BIOTECNOLOGIA DE CÉLULAS ANIMAIS

Células Estaminais

Para medicina regenerativa necessitamos no fundo de regenerar órgãos e para esta regeneração é óbvio que
nós muitas das vezes não vamos recorrer a células que já estão diferenciadas. Portanto, vamos recorrer a células
que têm capacidades únicas de fazer por si só este mecanismo regenerativo, as células estaminais, que existem em
vários tipos de formas.
De uma forma geral, em termos do nosso corpo humano, temos mais de 200 células diferentes, com
características não só funcionais, mas também
morfológicas diferentes e quase todas estas as linhagens
celulares originam de células percursoras. Estas células
percursoras são um grupo de células que têm uma
capacidade de proliferação em muito maior nível do que
as células que são diferenciadas, e denominam-se células
estaminais.
As células estaminais existem nos tecidos adultos,
em várias tipologias de tecidos adultos, mas aquelas que
são as mais imaturas, que têm maior capacidade de
proliferação e que são as que nós consideramos mais
indiferenciadas são aquelas que são provenientes dos
embriões, portanto, do blastocisto.

Logo nas primeiras fases de desenvolvimento do embrião existe um estado em que as células (até por
exemplo 4 a 8 células) apresentam características únicas de poderem dar origem a um corpo inteiro, a um individuo
como um todo. E essas células únicas que são capazes de originar um organismo por si só chamam-se células
totipotentes. Estas células totipotentes não são utilizadas de forma nenhuma por serem completamente proibidas
por lei, e também porque são muitos instáveis, uma vez que têm um número muito baixo de células, e portanto
isolar células totipotentes é muito complexo.
À medida que o embrião se vai desenvolvendo, vai dividindo, vai duplicando, até que atingimos uma fase
chamada a fase do blastocisto. O blastocisto é constituído por várias camadas, e cada uma destas camadas vai dar
origem às nossas várias tipologias de camadas. A camada mais externa que é a camada da ectoderme, a intermédia
que é a camada da mesoderme e por último a endoderme. Os vários tipos de células que nós temos diferenciadas
no nosso corpo vêm destas 3 camadas que são originárias das várias regiões que compõem o blastocisto. O
blastocisto tem a capacidade única de ser as células mais imaturas com que nós conseguimos trabalhar, e
consideradas células pluripotentes. Depois a criança nasce e depois do nascimento nós temos as células mais
imaturas do feto, as do cordão umbilical, e depois temos no fundo as células do tecido adulto. Dentro das células
do tecido adulto nos também temos células estaminais. As células quer do feto, dentro do cordão umbilical, como
as células estaminais do adulto são consideradas as células multipotentes. Ou seja, são células estaminais que
conseguem dar origem a células dos diferentes tipos de linhagem mas por si só já não conseguem-se
transdiferenciar nas diferentes camadas de diferentes tipologias das linhagens originárias de cada uma das
camadas. As células multipotentes são então as mais indiferenciadas num individuo adulto. Depois todas as células
multipotentes vão dar origem às células unipotentes que são no fundo as células que só conseguem dar origem a
elas próprias. Por exemplo, as células pancreáticas unipotentes só conseguem dar origem a células pancreáticas, e
assim. Temos poucas unipotentes e com menor capacidade de divisão que as multipotentes. As unipotentes, têm
já mais células em fase de compromisso.

As células totipotentes é como se não existissem, pois não é viável a sua utilização, não se consegue fazer
cultura celular a partir de totipotência. As primeiras que “existem” já foram utilizadas são as pluripotentes, que são
as dos embriões, que conseguem dar a origem a todas as linhagens originárias, portanto são as que conseguem
fazer mais transdiferenciação.

TRANSDIFERENCIAÇÃO: Para diferentes linhagens; capacidade única de pluripotência, apesar de algumas

multipotentes também possuírem esta plasticidade; quase sempre implica uma indução de pluripotência não
completa, mas uma imaturidade maior que as permite diferenciar em várias linhagens.

Pluripotentes são as mais indiferenciadas de todas as que se conhecem já se ter trabalhado. Depois temos
então as multipotentes, que são não só as do cordão umbilical como também as do adulto. E depois temos então
as unipotentes são aquelas células estaminais diferenciadas com menos capacidade de transdiferenciação e que
dão origem a células do próprio tipo.

No que diz respeito às células pluripotentes, são as mais imaturas que se consegue trabalhar. Uma das
grandes vantagens é que elas conseguem, não dar origem a um individuo como um todo, mas dar origem a células
das diferentes linhagens e o que se consegue fazer é retirar consoante o se quer (ou da camada externa, camada
do meio ou camada interna) e colocar em cultura e então depois fazer a diferenciação no tipo de linhagem que se
quiser. E a linhagem pode ser
hematopoética, linhagem de células
mesenquimatosas, linhagem de células
por exemplo epiteliais, neuronais…
Consoante portanto o tipo de estímulo,
nós podemos então fazer diferenciação
destas células pluripotentes num
determinado tipo de linhagem
consoante se as células são retiradas de
uma camada ou de outra.
As células multipotentes têm
diferentes imaturidades, sendo as mais
imaturas as do cordão umbilical e depois
temos as outras todas dos tecidos
adultos, que são células mais
diferenciadas.
No fundo, quando nós falamos de células estaminais, falamos de células indiferenciadas e cujo objetivo das
mesmas é formarem mais células indiferenciadas, ou seja uma das funções das células estaminais é originar mais
células indiferenciadas. E só a partir de um determinado ponto é que as células indiferenciadas, ou seja células
estaminais, sofrem um sinal e se diferenciam. Mas o objetivo fucral das células estaminais é estarem
constantemente em divisão e darem origem a mais células estaminais para que essas células possam depois receber
um estímulo, ou por causa de uma queimadura ou porque houve células de um determinado tecido que morreram
e portanto há que voltar a colonizar com células novas esse tecido. Então nesses casos quando há um estímulo há
um sinal para diferenciar, se não as células estaminais estão numa constante missão que é de se dividirem.

Apesar da maior capacidade de divisão, estas células não têm necessariamente mais possibilidades de
originarem células tumorais. Pois, não sendo células diferenciadas, não têm funções celulares de células
diferenciadas e portanto há uma série de maquinarias que têm de ser ativadas para uma célula ficar tumoral, por
indução de mutações, e não estão ativas nestes tipos de células. São células que têm um controlo muito apertado
em termos de desregulação da sua função. Mas, como é óbvio pode acontecer. Se contabilizarmos, há muito mais
casos de cancro do pulmão, ou cancro da mama por exemplo do que leucemias e linfomas. Pois estas células têm
um controlo muito mais desenvolvido e eficaz, pois são estas que têm de atuar, caso acontece qualquer coisa com
as outras células.

Na fase do blastocisto temos mais do que 200-

300 células, temos células de diferentes topologias e
portanto podemos colher e imortalizar células de
diferentes topologias, desde a mesoderme,
endoderme.. É importante quando nós vamos retirar
as células que não haja contaminação dos vários tipos
de linhagens celulares que vão dar origem à
mesoderme e assim. E estas são as células que nós
conhecemos que são mais plásticas.

A plasticidade de uma célula é a capacidade

que essa célula tem de transdiferenciar.

Por exemplo, as células oriundas da

mesoderme e que vão dar origem aos seus diferentes
sub-tipos (segunda imagem com o esquema, pg
anterior) todas as estas células na mesoderme, no
fundo, têm muita capacidade de plasticidade na fase
do blastocisto quer de originar tecido cardíaco ou
quer originar por exemplo tecido tubular ou do
musculo esquelético. São plásticas entre elas. No
entanto, quase que não há plasticidade entre as
células unipotentes, estas células só conseguem
originar células iguais a si próprias.

Hoje em dia já se descobriu como é que estes

mecanismos de células estaminais funcionam. Já
houve uma série de estudos em laboratório em
termos da expressão de genes, que genes é que são expressos e fazem a diferenciação entre estes vários tipos de
linhagens pluripotentes e multipotentes. E portanto cada vez mais se aumenta o conhecimento do tipo de genes
que estão ativos em cada uma destas linhagens celulares, mais nos conseguimos controlar estes processos.

As unipotentes são as mais diferenciadas, como tal são as que têm menos plasticidade. As do blastocisto são
as pluripotentes e que são as que têm mais indiferenciadas e portanto mais plasticidade.

As celulas estaminais têm três características muito importantes:

 Não são especializadas,
 A pluripotência é uma capacidade única que elas têm de transdiferenciação nas várias camadas de
desenvolvimento embrionário;
  Capacidade de renovação, auto-renovação, ou seja uma célula estaminal dá origem a células filhas, e vai-
se dividindo subsequentemente, e a missão delas é originar células filhas, para que depois quando há necessidade
essas células filhas puderem ser diferenciadas.

Em Portugal é proibido utilizar embriões. Existe uma política muito restrita na europa em relação à utilização
de embriões. No entanto, quando as clínicas de fertilização começaram a congelar os embriões, esses eram
congelados durante um certo período de tempo pois também perdiam viabilidade. Muitas pessoas que faziam o
congelamento dos embriões davam autorização ou não para esses embriões poderem depois ser utilizados em
investigação.
Assim, nos primeiros estudos que
foram feitos a nível das células
pluripotentes (grande parte deles nos
estados unidos e utilizando os embriões
que não eram utilizados nas clinicas de
fertilização) começou-se a estudar os
perfis de expressão genética dessas
células. Portanto, isto foi depois de 2000,
já existia a tecnologia de microarrays de
DNA, já existia as primeiras tecnologias
de sequenciação mais rápida, então
começaram a sequenciar estas células e
começaram a estudar a expressão dos
genes que estavam ativados nas células e
começaram a comparar as células
pluripotentes e as células multipotentes.
Pois, no adulto temos as multipotentes mas as células pluripotentes têm uma capacidade muito maior de
plasticidade portanto são muito mais interessantes do ponto de vista de investigação para medicina regenerativa
porque podem originar diferentes tipos de células para diferentes tipos de reparação. E então quando se
começaram a estudar e tentou-se perceber quais eram as diferenças que regiam em termos da expressão genética
das células pluripotentes e das multipotentes e começou-se a perceber que as células multipotentes têm ativadas
vias de sinalização que não estão tão ativas nas células pluripotentes e vice-versa. E começou-se a pensar que uma
das características que as células do cordão umbilical tinham é que eram muito mais imaturas que todas as outras
células dos adultos, e se portanto essas células do cordão umbilical não teriam também alguma capacidade de
plasticidade. E um dos pontos que hoje em dia ainda tem muito debate é se as células do cordão umbilical uma vez
que são células mais imaturas, mesmo dentro das multipotentes têm uma capacidade muito maior de divisão, e,
portanto, se elas não teriam alguma capacidade de serem transdiferenciadas noutra tipologia de células e isso tem
sido uma das áreas onde se tem trabalhado muito.
 Começou-se a perceber que dentro das
linhagens das células dos adultos havia também
diferentes tipos de indiferenciação. As células do
cordão umbilical eram muito imaturas e a partir
destas conseguia-se fazer grandes diferenciações.
Começaram a aparecer estudos em que se
conseguia pegar nas células do cordão umbilical dar
origem a células de diferentes linhagens celulares,
nomeadamente cardiomiócitos, e começou-se a
perguntar se todas as células que eram
consideradas neste momento multipotentes não
teriam alguma capacidade de plasticidade e mais
pluripotência. Tentou-se perceber as diferenças
entre as células do cordão umbilical, que eram as
mais imaturas relativamente, por ex, às do sistema hematopoético, que eram dentro do adulto aquelas que eram
mais indiferenciadas. E começaram a perceber que as células do cordão umbilical têm capacidades muito mais
estáveis que as células da medula óssea. Uma das capacidades de estabilidade era que se conseguiam manter no
seu estado de divisão constante enquanto que as células do sist. hematopoético eram muito mais sensíveis à
diferenciação, ou seja a ficarem unipotentes. Começou-se a associar as células do cordão umbilical com maior
interesse para transplantes. O problema é que não foi bem aceite pela comunidade porque o nr de células que se
consegue obter do cordão umbilical é muito baixo e era necessário um enriquecimento muito grande dessas células.
Quando nós temos de fazer transplante de por ex medula precisamos de uma grande quantidade de células para o
fazer. E apesar destas células serem mais imaturas e terem mais capacidade de duplicar e de dividirem muitas vezes
não é suficiente para se fazer transplante para adultos e esse é ainda hoje em dia um dos problemas.
Só se guardam as células por 25 anos por causa do tempo de vida das células e porque aos 25 anos já somos
adultos e o nr de células é limitado e uma coisa é transplantar um certo número de células para uma criança e outra
coisa é para um adulto. Não se consegue verdadeiramente utilizar células do cordão umbilical para fazer transplante
para um adulto.

As células estaminais atualmente são muito utilizadas para doenças que afetem o SNC e o SNP, como
distrofias musculares, acidentes que interrompam a coluna vertebral e que as pessoas ficam paraplégicas e
conseguem assim readquirir alguma mobilidade, ou passar de tetraplégico para paraplégicos (raro). Tem sido uma
área com bastante sucesso, mais do que por exemplo na medicina regenerativa cardíaca, mesmo não sendo 100%
e depender bastante do tipo de lesão.

Uma das áreas muito importantes tem sido tentar perceber qual a diferença entre estas células, porque
estamos muito limitados dentro das linhagens celulares do adulto de células estaminais, temos uma grande
limitação na quantidade que um adulto tem.

A utilização do cordão umbilical é geralmente para sistemas de transplante autólogos. E à partida se não
houver nenhuma transformação das nossas células é 100% compatível, mas muitas vezes as células devido a
situação ambientais sofrem alterações e podem não ser aceites, mas raramente acontece. Ainda pode não resultar
não por rejeição, mas porque o sistema imunitário não consegue responder mesmo e haver uma capacidade
regenerativa, pois os indivíduos com imunidade deprimida acabam por não ter uma resposta aceitante.
 Mesmo dentro das células estaminais da
medula óssea nos temos diferentes linhagens
celulares, diferenciadas pelos recetores que
expressam em função do grau de maturidade da
própria célula estaminal. Portanto, nós temos as
células primárias do sistema hematopoético
que são as mais indiferenciadas de todas e são
em muito menor número, e depois temos um
conjunto a que chamamos células progenitoras.
As células progenitoras já não são tão
indiferenciadas, já têm recetores diferentes e
têm já algum commitment, ou seja, já vão dar
origem a determinado tipo de células
progenitoras. Por exemplo, as progenitoras
iniciais vão dar origem a dois tipos de
progenitoras de duas linhagens, a linfoide e a
mieloide. As progenitoras da mieloide e da
linfoide, ou seja, as a seguir já não conseguem vir para trás. Estas são distinguidas pelos recetores e por citometria
de fluxo (temos de ter o cell sorter) vamos recolher apenas a linhagem que nos interessa. Podemos querer uma
linhagem de células primárias que dá origem a todas as linhagens ou de por ex progenitoras mieloides.

É mais fácil regenerar o sistema hematopoético de uma criança que um adulto porque têm uma capacidade
produtora muito menor que um adulto que tem toda a capacidade regenerativa implementada. Resulta mais
facilmente numa criança, porque precisa de um nr de células mais pequeno, enquanto que num adulto o nr de
células transplantado é mínimo face à população que já existe no adulto.

Para além das células do sistema hematopoético

temos também as células do sistema estromal, que
fazem parte da nossa medula estromal, e que são
células que têm características um bocadinho
diferentes das outras células do restante sistema
hematopoético, que estão mais no nosso sangue. São
estas que vão estar associadas a toda a medicina
regenerativa, associada por ex aos adipócitos, ao tecido
conetivo a toda a parte dos condrocitos e cartilagem.
Portanto, é a medula estromal que no fundo vai estar
associada a esta capacidade regenerativa
nomeadamente a nível do osso e a nível da cartilagem.

As células da lâmina basal da pele são células

estaminais muito utilizadas em casos de trauma de
queimaduras de 1º a 3º e que estão envolvidas na
reparação. Estas células que estão muito perto da
lâmina basal são as células que têm maior capacidade
proliferativa e que são elas que tem capacidade de
substituir as células que morrem da nossa pele. Se a
queimadura for muito profunda, tem de ser feito um
transplante, porque estas células estão em nr muito
baixo (temos muitas poucas células estaminais no
nosso corpo).
 Células utilizadas para transplantes a nível da coluna e a nível ósseo são retiradas da parte superior do nariz,
com uma capacidade regenerativa grande e de grande plasticidade, portanto aplicadas em diferenciação de
diferentes linhagens celulares.

Dentro das células do SN, elas podem

originar células do sistema nervoso, mas a
plasticidade destas células já não é tao
grande apesar de serem células estaminais,
podem-se diferenciar em astrocitos,
oligodendrocitos, e neurónios. Depois
dentro destas células quando e tornam
unipotentes algumas perdem capacidade de
divisão.

Na comparação entre pluri e

multipotentes, identificaram uma diferente
expressão de fatores, que estavam
expressos muito mais numas que noutras. E
decidiram pegar nesses fatores de
transcrição e colocar noutra célula, revertendo células unipotentes, ou até diferenciadas, por ex um fibroblasto, a
um estado de pluripotência. Conseguia-se transdiferencia-los para células mais imaturas dando lhes os fatores
responsáveis pela pluripotência.
Um conjunto de fatores de transcrição que estão muito ativos nas pluripotentes, estão menos da
multipotentes e menos ainda nas unipotentes, foram descobertos pelo Yamanaka e são os fatores de Yamanka 
os reguladores da pluripotencia!

Começaram a estudar não só os

genes envolvidos na capacidade de
passagem de unipotencia a pluri, mas
também tentar nas várias fases em que
as células vão passando de uma célula
inicial progenitora para uma célula
progenitora com capacidade de
commitment e perceber que fatores de
transcrição estavam envolvidos em cada
uma destas fases. Começou-se a
conseguir controlar a expressão de
genes específicos para controlar estas
fases e diferencia-las em vários tipos de
linhagens distintas. Isto tem sido um
sistema utilizado para por ex tentar a
partir de uma célula do sist
hematopoético original originar
cardiomiócitos ou capilares. Cada vez
mais se conhece os mecanismos celulares envolvidos nestes processos.

PARA QUE SERVE O COMPROMISSO? Única e exclusivamente para diferenciação.

 O objetivo primário das células estaminais é dar a origem a mais células estaminais, mas de repente uma
célula filha tem um estímulo (que pode ser um dano, ou até envelhecimento e morte) para se diferenciar. Este
estímulo é o commitment, um compromisso. O compromisso é para se dividirem e diferenciar.
As celulas estaminais têm uma função de auto renovação.
A proliferação celular envolve para além de divisão migração.
 Como é que o compromisso é ativado? Diferentes recetores a ser expressos e diferentes vias de sinalização
estão a ser expressas.

Uma das vias mais importantes para manter a divisão das células estaminais (manter o estado de auto
renovação) é a via canónica do WNT, que é controlada por uns recetores que estão na membrana. O principal
recetor associado a esta via é o frizzle e que vai ativar uma serie de vias de sinalização intracelular (cascata
intracelular) que vão ativar a beta-catenina. Esta é uma das principais moléculas reguladoras da via WNT, que para
que a via esteja ativa tem de fazer uma translocação nuclear, ligar-se ao TCF e mediante esta ligação vai ativar a
expressão de uma série de genes alvo, quase todos eles muitas vezes oncogenes que vão estar associados à
proliferação e manutenção do estado de indiferenciação. E portanto consoante as nossas células estaminais têm
estas vias ativadas assim estão a dividirem-se só ou se são ativadas outras vias começam uma fase de diferenciação.
No fundo tudo isto tem a ver com um compromisso de que vias vão ser ativadas.
Temos várias vias que consoante um estímulo que lhe damos nomeadamente do sist endócrino, podemos
ativar vias diferentes, que pode levar a commitments diferentes.

Com o estudo das células multipotentes versus pluripotentes percebeu-se que havia um conjunto de
fatores de transcrição que mantinham o estado de pluripotência. Ou seja, num estado de pluripotência,
nomeadamente blastocitos este fatores estão altamente ativados, apesar de nas células multipotentes também
terem alguma ativação. Estes fatores de transcrição, que são os Oct34, Sox2, Nanog, regulam uma série de genes
alvo no núcleo das células e ativam uma série de genes, nomeadamente oncogenes como o b-myb e o c-myc. O
que se verificou quando se começou os estudos das células pluripotentes e multipotentes é que é importante, não
só a ativação a via WNT, mas também um conjunto de fatores de transcrição, críticos para a manutenção do estado
de pluripotência. Conhecendo estes fatores de transcrição conseguíamos de uma maneira geral controlar o estado
de pluripotência, e esta foi uma forma de se conseguir de forma artificial induzir pluripotência nas células que não
o eram.
 Sabe-se hoje em dia, desde 2008, que
existem outras alterações nas células que
permitem manter este estado de pluripotência ou
de multipotência. Alguns desses fatores são
fatores epigenéticos, e se compararmos células
estaminais embrionárias e não estaminais,
conseguimos ver que existem alterações grandes a
nível epigenético, ou seja, alterações a nível de
metilação, de acetilação das histonas, mantendo a
conformação do DNA mais ou menos exposto,
consoante a necessidade da célula de transcrever
mais ou menos. No fundo, a epigenética é que algo
que pode também ser modificado de forma a permitir este estado de células estaminais.
 No que diz respeito à terapia celular e à utilização de células pluripotentes ou multipotentes para a medicina
regenerativa, a FDA promoveu uma definição que diz que é a prevenção, tratamento ou cura de doenças e/ou
alterações que sejam induzidas, com recurso à administração autologa (do próprio), alogénica ou xenogenica (entre
espécies diferentes) de células que tenham sido manipuladas ou alteradas ex vivo.

Esta definição advém do objetivo final que é reparar ou substituir tecidos ou órgão que tenham sido
danificados.

Tipo de células utilizadas para toda a

parte de medicina regenerativa:
 Embrionárias - As que nos mais
gostaríamos, que são as mais
indiferenciadas.
 Dentro das células adultas:
o Do cordão umbilical
(mais imaturas)
o Do líquido amniótico
o E as que estão em
quase todos os nossos
órgãos.
As últimas três são as células mais
comumente utilizadas, principalmente as do
cordão umbilical por serem as mais imaturas.
No liquido amniótico existem poucas células a utilizar.

Tudo isto começou com o primeiro

transplante alogénico de um doente com
leucemia. E estes transplantes alogénicos têm
sido a forma de terapia dos linfomas e leucemias
de um grande número de indivíduos. No
entanto, nos transplantes alogénicos há um
grande problema associado à incompatibilidade
dos sistemas de histocompatibilidade major e
minor e muitas das vezes verifica-se o
aparecimento de uma doença bastante
complexa que é a doença da rejeição ao
transplante chama-se graft-versus-host. Esta
doença implica uma rejeição completamente
por parte das células do hospedeiro daquelas
outras células. Portanto, começou-se a
perceber que o bebé ao nascer tinha células no
cordão umbilical com mais indiferenciação
ainda do que as células indiferenciadas do
adulto, e que essas poderiam ser congeladas, armazenadas, cultivas de maneira a que um dia mais tarde essa
criança fosse a beneficiar de transplantes autólogos. Foi no início dos anos 2000 que se começou então a retirar as
células do cordão umbilical, congela-las e depois são levadas para os laboratórios, postas em cultura até se atingir
uma densidade celular boa destas células e são novamente congeladas durante um período máximo de 25 anos. E
portanto começou-se a utilizar estas células que, sendo do próprio individuo, evita-se o desenvolvimento da
rejeição.
 Quando se começou a tentar
realizar este tipo de transplantes
autólogos, começou-se a perceber que
muitas das vezes não se conseguia fazer
boas transplantações com recurso a
estes.
Se cada vez mais se conhece o
estado de pluripotência, como é que as
ESC (Embryonary Stem Cells) conseguem
manter este estado de pluripotência
(apesar de serem na verdade
multipotentes) e a conhecer todos os
fatores de transcrição que permitem este
estado, porque não tentar pegar numa
célula diferenciada, como por ex um
fibroblasto (que dentro das nossas células
diferenciadas são aquelas que têm uma taxa de crescimento maior e que segregam uma série de fatores de
crescimento importantes, bem como fáceis de obter) e reverte-lo a um estado de pluripotência? Pensaram que se
estes fatores de transcrição são importantes para a pluripotência e não são expressos nestas células diferenciadas,
então se introduzir estes fatores de transcrição nos fibroblastos pode ser que passem a um estado de pluripotência.
Começou-se então a realizar este processo e a esta tecnologia chama-se induced pluripotent stem cell technology
e estas celulas produzidas artificialmente chamam-se iPS. Esta indução de expressão pode ser feita quimicamente
com compostos que aumentam a expressão destes fatores ou pode ser feita artificialmente clonando estes genes
em plasmídeos ou em vetores virais.
A primeira coisa que quiseram ver era
comparar em termos de expressão e em termos
de marcadores como é que se correlacionavam
com as ESC. Têm o mesmo problema que as ESC,
a possibilidade de formar teratomas, que é uma
massa de crescimento com linhagens diferentes
(celulas originarias de camadas diferentes). E em
tal como todas as celulas há a possibilidade de
diferenciar em cada uma das 3 linhagens
diferentes.

Porque gerar iPS artificialmente e não

utilizar as ESC? Porque em termos de leis dos países
foi logo muito limitada a utilização de ESC, porque
se começou a pensar que se nós conseguíssemos
aceder a ESCs conseguíamos aceder a clonagem
reprodutiva. A clonagem reprodutiva é a principal
causa de ser uma prática tao regulamentada a nível
de utilização de células embrionárias estaminais.
Esta técnica é condenada a menos que seja
fertilização in vitro. O grande objetivo é a clonagem
terapêutica.
Cada camada diferente do blastocistos é
cuidadosamente retirada, tendo em atenção as
contaminações. São de seguida postas em cultura,
quer seja em cultura simples quer seja em
fermentadores, onde são enriquecidas e depois
poderão ser armazenadas.
A utilização destas células provem
sempre de embriões congelados que não foram
utilizados e que, em vez de se deitarem fora,
muitos países permitiram a utilização, via
consentimento informado dos dadores. E toda
a investigação que foi feita até hoje em células
estaminais vem destas células estaminais
embrionárias.

A clonagem terapêutica visa a utilização de blastocistos, que são postos em cultura e depois então é
induzida sua diferenciação num determinado tipo de linhagem celular, consoante o tipo de células das várias
camadas que tenham sido retiradas, de interesse para a medicina regenerativa.

Uma das técnicas que está muito associada à clonagem terapêutica denomina-se transferência nuclear de
células somáticas SCNT. Nesta técnica, retiram-se núcleos de células somáticas de um dador (normalmente com
algum tipo de doença) e injetam-se em óvulos receptores cujos núcleos foram também retirados. Esta fusão é
mediada pela utilização de estímulos elétricos de forma a ocorrer uma ativação. Esta célula vai começar a dividir e
originar o blastocisto. Esses blastocistos são depois diferenciados em células específicas.

A indução de um estado de pluripotência

pode ser feito de duas maneiras:
- Clonagem de fatores de transcrição ou
genes alvo em vetores. Estes vetores podem
estar integrados ou não no genoma do
hospedeiro.
- Utilização de químicos que vão ativar a
transcrição de genes (indução dos seus
promotores) que estão envolvidos na
reversão para um estado de pluripotência.

Se forem vetores com integração nuclear já

sabemos que a transfecção vai ser estável,
enquanto que se forem vetores sem
integração nuclear a transfecção não é
estável, é transiente. Nos vetores que se
integrem no genoma do hospedeiro, temo-
nos de preocupar onde no genoma é que essa integração é feita, sendo propicio em regiões intergenicas de forma
a que não haja efeitos fenotípicos dessa integração, um dos problemas associados à integração aleatória do
genoma. Em termos práticos a utilização de químicos é uma técnica muito mais saudável de se realizar, em que se
recorre a moléculas que não tenham toxidade para as células. Depois de induzir a formação de IPS’s, estas poderão
ser diferenciadas em múltiplos tipos de linhagens celulares.
Quando se conseguiu
reverter as células a um estado de
pluripotência, o desafio foi então
perceber como é que se conseguia
diferenciar a um determinado tipo
de linhagem.
Nos blastocistos temos
varias camadas e cada uma está
associada a diferentes tipos de
linhagens. Assim, temos de saber
exatamente que tipo de estímulos é
que temos de dar às células para
que, mesmo dentro de cada
linhagem, elas se diferenciem no tipo
de célula de interesse. Então, um dos
objetivos foi conhecer os fatores de
transcrição que regulam esta
diferenciação celular, evitando a
formação dos teratomas.
Na década de 2000 foram
realizados bastantes estudos, em
que se pegaram em fibroblastos, reverteu-se a um estado de pluripotência e depois adicionou-se uma serie de
fatores específicos para diferenciar estas células.
 Houve duas áreas onde as IP’s tiveram bastante impacto. A primeira foi a área cardiovascular, sendo o
coração um orgão que é afetado com doenças com alguma regularidade em grande parte da população,
nomeadamente isquemia cardíaca e morte das células do miocárdio, com incapacidade de regeneração. Outra área
também muito importante, tendo em conta que são células que não conseguem dividir-se, é a área neurológica.

O que se faz é tentar introduzir

estas células. Na imagem (canto inf
esquerdo) temos uma série de marcadores
celulares, entre os quais temos genes que
estão associados, por exemplo, à
manutenção do estado de pluripotência
nas ESC, como o Oct4, e à medida que vão
sendo diferenciados, deixa de haver cada
vez menos expressão destes fatores de
pluripotência. Neste caso, utilizaram ESC às
quais foram adicionados fatores de
diferenciação, associados por ex às
miosinas e às troponinas, e observaram
que com a adicao desses fatores, as celulas
começavam a expressa-los e a diferenciar-
se em cardiomiócitos.
Isto é uma prática bastante
importante para medicina regenerativa devido ao facto do tecido cardíaco, quando sofre algum dano que provoque
morte das células, não possuir a capacidade de reparar a lesão que se tenha formado em detrimento da morte
celular.
 Estes autores, induziram iPS que posteriormente transdiferenciaram em cardiomiócitos. Estas no entanto
tinham de ser separadas das que não se tinham diferenciado. Sabendo que nos cardiomiócitos são mais expressas
mitocôndrias, realizou-se uma separação por citometria de fluxo com separação de celulas. As que produziam mais
ATP, ou seja, que tinham uma maior atividade mitocondrial eram separadas das restantes.
Com este processo, fizeram, no fundo, um enriquecimento da população de células que tinham sido
diferenciadas, obtendo os cardiomiócitos purificados.
A utilização de excertos para regeneração do tecido cardíaco ainda só é possível em pequena escala.
 Teve de se conhecer de uma forma muito clara os fatores de transcrição para esta diferenciação. Assim
tiveram de estudar cado um destes passos esquematizados (no fim da imagem acima). Neste esquema temos uma
iPS, uma célula pluripotentes a expressar os fatores de pluripotência, à qual foi começando a ser induzida
diferenciação. Todos estes passos de diferenciação estão dependentes de uma série de fatores de transcrição e de
ativação de uma serie de vias de sinalização, e são exatamente estas vias de sinalização que tiveram de ser
estudadas, passo a passo, de forma a se puder obter no fim apenas e só cardiomiócitos completamente
diferenciados.

Algumas aplicações da
utilização de cardiomiócitos é em
doentes que tenham
aterosclerose, enfartes do
miocárdio, substituição de
válvulas… Quando há morte de
cardiomiócitos é necessário uma
intervenção muito drástica.
No entanto, quando
começaram a implantar estes
cardiomiócitos no coração,
reparam que estes não tinham
sido implantados no coração,
apesar de terem sido injetados
no local necessário, e teriam ido
parar a outros locais no corpo
humano. Isto aconteceu devido
ao facto de as células não terem consigo estruturar, por falta
de uma matriz tridimensional capaz de fazer essa estrutura.
Foi ai que começou a perceber-se a falta da matriz.

O nosso objetivo era ter células isoladas de um individuo com o estado de pluripotência, induzida a sua
diferenciação, colocadas em cultura e por último numa determinada matriz. E estas matrizes permitem colocar as
células numa estrutura tridimensional, crescendo em termos de tecido que possa ser transplantada para o
individuo.
 Existem diversos materiais que podem ser utilizados, desde fibras ou fibrogeis, a matrizes mais ou menos
porosas, para que adsorvam à superfície. Temos de determinar o tipo de componentes físicos, químicos e biológicos
para que obtenhamos a melhor matriz para encapsular (dentro ou à superfície) determinados tipos de células.
Grande parte dos estudos que têm sido feitos são com o intuito de tentar perceber que tipos de estruturas
tridimensionais conseguimos fazer em laboratório para garantir que essas estruturas tridimensionais tenham sido
implantadas no organismo.
 No caso de estudo de matrizes acima é para substituição de pele, e são as fibras mais comuns que são
utilizadas. Os fibroblastos dérmicos são colocados sobre estas fibras, onde são deixados a crescer, juntamente com
células estaminais, para que se induzam o crescimento dos fibroblastos. A presença de fibroblatos é o estimulo
para a diferenciação das celulas estaminais. Estas matrizes são biodegradáveis, e portanto são colocadas no corpo.
Também é feita a expansão ex vivo de celulas da medula estromal.

A regeneração de tecidos
envolve muitas áreas. É necessário o
estudo dos materiais, como que tipo
de materiais podem ser mais ou
menos solúveis ou compatíveis, em
que já é necessário um biólogo para
estudar a compatibilidade das
células e depois também é
necessário caracterizar estes
materiais físicos e químicos.

Esta área da medicina regenerativa tem crescido bastante e começado a entrar na indústria. Já existindo
neste momento indústrias muito nesta área da medicina regenerativa, cujo grande objetivo é fazer estas culturas
em larga escala, recorrendo quase sempre a fermentadores.