem tem a
hidroxila é a ribose, o açúcar de RNA. A desoxirribose,
que é o açúcar de DNA, perde oxigênio nessa posição.
Então a desoxirribose não funciona para o DNA
polimerase. Por isso é necessário o uso de um primer
inicializador de RNA.
Quer dizer que teremos RNA no nosso DNA? Inicialmente
sim. Isso tudo é adicionado para que a enzima use como
substrato inicial para dar seguimento ao processo de
replicação. Depois esse material acaba sendo removido
porque não podemos ter um material genético híbrido.
Ao final do processo de replicação, os primers
adicionados no início são removidos. A polimerase retira o
primer, e outra enzima faz a substituição.
• Replicação do DNA - Enzima DNA-Polimerase
2. A enzima DNA-polimerase só sintetiza fitas novas na
direção 5`à 3`, fazendo a leitura da fita molde na direção
3`à 5`;
O processo de replicação é bidirecional, já que a enzima
só trabalha no sentido 5’→ 3’. Mas como é bidirecional,
se só trabalha em um sentido? A enzima trabalha no
sentido 5’→ 3’, mas as fitas são antiparalelas, elas têm
polaridade oposta. Uma é 5’→ 3’ e a outra 3’→ 5’.
Então ela trabalha na fita de cima para a direita, e na
fita de baixo para a esquerda. Por isso o processo é
bidirecional. Portanto, as duas justificativas são
importantes:
• Enzima trabalha apenas no sentido 5’→ 3’.
• As fitas são antiparalelas.
5
Solução: O problema é solucionado por uma manobra da
enzima. A fita que deveria crescer no sentido 3'® 5' é
feita descontínuamente, em pequenos pedaços, com a
DNA polimerase trabalhando para trás a partir da
forquilha de replicação.
• Os fragmentos são posteriormente unidos
(DNA-ligase), formando uma fita contínua.
Qual fita é mais difícil de ser construída, a fita líder ou a
fita atrasada? A figa atrasada. Qual seria a justificativa
para o trabalho na fita atrasada ser mais desgastante e
intenso? A fita se abre para a direita, então a polimerase
que age nesse sentido, têm mais facilidade. Na fita de
cima a polimerase não consegue trabalhar do 0, então o
primer é adicionado no início pela primase, deixando a
região 3’-OH livre, e a polimerase atua no sentido direto
até o fim acompanhando o sentido de abertura da
molécula. Na fita de baixo, a polimerase trabalha em um
sentido contrário. A primase coloca o primer, a fita abre
um pouco, e a polimerase estende a fita para a esquerda,
a fita se abre mais um pouco, a primase adiciona outro
primer, e a polimerase continua polimerizando. A enzima
tem que ir e voltar o tempo inteiro na fita de baixo. Por
isso, essa fita é formada de forma mais lenta e
descontínua, porque ela é formada em fragmentos. Na
década de 60 foram observados pela primeira vez esses
fragmentos de okasaki, que são formados apenas na fita
descontínua do material genético, que ocorre pelo
movimento de vai e volta da DNA polimerase. Ao final do
processo, esses fragmentos são unidos através de
ligações fosfodiester, a partir da ação da DNA-ligase, que
torna a fita contínua.
Conclusões:
• O processo de replicação do DNA ocorre na
interfase do ciclo celular, mais especificamente
na fase S, onde temos a síntese.
• A replicação é semiconservativa, já que metade
do material genético da mãe é conservado para
as células filhas.
• É um processo bidirecional, fato que é justificado
pela polimerização da enzima no sentido 5’→ 3
e pelo antiparalelismo das fitas.
• Envolve várias enzimas.
BRUNA, DÁLETE E LARA – 4º SEMESTRE
Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)
Processo de amplificação e replicação do DNA que ocorre
dentro de um tubo de ensaio.
Essa técnica foi desenvolvida na década de 1980 pelo
professor Kary Mullis. Esse professor trabalha em
laboratórios fazendo pesquisas na área de diagnóstico do
HIV, e os métodos sorológicos presentes na época para
o diagnóstico dessa infecção tinham algumas limitações. A
principal delas é o fato de nós apresentarmos uma janela
imunológica. A partir do início de uma infecção, até o
desenvolvimento de uma resposta, há um tempo. Então,
se o indivíduo estava infectado, e tinha pouco tempo de
infecção, muitas vezes os exames sorológicos não
identificavam essa infecção, e os resultados acabavam
sendo falsos-negativos. Isso era um problema já que eles
acabam transmitindo a doença para as pessoas. Era uma
análise indireta, ter anticorpos para determinados
patógenos não quer dizer que o indivíduo tem aquele
patógeno. Para comprovar que se tem o patógeno, é
necessário fazer o teste direto, a partir da identificação
de alguma parte do patógeno no indivíduo, como DNA,
RNA ou alguma proteína que ele produz.
Kary Mullis começou a estudar como as replicações
ocorrem in vitro para entender o funcionamento in vivo
e amplificar regiões específicas de determinado
patógeno, no caso, do HIV. A partir disso, a metodologia
do PCR foi desenvolvida. É uma metodologia cada vez mais
utilizada para diagnóstico. Anteriormente não era muito
utilizada devido ao custo elevado, não apenas a nível de
equipamentos, mas também de mão de obra. Contudo,
atualmente há uma queda de muitas patentes e várias
empresas produzem os insumos, por isso há um
barateamento da metodologia.
É uma metodologia com especificidade e sensibilidade
muito elevada em relação às outras metodologias
diagnósticas.
6
Reação em cadeia da Polimerase:
• Método in vitro de replicação do DNA.
• Amplifica sequências específicas de DNA. Por
exemplo, PCR para identificar o vírus da hepatite
C. Ao extrair o DNA do sangue do paciente, no
sangue vêm o DNA de “tudo o que ele tiver”,
inclusive o DNA do próprio paciente. Se o foco é
o vírus da hepatite C, não faz sentido amplificar,
por exemplo, uma sequência do gene da
hemoglobina do paciente. No processo de
replicação in vivo, tudo é replicado. In vitro, é
replicado apenas o desejado, isso é feito a partir
da utilização de primers, que são os iniciadores
do processo de replicação.
• Processo realizado em vários ciclos com
diferentes temperaturas.
• Reação de PCR
Alguns reagentes são adicionados no tubo para se
realizar o PCR, dependendo do laboratório, outros
reagentes específicos para algumas reações podem ser
incrementados. Geralmente colocamos a amostra de DNA
ou RNA por último. Todos os reagentes abaixo são
adicionados:
• DNA a ser amplificado.
• Primers – Forward e Reverse. Primers são os
iniciadores, é adicionado um primer na fita de
cima e um na fita de baixo. Devem ser
adicionados nas extremidades opostas porque as
fitas são antiparalelas. Na fita superior a DNA
polimerase vai para o sentido direito, e na fita
inferior para o sentido esquerdo.
• dNTPs – Nucleotídeos. Adenina, timina, citosina e
guanina. A polimerase pega esses nucleotídeos e
faz a polimerização.
BRUNA, DÁLETE E LARA – 4º SEMESTRE
• DNA Polimerase - TAC DNA polimerase, extraída
de uma espécie de bactéria chamada thermus
aquaticus. Essas bactérias vivem em condições
extremas, principalmente em relação à
temperatura, como em vulcões. Por conta disso,
as enzimas dessas bactérias são resistentes.
Como essa técnica acontece em ciclos
diferentes de várias temperaturas, procura-se
usar enzimas mais termoestáveis.
• MgCl2 - Cloreto de magnésio é um cofator para
o funcionamento da enzima polimerase. Ou seja,
cofator é alguma molécula que não é proteica
(geralmente vitamina, metal ou íon orgânico) que
vai se associar à enzima e ativá-la. A polimerase
pode não querer polimerizar, ao adicionar o
cloreto ele estimula a ação da polimerase. O
cloreto de magnésio é um dos componentes que
tem a sua concentração mais alterada ao longo
do PCR, se a reação não funcionar, mais cloreto
pode ser adicionado no tubo para tentar ativar a
enzima. Se o contrário ocorrer e a enzima se
ativar demais, determinada quantidade de cloreto
pode ser retirada. Por isso, esse ajuste é
importante.
• H2O, RNAse e DNAse FREE - Necessário uma
água ultrapura, que passa por processo de
destilação (normalmente 3x), deionização,
filtração, esterilização com radiação. Ela precisa
ser livre de enzimas que degradam o material
genético. As enzimas que degradam o material
genético são DNase e RNAse. Se a água não for
livre dessas enzimas, pode haver uma
interferência no material genético do paciente.
• Tampão - Fundamental para manter o pH, que
interfere na ação enzimática.
Exemplo de termociclador, que é um equipamento que
tem a capacidade de variar as temperaturas em seu
interior.
7
Ele tem um bloco de posicionamento dos tubos, onde vão
ser submetidos às temperaturas. No visor é onde são
reguladas essas temperaturas.
Para cada temperatura/fase vamos ter um objetivo
dentro do processo de amplificação.
• Reação de PCR
É constituída por 3 etapas/fases.
1ª Fase – Desnaturação: separar a dupla fita. In vivo é
feita por meio da helicase. Na reação in vitro isso é feito
a partir do aumento da temperatura, que possibilita a
quebra da ponte de hidrogênio.
• Aquecimento a mais de 90ºC para a separação
da dupla fita - para construir novas moléculas a
partir dessas que foram separadas.
• Separa tanto a Fita de DNA original quanto os
produtos de amplificação.
Há uma diferença importante entre a abertura da
molécula in vivo, que é feita através de mecanismos
enzimáticos, em que a helicase vai abrindo e a girase vai
girando. In vitro, a 94° todas as pontes se desfazem
imediatamente, não é um processo gradativo como
acontece in vivo, é um processo instantâneo, já que todas
as pontes são submetidas à mesma temperatura.
Essa imagem mostra a separação da dupla fita.
Quando elevamos o termômetro para próximo de 100º,
essa elevação acaba quebrando as pontes de hidrogênio
e desnaturando a molécula de DNA, para usar as fitas
que foram separadas como molde.
2ª Fase - Anelamento dos primers: A polimerase não
pode começar do zero. Anelamento quer dizer ligação
Hibridização: junção de uma coisa com a outra. Os primers
se ligam às fitas complementares a eles.
A temperatura varia entre 40 a 70ºC conforme o par
de primers. Não vai chegar a 90°, porque não é uma
temperatura para realizar o anelamento, ligar uma
estrutura com a outra.
BRUNA, DÁLETE E LARA – 4º SEMESTRE
O primer determina a especificidade da ligação. O primer
nada mais é do que uma sequência complementar.
Nessa imagem temos uma temperatura de 60ºC e
primer se ligando em cada fita.
O que é uma sequência complementar? Vamos supor que
temos uma sequência do ZIKA vírus e queremos
amplificá-la para fazer diagnóstico molecular. Como é uma
amostra pequena, fazemos uma amplificação, para
termos vários fragmentos e consigamos identificar por
metodologias moleculares.
Como construímos um primer para a sequência do zika
vírus? Compramos. Só dizemos qual é a sequência e a
empresa vai desenhar um primer para as duas fitas
baseada na sequência que demos para ela. Essa sequência
tem que ser complementar: citosina se liga com guanina,
adenina com timina e assim sucessivamente. Todos os
nucleotídeos do primer se encaixam na sequência do vírus
(segunda sequência da imagem - primer 1 e 2). Ocorre o
anelamento nas duas pontas, com isso fica livre para a
polimerase a região 3’ com a hidroxila. A partir desse
ponto, a polimerase vai estender todo o restante até o
final da molécula (terceira sequência da imagem). A partir
disso, formamos o fragmento.
3ª Fase – Extensão: é, de fato, a fase de atividade da
polimerase.
Atividade da Taq DNA polimerase.
Duplicação do DNA.
Temperatura ótima em torno de 72ºC - a enzima
funciona a vai polimerizando a nova fita a ser formada.
8

Com o aumento da temperatura para 72°C, podemos
visualizar as enzimas atuando na abertura das fitas.
Temos um processo cíclico, com 3 etapas:
• Desnaturação. Com a abertura da dupla fita.
• Anelamento dos primers.
• Extensão dos primers. A polimerase é
responsável por fazer a extensão.
Isso é cíclico, se repete entre 25-35 vezes, pode ser
até 40 vezes.
A cada ciclo há o aumento da quantidade de cópias do
fragmento para identificar.
É como se tentássemos mostrar apenas um fio de cabelo
para alguém. Apenas um fio não é visível, mas vários fios
juntos possibilitam a visualização. O mesmo acontece na
reação PCR, em que geramos várias cópias da mesma
coisa só para identificar que ela está ali.
BRUNA, DÁLETE E LARA – 4º SEMESTRE
Com as técnicas mais novas de PCR, conseguimos
quantificar o número de cópias do fragmento.
Quando tiramos os tubos do termocirculador, apesar de
termos amplificado diversas vezes, os tubos vão estar
dessa maneira, com uma "água" dentro e não vamos
conseguir ver nada, pois são estruturas moleculares.
• Eletroforese
Existem alternativas para fazermos a identificação,
mesmo que não seja visual. Temos alternativas químicas,
através de compostos com as moléculas que queremos
mostrar a presença.
Existem corantes que são utilizados em outras técnicas
moleculares, como a eletroforese, que podem evidenciar
a presença de material genético naquela amostra.
É colocado o corante em contato com o DNA e isso gera
uma fluorescência, que pode ser vista através de luz
transultravioleta, que atravessa a matriz gelatinosa onde,
geralmente, o DNA é colocado.
Se o DNA estiver presente, vamos ver bandas (traços),
como as da imagem. A amplificação gera as bandas, o
paciente é positivo.
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Se pegássemos a amostra do paciente sem fazer o PCR,
não veríamos nada. Apesar de o paciente ter o patógeno,
o que ele tem é muito pouco para ser visualizado e
elucidado. Para ser elucidado são necessárias milhares de
cópias/amplificações.
Precisamos amplificar milhões de fezes para identificar.
Muitas vezes as reações dão errado e é preciso repetir.
Então, na imagem temos um gel de eletroforese em que
podemos identificar a amplificação.
• Tipos de PCR
Ao longo dos anos a PCR convencional apresentou
algumas limitações, que geraram novas ideias para o
melhoramento da metodologia.
• PCR convencional;
• Nested PCR: É uma metodologia onde
amplificados utilizando produtos do PCR
convencional. Então, depois de ter utilizado PCR
convencional, utilizamos o produto e continuamos
amplificando. A diferença é que no PCR pegamos
o DNA da amostra do paciente, e na Nested
pegamos do produto do PCR convencional. Isso é
feito para aumentar o sinal, que às vezes fica
fraco.
• PCR em tempo real (qPCR): É uma técnica muito
utilizada para avaliar carga viral (quantos vírus
tem, não apenas o tipo de vírus). Isso é
importante para alguns tipos de tratamento,
carga viral baixa e alta, hepatite, HIV, HTLV etc.
• RT-PCR: Utilizada para a COVID-19, pois o
coronavírus transforma a molécula de RNA em
DNA, então ele precisa fazer uma transcrição
reversa (RT). Só conseguimos fazer as RT-PCR,
depois da transcrição reversa, quando temos
uma amostra RNA. Também pode ser feito em
células nervosas, por exemplo.
• PCR Multiplex: Por exemplo, paciente com
sintoma de contágio por alguma arbovirose e foi
coletada uma amostra. A amostra era submetida
a três reações diferentes, uma para zika, uma
para chikungunya e outra para dengue. Hoje,
utiliza-se apenas uma técnica que utiliza três
pares de primers em apenas um tubo de ensaio,
um para zika, um para chikungunya e outro para
dengue.
BRUNA, DÁLETE E LARA – 4º SEMESTRE
São utilizadas cores, são utilizadas sondas
de primer que são fluorescentes e cada uma
tem uma cor, comprimento de onda e
fluorescência específicas. O equipamento que
faz a leitura tem vários filtros, então o resultado
da amplificação será lido em filtros diferentes,
por isso não temos o mascaramento ou
interação dos resultados. Tem sido utilizado para
identificar 21 vírus respiratórios.
• Aplicações do Conhecimento
Diagnóstico de infecções: Bactérias, vírus, fungos,
protozoários.
Laudo emitido no Centro de Neurociências, quando é feito
o exame por eletroforese em um paciente e dá um
resultado indefinido (nem positivo nem negativo). É feita
uma análise molecular de PCR.
É feita a reação em cadeia da polimerase para um gene
viral tax do HTLV-1. Ele é amplificado, é solicitado na
empresa os primers, que vão ser colocados em contato
com a amostra do paciente, é feito o PCR e depois vai
ser verificado por eletroforese se aquilo é positivo ou
negativo, se tem amplificação ou não.
Na imagem em azul, temos o resultado do gel de
eletroforese que foi realizado com a amostra do
paciente. Na primeira linha temos um marcador de peso
molecular, que é um controle da reação para saber o
tamanho da banda. Se é feito o PCR e a banda ficar um
pouco acima do que deveria, vemos que amplificou um
pouco acima e solicitamos a repetição da metodologia.
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É um guia para saber se aquela banda que está sendo
amplificada é a correta ou se é fruto de uma amplificação
inespecífica ou de alguma coisa que deu errado na reação.
É também uma forma de controle.
Temos o controle da reação para saber se os regentes
estão contaminados. Pode ser água, cloreto de magnésio
etc. O normal é não amplificar nada, porque os reagentes
não são amostras.
De todas as amostras acima (do paciente, controle
negativo, controle positivo e controle da reação), a única
que apresentou amplificação foi o controle positivo, ou
seja, foi a única amostra que apresentou banda.
Laudo: Não foi detectada na técnica de PCR à
amplificação do gene viral.
Quantificação de DNA ou RNA viral/célula hospedeira
No exemplo acima temos uma análise sobre cardiopatia
congênita. A metodologia utilizada foi PCR, eletroforese
e sequenciamento, para tentar identificar as mutações
pontuais, envolvendo substituições, inserções e deleções.
Conclusões
• A PCR é um processo de replicação do DNA in
vitro.
• Amplifica fragmentos específicos do DNA total.
• Ocorre em 3 etapas.
• O papel da maior parte das enzimas é substituído
por temperaturas ou reagentes da técnica.
• É aplicada para fins diagnósticos na identificação,
quantificação e análise de processos
fisiopatológicos.

Principalmente para pacientes infectados por vírus

incurável.
Publicação sobre doenças negligenciadas: Carga viral de
HTLV nos pacientes infectados e se isso tem relação com
o desenvolvimento da doença ou não.
A quantificação da carga pró-viral foi feita a partir de
um PCR em tempo real para identificar características
de flutuação da carga viral do paciente.

Diagnóstico de mutações gênicas e doenças genéticas

Muitas mutações podem ser diagnosticadas a partir de

PCR combinada com a técnica de sequenciamento.

BRUNA, DÁLETE E LARA – 4º SEMESTRE 11